过表达MORC2通过下调p53含量抑制L02肝细胞脂肪变性

目的 研究过表达MORC2对人L02肝细胞脂肪变性程度的影响及可能机制.方法 利用慢病毒转染技术在L02肝细胞中过表达MORC2,qRT-PCR及Western blot鉴定过表达效果后,对L02肝细胞进行脂肪变性诱导,测定细胞甘油三酯(triglyceride,TG)含量并比较过表达前后L02肝细胞的脂肪蓄积程度;利用芯片技术对过表达MORC2前后的基因表达谱进行检测与Pathway分析,筛选过表达MORC2时发生变化的通路并选择对脂代谢有调控作用的p53进行研究;Western blot检测在L02肝细胞脂肪变性诱导时过表达MORC2对p53蛋白含量的影响;在过表达MORC2的基础上对L02肝细胞过表达p53,qRT-PCR及Western blot鉴定p53过表达效果后,通过TG测定观察过表达p53对过表达MORC2改变的L02肝细胞脂肪蓄积程度产生的影响.结果 qRT-PCR及Western blot证明过表达MORC2成功;过表达MORC2的L02肝细胞在脂肪变性诱导后TG含量较MORC2正常表达的L02肝细胞明显降低(P＜0.01);基因表达谱芯片及Pathway分析显示脂代谢调控相关的p53通路在过表达MORC2后发生变化;Western blot显示过表达MORC2后,L02肝细胞中p53蛋白水平在脂肪变性诱导前后均降低;qRT-PCR及Western blot验证p53过表达成功,且过表达p53可部分解除MORC2对L02肝细胞脂肪变性的缓解作用.结论 过表达MORC2可通过下调p53从而缓解肝细胞脂肪变性.     

原代肝细胞脂肪变性细胞模型的构建

目的 为非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)发病机制和防治研究提供可靠的原代肝细胞脂肪变性细胞模型。方法 采用Seglen两步灌流法及其改良方法分离获取小鼠原代肝细胞,体外培养48 h后,给予不同浓度的游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)混合物(油酸∶棕榈酸=2∶1)诱导24 h,采用油红O染色,观察肝细胞内脂滴沉积情况,全自动生化分析仪测定细胞内三酰甘油(TG)含量。结果 与对照组相比,模型组肝细胞内出现红色脂滴沉积,且与加入的FFA混合物浓度呈剂量依赖性;模型组肝细胞内TG含量明显高于对照组(P<0.05),且随着加入的FFA浓度升高而增加,提示肝细胞内脂质沉积随着加入的FFA浓度升高而增加。结论 成功构建了原代肝细胞脂肪变性细胞模型,为NAFLD的研究提供了可靠的细胞模型。     

内质网应激在软脂酸钠诱导的脂肪变性L02肝细胞凋亡中的作用

目的 观察内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）蛋白在软脂酸钠诱导的脂肪变性L02肝细胞凋亡过程中的改变,探讨ERS与脂变肝细胞凋亡的关系。方法用软脂酸钠（饱和脂肪酸）诱导建立L02肝细胞脂肪变性模型。将细胞分为正常对照组和实验组(软脂酸钠72 μmol/L)。MTT法筛选软脂酸...     

酮康唑致人L02肝细胞毒性差异蛋白鉴定

目的 观察酮康唑(ketoconazole,KTZ)对人L02肝细胞的毒性效应,鉴定细胞毒性差异蛋白。方法 KTZ浓度为30、50、80和100mg/L,与人L02肝细胞共培养2、4、6和8h,采用CCK-8法和流式细胞术检测KTZ对细胞增殖和胞内活性氧的影响;提取产生明显毒性的实验组细胞和对照组细胞的胞内蛋白质,进行双向电泳,并用质谱鉴定差异性蛋白。结果 细胞增殖抑制率呈剂量依赖性显著性升高,胞内活性氧呈剂量依赖性显著性升高。共鉴定出7种有功能的细胞内差异性蛋白。结论 鉴定出的差异性蛋白为KTZ毒性机制研究提供新的参考。     

