钙调磷酸酶Aα基因过表达在缺血/再灌注和肾上腺素能受体介导的心肌凋亡中的作用

目的研究腺病毒介导钙调磷酸酶Aα基因(AdCnAα)过表达对缺血/再灌注和肾上腺素能受体介导的心肌凋亡中的作用及p38MAPK的变化。方法体外培养乳鼠心肌细胞,分别给予Iso(10μmol/L) 缺氧24h/复氧4h(Iso H/R)及感染重组腺病毒(AdCnAα) Iso H/R处理,观察AdCnAα对Iso H/R诱导的心肌细胞凋亡的影响。用DNALadder法及流式细胞仪DNA含量测定法(PI标记)检测心肌细胞凋亡,用RT-PCR法和Westernblot法分别检测CaNmRNA及蛋白表达,用Westernblot法检测p38、p-p38MAPK的变化。结果CnAα过表达组(AdCnAα Iso H/R)的心肌细胞凋亡率比Iso H/R组明显增加(14.247±0.525vs10.763±1.554,P<0.01),且均高于正常对照组;同时p-p38MAPK的表达也比正常对照组增加(2.42±0.19vs1.60±0.22,P<0.01);p38MAPK的表达在干预前后同正常对照组比较无差异性变化(P>0.05)。结论腺病毒介导的CnAα过表达可使Iso H/R共同作用诱导的心肌细胞凋亡率增加,p38MAPK可能参与了CaN促进Iso H/R诱导心肌细胞凋亡的信号转导过程。     

SIRT6通过调节eNOS抑制心肌肥大的机制研究

【目的】探讨SIRT6通过调节内皮一氧化氮合酶(eNOS)抑制苯肾上腺素(PE)诱导的新生大鼠心肌细胞肥大的作用及机制。【方法】在PE诱导的心肌细胞肥大模型中采用si-RNA干扰或腺病毒过表达的方法改变心肌细胞中SIRT6表达水平,并通过实时定量RT-PCR(real time PCR)、Western Blotting等方法检测心肌肥大基因心钠素(ANF)、脑尿钠肽(BNP)的表达、心肌细胞表面积,以及eNOS的表达及NO的生成。【结果】与PE刺激组相比,腺病毒过表达SIRT6能显著抑制PE诱导的心肌细胞ANF、BNP mRNA水平及心肌细胞表面积的增加(P<0.05);与对照组相比,基因沉默SIRT6诱导心肌细胞ANF、BNP mRNA水平显著上调(P<0.05),说明SIRT6对心肌细胞肥大的抑制作用。SIRT6过表达能明显逆转PE引起的NO生成水平下降(P<0.05),并部分抑制PE诱导的eNOS蛋白水平下调;SIRT6 si RNA干扰明显降低eNOS蛋白表达及NO生成水平(P<0.05)。eNOS抑制剂Nω硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)能阻断SIRT6对心肌细胞的保护作用(P<0.05),表明SIRT6对eNOS的表达和酶活性有明显的调控作用。【结论】SIRT6可能通过调节eNOS而发挥抗心肌肥大的作用。     

TGF-β1诱导大鼠心肌细胞肥大中钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ信号途径研究

目的：探讨TGF-β1诱导的大鼠心肌细胞肥大中钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ信号途径的信号表达.方法：建立TGF-β1诱导的体外大鼠心肌细胞肥大模型.PI染色标记细胞双链RNA法检测心肌细胞RNA表达量,间接检测心肌细胞肥大.实时荧光定量PCR检测心肌细胞肥大相关基因肌球蛋白重链β亚型（β-MHC）的表达.Western blotting检测心肌细胞中p-CaMKⅡ蛋白表达.结果：TGF-β1可诱导体外培养心肌细胞肥大基因的表达,β-MHC的表达明显高于对照组（P＜0.01）.PI染色TGF-β11组PI含量明显增高（P＜0.01）,TGF-β13 μg/L组心肌细胞内PI含量最高（80.57±3.56）;与对照组相比,TGF-β1可明显上调的表达p-CaMKⅡ（108.83±12.15 vs 10.6±1.35,P＜0.01）,并于TGF-β1诱导2h表达达峰.结论：TGF-β1可诱导心肌细胞肥大的形成,此过程中CaMKⅡ蛋白表达明显增加.     