体外不同条件诱导L02肝细胞损伤模型的构建

目的 探讨不同条件下诱导L02肝细胞损伤的最佳条件,建立稳定可靠的体外肝细胞损伤模型。方法将常规培养的L02细胞分别设置为正常对照组、过氧化氢(H₂O₂)组、对乙酰氨基酚(APAP)组和乙醇组;H₂O₂组用不同浓度梯度(300、400、500和600 mol/L)的H₂O₂分别诱导6、12和16 h;APAP组以不同浓度梯度(1、10、20和40 mmol/L)分别诱导3和6 h;乙醇组加入不同浓度梯度(0.5%、1%、1.5%和2%)的乙醇分别孵育6和24 h;在上述损伤条件下用细胞计数试剂盒(CCK)-8检测各组L02细胞的存活率。在确定的最佳损伤条件下,建立不同肝损伤模型,检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)等损伤指标。结果 除300 mol/L H₂O₂诱导12 h以外,其余不同浓度H₂O₂组的...     

非酒精性脂肪性肝病相关肝细胞癌的研究进展

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是全球范围内最常见的慢性肝脏疾病。随着人们生活方式和饮食结构的改变,肝细胞癌（HCC）的流行病学特征也发生了变化,目前,NAFLD逐渐成为HCC的主要病因;另外,NAFLD相关HCC患者通常年龄较大,并伴有多种并发症（糖尿病、超重/肥胖、血脂异常和心脑血管疾病）,因此对NAFLD患者进行早期干预,同时筛查并监测高危人群显得尤为重要。本文就NAFLD相关HCC的流行病学、发病机制、治疗和预防等方面进行系统综述,旨在增加临床医生对NAFLD相关HCC的了解,从而为早期监测和管理高危患者提供依据。     

LRG1在非酒精性脂肪性肝病小鼠及细胞模型中的表达

目的：研究LRG1在非酒精性脂肪性肝病中的表达情况。方法：建立高脂饮食、蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食及ob/ob小鼠三种NAFLD小鼠模型,提取肝脏RNA,RT-PCR检测LRG1表达水平。采用棕榈酸-油酸刺激HepG2细胞诱导脂肪变性模型,RT-PCR检测其LRG1表达水平。结果：与对照组比较,三种NAFLD小鼠模型肝脏中LRG1表达水平均降低,棕榈酸-油酸刺激HepG2细胞12 h或24 h后,细胞模型中LRG1表达水平也都降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：LRG1参与NAFLD的发生发展,或可成为无创诊断NAFLD的特异性标记物。     

肝细胞脂肪变性影响巨噬细胞炎症反应加速动脉粥样硬化形成

目的:基于代谢组学和网络药理学探讨非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)与动脉粥样硬化共病的发病机制。方法:野生型C57BL/6J小鼠和ApoE^-/-小鼠各6只,分别给予普通饮食和高脂饮食16周,构建NAFLD和动脉粥样硬化共病模型,取血清标本进行非靶向代谢组学检测,鉴定差异代谢产物。运用网络药理学探讨差异代谢物对动脉粥样硬化和NAFLD的可能作用机制,并采用小鼠NCTC1469细胞和RAW264.7细胞构建体外共病模型,油红O染色检测细胞脂质积蓄情况,细胞计数试剂盒检测细胞活性,透射电镜和JC-1染色检测线粒体形态和功能,并验证共病模型的可能病理机制。结果:代谢组学分析共鉴定出85种共病差异代谢产物。将前二十种差异代谢物进行网络药理学分析,结果显示差异代谢产物影响动脉粥样硬化和NAFLD的核心靶点为STAT3、EGFR、MAPK14、PPARG、NFKB1、PTGS2、ESR1、PPARA、PTPN1、SCD;基因组百科全书富集分析显示前十位的信号通路为PPAR信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、酒精性肝病、催乳素信号通路、胰岛素抵抗、TNF信号通路、...     