肾缺血预处理对兔未成熟心肌Bcl-2, Bax,Fas蛋白表达的影响

目的:探讨肾缺血预处理(RIP)对兔未成熟心肌细胞凋亡和Bcl-2, Bax, Fas蛋白表达的影响. 方法:24只幼兔采用Langendorff离体心脏灌注模型,随机分为正常对照组(C)、心脏缺血/再灌注组(I/R)和肾缺血预处理组(RIP),每组8只,测定各组未成熟心肌细胞凋亡和Bcl-2, Bax, Fas蛋白表达. 结果:RIP组与I/R组比较,心肌细胞凋亡率明显减少[(4.19±1.13)% vs (12.30±2.10)%, P<0.01],DNA片段梯光密度明显减少(57 350±1765 vs 135 200±3370, P<0.01), Bcl-2表达增多(33 525±1026 vs 12 385±860, P<0.01), Bax(8640±768 vs 32 472±1128, P<0.01)和Fas(8936±912 vs 32 100±1260, P<0.01)表达明显减少. 结论:RIP可减少缺血再灌注后兔未成熟心肌细胞凋亡和影响Bcl-2, Bax, Fas蛋白的表达.     

PKC-c-fos途径在罗格列酮抑制内皮素诱发心肌肥大中的作用

目的 研究罗格列酮(RSG)抑制内皮素(ET-1)引起心肌肥大的机制与蛋白激酶C(PKC)和c-fos的关系.方法 在培养新生大鼠心肌细胞中,采用RSG(PPAR-γ激动剂)、PKC的激动剂(佛波醇酯,PMA)、PKC的阻断剂白屈菜季氨碱(che)观察罗格列酮在ET-1和PMA诱导心肌肥大中对PKC活性和C-fos蛋白表达的影响.结果 培养2 d后,对照组(DMEM)蛋白质含量为(290±13)μg/ml,ET-1组和PMA组分别为(339±15)μg/ml和(329±14)μg/ml,较对照组升高15%和13%(P<0.01);ET-1 10-8 mol/L RSG组、ET-1 10-7mol/LRSG组、ET-1 che组、分别为(303±14)、(292±11)、(291±12)μg/ml;与ET-1组比较分别降低10%、12%、13%(P<0.05,P<0.05,P<0.01);PMA 10-7mol/LRSG组的蛋白含量较PMA组降低10%(P<0.01).PMA和ET-1促进心肌细胞蛋白质的合成,RSG和che分别抑制蛋白质合成.测定心肌细胞的3H-亮氨酸掺人,RSG同样可以抑制ET-1和PMA诱导的心肌细胞肥大,同时PMA和ET-1使PKC从胞浆移位到细胞膜.RSG和che均有抑制蛋白质合成和3H-亮氨酸掺人的作用,还有抑制PMA和ET-1引起心肌细胞PKC活性和c-fos蛋白表达增强的作用.结论 RSG抑制ET-1和PMA引起的心肌肥大,其制作用可能与抑PKC-c-fos途径有关.     

肝细胞生长因子对猪心肌梗死后心功能及心肌细胞凋亡的影响

目的:研究经冠脉转染腺病毒(adenovirus,Ad5)携带的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HCF)对猪心肌梗死后心功能及心肌细胞凋亡的影响.方法:小型猪12只,随机分为对照组(null-Ad,,1 ml)及转染Ads-HGF治疗组(5×109 Pfu/ml,1 ml),每组6只.结扎前降支远端制作心肌梗死模型.术后4周,经右冠状动脉治疗组注射Ad5-HGF(5×109 pfu/ml,1 ml)、对照组注射null-Ad5(1 ml).两组均在手术后4周和7周行门控心肌灌注显像,评价心肌灌注及左室射血分数(LVEF)变化;并在7周时处死动物.TUNEL法观察心肌细胞凋亡,免疫组化评价Bcl-2及Bax蛋白表达.结果:①造模后4周治疗组和对照组之间心肌灌注及LVEF值无明显差异(P>0.05).转染Ad5-HGF后3周,治疗组心肌灌注及LVEF值较治疗前明显改善(P<0.01),但对照组无明显变化(P>0.05),治疗组和对照组比较,心肌灌注及LVEF值均有明显增加(P<0.01);②在治疗组和对照组的移行区均可见心肌细胞凋亡.但治疗组心肌细胞凋亡指数明显低于对照组(P<0.01);③治疗组Bcl-2蛋白表达增加、Bax蛋白表达抑制.和对照组相比差异具有显著性(P<0.01).结论:经非梗死相关动脉转染Ad5-HGF治疗能减少心肌细胞凋亡,改善心梗后心功能.其机制可能与Bcl-2表达上调和Bax表达下调有关.     

TBX18腺病毒使成鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的研究TBX18腺病毒能否转染成鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并诱导其向心肌样细胞分化。方法实验于2015年5月—2016年10月在武汉大学心血管病研究所/心血管病湖北省重点实验室进行。全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,采用流式细胞仪分析细胞纯度,随机数字表法分为实验组(TBX18组)、空白病毒对照组(GFP组)和空白对照组(B组),用TBX18或GFP重组腺病毒载体分别转染BMSCs,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测α-SMA基因的表达,蛋白质免疫印迹(Western blot)检测α-SMA和cTnI蛋白的表达。结果通过全骨髓贴壁法可分离获得纯度较高的BMSCs(97%～99%)。TBX18组的α-SMA mRNA表达(2. 66±0. 08)明显高于GFP组(1.49±0.09)和B组(1.00±0.00),差异均有统计学意义(t=16. 743、36. 813,P <0. 01); TBX18组α-SMA蛋白的表达(0.66±0.00)明显高于GFP组(0.36±0.08)和B组(0. 17±0.03),差异均有统计学意义(t=6. 751、23.761,P<0.01);cTnI蛋白的表达(0.57±0.12)明显高于GFP组(0.32±0.04)和B组(0.09±0.00),差异均有统计学意义(t=3.298、6.660,P<0.01)。结论 TBX18腺病毒能成功转入骨髓间充质干细胞,并在细胞内稳定表达;TBX18可诱导成鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞。     

PTEN负性调控血管紧张素Ⅱ刺激所致心肌细胞肥大

目的研究PTEN对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)所致心肌细胞肥大的影响.方法构建携带PTEN基因的腺病毒载体,感染原代培养的乳鼠心肌细胞,用AngⅡ作为肥大刺激因素,测定ANF、β-MHC与心肌细胞大小.结果对照组与仅携带GFP的腺病毒感染的心肌细胞在AngⅡ作用下,ANF、β-MHC表达与细胞直径显著增高,而PTEN过度表达则对上述改变具有抑制作用.结论 PTEN能够负性调控AngⅡ所致的心肌细胞肥大.     

神经肽Y、维拉帕米对大鼠心肌细胞肥大的影响

通过测定培养的心肌细胞~3H-leucine(~3H-亮氨酸)掺入率和膜片钳全细胞记录方法记录Ca~(2 )电流(I_(ca)),研究神经肽Y(NPY)、维拉帕米对大鼠心肌细胞肥大的影响。结果:0.1μmol/L NPY促使培养的心肌细胞~3H-leucine掺入率增大,达(136.0±4.4)min~(-1),与对照组(91.0±4.O)min~(-1)相比,差异有显著性意义(p<0.01)。10nmol/L维拉帕米与NPY共同作用于心肌细胞24h,可使NPY促~3H-leucine掺入率增大的作用受到抑制(P<0.01)。NPY可显著增大心肌细胞I_(ca),为(12.0±3.1)pA,与对照组(5.5±2.4)pA比较,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:NPY促使培养的心肌细胞蛋白质合成率增大的作用可被维拉帕米阻断,而NPY增加细胞内游离钙,触发心肌蛋白质合成增加,可能是促进心肌肥大的机制之一。     

蛋白酶体抑制剂MG132抑制体外培养心肌细胞肥大的实验研究

目的研究蛋白酶体抑制剂MG132对体外培养的大鼠心肌细胞肥大的影响。方法采用[3H]-亮氨酸参入率测定心肌细胞蛋白质合成代谢,采用IPP 6.0图像分析软件分析心肌细胞表面积,以及用RT-PCR检测β-肌球蛋白重链(β-MHC)表达。结果 MG132预处理逆转了苯肾上腺素诱导的心肌细胞[3H]-亮氨酸参入率增加(P<0.01)、表面积增大(P<0.01)和β-MHC mRNA表达上调(P<0.05)。结论 MG132能够抑制心肌细胞肥大,具有心肌保护作用。     