Sigma-1受体在非酒精性脂肪性肝病中的表达及意义

目的明确Sigma-1受体在非酒精性脂肪性肝病中的表达变化及意义。方法应用软脂酸诱导HepG2细胞脂肪变建立非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)体外模型,并按0、2、4、8、12 h时相点收获细胞,利用尼罗红(nile red)染色检测细胞脂肪变程度,通过Real-time PCR及Western blot检测Sigma-1受体(Sigma-1 recep-tor,Sigma-1R)及内质网应激标志蛋白葡糖调节蛋白78(glucose regulating protein,GRP78)的表达,二甲基噻唑二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]检测细胞脂肪变过程中细胞活性的变化。结果 HepG2细胞经脂肪酸诱导后发生了脂肪变,脂肪变程度随时间点的延长而加重,细胞的平均脂变面积在12 h组(435.14±39.87)较0 h组明显升高(P<0.01);8、12 h组GRP78 mRNA的相对表达量[(2.35±0.51),(8.71±1.20)]较0 h组明显升高(P<0.05),而Sigma-1R mRNA相对表达量在2 h组(0.19±0.02)即开始出现明显下降(P<0.05);在蛋白水平上,GRP78的表达在8、12 h组[(25.59±0.51),(28.43±1.20)]较0 h组明显上调,Sigma-1R在8、12 h组[(15.92±0.42),(10.73±0.63)]较0 h组明显下调(P<0.05);MTT检测提示细胞在脂肪变过程中细胞活性逐渐下降,12 h组细胞活性[(59.86±4.47)%]相对0 h组明显下降(P<0.05)。结论 Sigma-1R的低表达可能诱发了NAFLD过程中的内质网应激,进而导致肝细胞的损伤。     

SREBP-1c在大鼠非酒精性脂肪性肝病中的表达及意义

目的观察高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliver disease,NAFLD)过程中肝组织固醇调节元件结合蛋白-1C(sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)的表达,探讨SREBP-1c与NAFLD形成的关系.方法建立大鼠高脂饮食NAFLD模型,用免疫组织化学染色与半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)动态观察NAFLD肝组织中SREBP-1c表达变化,并测定受其调控的脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)酶活性变化.结果与正常对照组相比,NAFLD组大鼠血清FFA、TG水平,肝组织SREBP-1c蛋白表达,FAS酶活性在第2周时变化无显著差异(P＞0.05),而从第4周开始显著增加(P<.05),第12周时达高峰(P<.01);而SREBP-1c mRNA于2周时开始增加(P<.05),12周达高峰(P<.01).结论高脂饮食引起SREBP-1c表达增强,最初是一种适应性反应,随着SREBP-1c表达进一步增强,导致脂肪酸代谢失衡,甘油三酯(triglyceride,TG)合成增多,与NAFLD的发生关系密切.     

PEP-1介导血红素加氧酶-1导入肝细胞的实验研究

目的采用体外培养的L02肝细胞株,研究PEP-1肽介导血红素加氧酶-1（PEP-1-HO-1）穿透肝细胞的能力。方法实验分为PEP-1-HO-1组和HO-1组,用基因工程的方法制备并纯化PEP-1-HO-1融合蛋白,将纯化的目的蛋白及HO-1蛋白加入培养的L02肝细胞,通过免疫荧光及western blot来分析其转导能力。结果经测序分析证实,原核表达质粒pET15b-PEP-1-HO-1重组成功。SDS-PAGE及western blot结果表明,PEP-1-HO-1在Rosetta（DE3）pLysS菌中获得了高效表达,经Ni2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-HO-1,将其加入到体外培养的L02肝细胞培养基中,发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内,并能持续稳定表达48h,免疫组化显示其主要分布于胞质和胞核中。结论 PEP-1-HO-1融合蛋白能高效地转导入培养肝细胞,为进一步研究肝细胞氧化应激损伤防治的动物模型实验提供了新的途径。     