PRKAG2基因G100S新突变对心肌细胞钙稳态和糖原含量的影响

\[摘要\] 目的 探讨首次在国人WPW综合征(PRKAG2心脏综合征)家系中发现的一个新的错义突变PRKAG2 G100S引起心肌肥厚的可能机制。 方法 使用Invitrogen的GatewayTM重组系统构建含有人全长PRKAG2基因新突变体(PRKAG2 G100S)的重组腺病毒载体;以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,将病毒分别感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞和SD乳鼠心肌细胞后采用蛋白质印迹方法检测PRKAG2蛋白的表达。重组腺病毒感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞48 h前后以Rohd2/AM孵育并测定细胞内游离Ca2+浓度;感染乳鼠心肌细胞48～72 h 后以过碘酸雪夫(PAS)法测定细胞内糖原含量。结果 重组腺病毒分别感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞和SD乳鼠心肌细胞48 h后荧光显微镜下可观察到绿色荧光,用PRKAG2单抗能检测到靶蛋白。与野生型PRKAG2和EGFP组比较,重组腺病毒感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞48 h后突变体PRKAG2 G100S组细胞内游离Ca2+浓度无明显变化;重组腺病毒感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞48 h前后的细胞内游离Ca2+浓度无明显变化。在重组腺病毒感染乳鼠心肌细胞48 h后,PRKAG2 G100S组能检测到明显的心肌细胞内糖原累积。结论 PKRAG2 G100S新突变导致心肌肥厚的主要发病机制可能是细胞内糖原累积,Ca2+及其介导的细胞内信号转导途径可能未参与心肌肥厚的发生。     

Effects of transforming growth factor-β1 and signal protein Smad3 on rat cardiomyocyte hypertrophy

Background SMAD proteins have recently been identified as the first family of putative transforming growth factor-β1 (TGF-β1) signal transducers. This study was to investigate the effects of TGF-β1 and signal protein Smad3 on rat cardiac hypertrophy.Methods The incorporation of [3H]-leucine was measured to determine the hypertrophy of cardiomyocyte incubated with different doses of TGF-β1 in cultured neonatal cardiomyocytes. The model of rat cardiac hypertrophy was produced with constriction of the abdominal aorta. At different times after the operation, rats were killed, and their left ventricular mass index (LVMI) determined.The mRNA expression of TGF-β1 and Smad3 of cultured cells and hypertrophic left ventricles were assessed by RT-PCR. The protein expression of Smad3 was assessed by Western blot.Results In cultured neonatal cardiomyocytes, TGF-β1 significantly promoted incorporation of [3H]-leucine. With the concentration of 3 pg/L, it increased the expression of Smad3 in mRNA and protein levels after 15 minutes, and continued for up to 8 hours of cultured cardiomyocytes. The LVMI and theexpression of TGF-β1 (mRNA) and Smad3 (mRNA and protein) of hypertrophic left ventricle were increased by day 3 after the operation and continued to the 4th week. The peak expression of these was in the second week after operation.Conclusion TGF-β1 has positive effects on could be related to the pathologic progressionrat cardiomyocyte hypertrophy. Signal protein Smad3 of rat cardiac hypertrophy.     

NADPH氧化酶源性ROS在乳鼠心肌细胞肥大中的作用

目的探讨NADPH氧化酶来源的活性氧(ROS)在TNF-α诱导乳鼠心肌细胞肥大中的作用。方法采用体外乳鼠心肌细胞培养,给予TNF-α、APO单独或联合作用细胞24h,以BCA法测定心肌细胞蛋白合成,共聚焦显微镜测量心肌细胞ROS含量,RT-PCR法测定心肌细胞心钠素ANP mRNA的表达。结果 TNF-α可明显增加心肌细胞蛋白合成,心肌细胞体积增大,ROS生成增多,ANP mRNA表达水平显著增加,以上作用可被APO明显抑制。结论TNF-α通过增加心肌细胞NADPH氧化酶来源的ROS生成,促进心肌细胞肥大。     

COX-2信号通路参与高糖高胰岛素诱导的心肌细胞肥大研究

目的探讨环氧化酶-2(COX-2)在高糖高胰岛素诱导的心肌肥大中的作用。方法用高糖高胰岛素刺激体外培养的乳鼠心肌细胞,以细胞表面积、蛋白含量和心房利钠因子(ANF)mRNA表达为心肌细胞肥大的反映指标,观察COX-2特异性抑制剂———赛来昔布对高糖高胰岛素致肥大作用的影响。利用real-time PCR检测细胞中mRNA的表达。结果高糖高胰岛素诱导细胞表面积、总蛋白含量以及ANF、COX-2 mRNA的表达增加(P<0.05);赛来昔布可以抑制高糖高胰岛素诱导的心肌细胞肥大(P<0.05),同时抑制COX-2的表达(P<0.05)。结论赛来昔布可以通过抑制COX-2的表达,从而对抗高糖高胰岛素诱导的心肌肥大。     