油酸诱导培养肝细胞脂肪变性模型的建立

目的 以人正常肝细胞株L-02 为实验材料,采用油酸诱导建立培养肝细胞脂肪变性模型.方法 将人肝细胞株L-02进行细胞培养,加入不同浓度的油酸,采用MTT法确定油酸诱导肝细胞脂肪变的最佳浓度,以油红O染色观察细胞内脂滴形成状况,并检测细胞内TG的含量及上清中的ALT、AST的水平.结果 用含20μg/ml油酸的1640培养基培养L-02肝细胞72h,光镜及电镜下见肝细胞内有典型的脂滴形成,肝细胞内TG含量显著升高; ALT及AST较对照组升高,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 成功建立了油酸诱导培养肝细胞脂肪变性的模型.     

SCAP在培养肝细胞脂肪变性模型中的表达及意义

目的 探讨油酸诱导的脂肪变性肝细胞模型固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(srebp cleavage activating protein, SCAP)的表达及意义.方法 以正常肝细胞株L-02进行细胞培养,用油酸诱导建立肝细胞脂肪变性模型.采用油红O染色观察细胞内的脂滴,并检测细胞内甘油三酯含量,RT-PCR法检测SCAP mRNA的表达,Weston blot检测SCAP蛋白的表达.结果 油红O染色显示24h开始出现脂肪变性,120h脂肪变性最重;模型组肝细胞内甘油三酯(TG)含量在各时相点较对照组显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01),120h增高最明显;模型组SCAP mRNA的表达上调,于24h开始增高,72h表达最强,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01);SCAP蛋白的表达24h开始增高,120h最强,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论 油酸诱导的脂肪变性肝细胞模型SCAP的表达增强,细胞内TG的合成增加,SCAP可能参与了肝细胞的脂代谢及脂肪变性的形成.     

内质网应激通过SCAP/SREBP-1c调控L02肝细胞脂质合成代谢

目的 在内质网应激状态下,观察SCAP/SREBP-1c对肝细胞脂质合成代谢的影响.方法 用毒胡萝卜素(Tg)诱导人L02正常肝细胞株建立内质网应激模型,Western blot检测GRP78的蛋白表达.甘油三酯(TG)试剂盒和油红O染色检测肝细胞内脂变程度;实时荧光定量PCR检测SREBP-1c下游脂代谢相关基因FAS、ACC1的mRNA表达情况,Western blot检测nSREBP-1c、FAS、ACC1的蛋白表达情况.通过miRNA瞬时转染沉默SCAP基因的表达,观察上述指标的变化情况.结果 实验组GRP78蛋白的相对表达量与对照组比较,均显著增加(P＜0.05),Tg在体外成功建立肝细胞内质网应激模型.与空白对照组相比,Tg组肝细胞内甘油三酯含量明显增加(P＜0.05),脂滴明显增多;nSREBP-1c的蛋白水平明显升高(P＜0.05);下游靶基因FAS和ACC1的基因和蛋白水平均明显上调(P＜0.05),与nSREBP-1c的升高趋势一致.转染SCAP-3 miRNA载体后,以上指标均明显下调(P＜0.05).结论 内质网应激通过SCAP/SREBP-1c调控肝细胞脂质合成代谢,促进脂质沉积,是NAFLD重要的发病机制之一.靶向干扰SCAP,能减轻内质网应激所致的肝细胞脂肪变程度,成为安全有效的NAFLD防治新靶点.     