含有人热休克蛋白基因的重组腺病毒转染乳鼠心肌细胞的实验研究

目的:研究含有人热休克蛋白70(HSP70)基因的重组腺病毒对乳鼠心肌细胞的转染效率以及基因转染后HSP70的表达。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)体外感染心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建的腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。结果:Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法以及免疫组化染色法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。结论:重组腺病毒Ad.HSP70能够在体外高效、安全地感染心肌细胞,并成功地表达HSP70。     

腺病毒介导的HSP70基因转染对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究热休克蛋白70(HSP70)基因转染对体外培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)感染体外心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。利用体外心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,研究HSP70基因转染对心肌细胞的保护作用。结果:原代培养获得高纯度的乳鼠心肌细胞,随着MOI值升高,Ad.EGFP的感染效率和基因表达增强,在MOI值为50时,Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。免疫组化染色法结果显示,表达的HSP70主要分布于心肌细胞的胞质和胞核中;利用体外的缺氧/复氧损伤模拟在体的缺血/再灌注损伤,结果显示Ad.HSP70感染组的细胞活力、MT...     

神经肽Y(NPY)诱导大鼠心肌细胞肥大的效应观察

目的 :观察神经肽Y(NPY)诱导大鼠心肌细胞肥大效应。方法 :用不同浓度NPY(10nmol/L、10 0nmol/L)刺激心肌细胞 ,应用3 H Leu掺入量法测定心肌细胞蛋白质合成速率、RT PCR法测心肌细胞c junmRNA表达。结果 :1.心肌细胞3 H Leu掺入量测定 :较大剂量NPY刺激心肌细胞蛋白合成速率显著增加。与对照组相比 ,NPY10nmol/L组3 H Leu掺入量有所增高 ,但差异无显著性 ,而NPY10 0nmol/L组心肌细胞 3H Leu掺入量较对照组明显增高 (P <0 .0 5 )。 2 .心肌细胞内c junmRNA表达 :NPY组心肌细胞c junmRNA的RT PCR产物量明显高于对照组(P <0 .0 0 1)。结论 :NPY刺激心肌细胞蛋白质合成增加、心肌细胞原癌基因 (肥大早期反应基因 )c junmRNA表达增加 ,提示NPY可通过其生长因子样效应 ,诱导心肌细胞肥大。     

Popdc2表达下调通过Akt磷酸化促进新生大鼠心肌细胞增殖

目的:探讨Popdc2对新生大鼠心肌细胞增殖作用及其机制?方法:分离出生后第0?7?14天大鼠心脏组织,荧光定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测心脏组织中Popdc2 mRNA表达情况?分离出生后0~2 d SD大鼠原代心肌细胞和成纤维细胞,qRT-PCR检测Popdc家族mRNA在心肌细胞表达情况?Popdc2 mRNA在心肌细胞和成纤维细胞表达情况;大鼠原代心肌细胞分别转染阴性对照小干扰RNA(NC组)和Popdc2特异性小干扰RNA(si-Popdc2组),EdU实验?Ki67染色检测心肌细胞增殖,免疫荧光检测心肌细胞特异性蛋白辅肌动蛋白(actinin)和心肌钙蛋白2(TNNT2)表达,qRT-PCR检测转染小干扰RNA后心肌细胞Popdc2及转录因子TBX20?TBX5 mRNA表达?增殖抗原蛋白Ki67 mRNA表达情况,Western blot检测总Akt及磷酸化Akt蛋白表达水平?结果:① Popdc家族中Popdc2 mRNA在心肌细胞表达最高(P均<0.01),且随着出生后天数增加Popdc2表达逐渐升高(P均<0.01),Popdc2 mRNA在心肌细胞表达高于成纤维细胞(P < 0.05);②与对照组相比,沉默Popdc2可促进原代心肌细胞DNA合成(P < 0.05),并增加Ki67阳性心肌细胞数量(P < 0.05);③qRT-PCR显示沉默Popdc2可上调转录因子TBX20(P < 0.01)?TBX5(P < 0.05)的mRNA表达,沉默Popdc2促进Ki67的mRNA表达 (P < 0.05),Western blot结果显示沉默Popdc2可促进Akt蛋白磷酸化,Akt308(P < 0.05),Akt473(P < 0.001)?结论:Popdc2表达下调可能通过调节转录因子表达及Akt蛋白磷酸化促进新生大鼠心肌细胞增殖,Popdc2 有可能成为心肌损伤后修复和再生治疗靶点?