肝细胞色素p450 1A1在大鼠非酒精性脂肪肝形成中的作用

目的研究肝细胞色素p450 1A1在非酒精性脂肪肝大鼠形成中的作用.方法Wistar大鼠40只,随机分为正常对照组和高脂饲料2、4、8和12周组(其中每组各8只);HE染色光镜观察肝脏组织病理改变;硫代巴比妥酸法测定肝脏组织丙二醛(MDA)的含量变化;免疫组织化学和Western blot方法研究高脂饲料诱导的大鼠脂肪肝形成中肝细胞色素p450 1A1表达变化.结果高脂饲料组大鼠肝脏内MDA含量明显高于对照组,随着脂肪肝程度的加重,MDA含量逐渐增强,肝细胞色素p450 1A1蛋白表达亦明显增强.结论非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞色素p450 1A1表达变化与脂肪肝引起的脂质过氧化损伤程度密切相关.     

水甘油通道蛋白在非酒精性脂肪变性肝细胞模型中的表达及意义

目的研究水甘油通道蛋白(aquaglyceroporins)AQP3、AQP7、AQP9基因在油酸钠诱导的脂肪变性肝细胞模型中的表达变化及其意义。方法以常规培养的人肝癌HepG2细胞为对照,采用油酸钠诱导HepG2细胞脂肪变性,建立非酒精性脂肪变性肝细胞模型,利用油红O染色及细胞内甘油三酯含量测定检测肝细胞脂肪变性程度,并分别于0、12、24、48 h采用实时荧光定量PCR与Western blot方法检测水甘油通道蛋白AQP3、AQP7、AQP9基因的表达。结果油红O染色观察及肝细胞内甘油三酯含量测定显示HepG2细胞在油酸钠处理12 h后即开始出现脂肪变性,随着刺激时间延长,脂肪变性程度逐渐加重,肝细胞内甘油三酯含量在48 h组(79.76±0.75)较0 h组明显升高(P<0.05)。模型组中,AQP3mRNA水平12 h时表达开始减低,48 h时(0.39±0.08)表达最低,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);AQP7mRNA表达与对照组相比略有升高,差异无统计学意义(P>0.05);而AQP9 mRNA表达水平自12 h(1.59±0.11)即开始增加,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组中,AQP3蛋白水平12 h时表达开始减低,24、48 h组[(0.016±0.002),(0.012±0.001)]与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);AQP7蛋白表达与对照组相比较差异无统计学意义(P>0.05);AQP9蛋白水平12 h表达开始增高,24、48 h[(0.050±0.002)、(0.079±0.002)]组与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论肝细胞脂肪变性模型中水甘油通道蛋白AQP3表达下调、AQP9表达上调、AQP7表达无明显差异,提示不同亚型的水甘油通道蛋白可能通过不同的机制参与了肝细胞非酒精性脂肪变性。     

瘦素及其肝脏受体在大鼠NAFLD形成过程中的变化及意义

目的 探讨瘦素及瘦素受体在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)发病机制中的可能作用.方法 Wistern 雄性大鼠36只,体重在(200±20)g/只,随机分为高脂饮食组(F组)与正常对照组(C组).以高脂饮食喂养12周,建立NAFLD大鼠模型,基础饮食为对照组.高脂饮食组设4、8、12周3个时相点.动态观察大鼠体重变化,放射免疫法检测大鼠血清瘦素浓度,光镜下观察肝脏脂肪变情况,并进行脂肪变分度及炎症分级, 免疫组织化学法观察瘦素受体在正常大鼠肝脏及非酒精性脂肪肝形成过程中的表达变化,Western-Blot检测表达量.结果 F组肝脏体积显著＞C组(P＜0.05);F组的大鼠血清瘦素浓度显著高于正常对照组(P＜0.05),且随着脂肪变程度的加重,血清瘦素浓度有升高趋势;瘦素受体的表达在高脂饮食早期即有增加,且在肝脏的表达随着肝脏脂肪变的加重有增加趋势,尤其在重度脂肪肝肝细胞中表达明显.结论 血清瘦素浓度在大鼠NAFLD的形成中逐渐升高,瘦素受体在NAFLD形成过程中在肝脏表达上调,瘦素及其受体可能参与了NAFLD肝脏能量代谢紊乱的发生.