影响TRIzol提取RNA质量的因素分析

目的使用TRIzol法提取RNA,分析在不同种类、不同浓度试剂残留时RNA的吸光度及曲线变化,以阐明影响RNA纯度的因素。方法使用TRIzol试剂提取杜氏盐藻中RNA,经酚、氯仿、异戊醇抽提,醋酸钠和乙醇沉淀、纯化后制成标准品,与不同浓度的酚、TRIzol、氯仿、乙醇、牛血清白蛋白(BSA)等量混匀后制成待测定溶液,使用Nano Drop 2000测定其在230、260、280 nm处的吸光度,计算比值并观察其吸收曲线。结果在不同浓度的酚和TRIzol及0.5 g·L-1BSA残留时,RNA的吸光度比值与吸收曲线均有较明显的变化;高浓度的氯仿残留时其吸光度与吸收曲线的变化较低浓度的变化明显;高浓度的乙醇残留对RNA溶液的吸光度及曲线影响较小,而低浓度的残留反而有较大影响。结论根据RNA溶液的吸光度比值及曲线共同分析可快速准确判断影响RNA质量的残留试剂。     

TRIzol法与磁珠法用于丙型肝炎病毒RNA定量检测的比较

目的 比较不同核酸提取方法TRIzol法与磁珠法对丙型肝炎病毒核酸（HCV RNA）定量检测结果的影响。 方法 收集117例丙型肝炎病毒感染阳性患者的血清及其基因分型信息。分别采用TRIzol法与磁珠法提取患者血清样本的HCV RNA,定量PCR检测提取HCV RNA的病毒载量,比较两种提取方法HCV RNA检测结果的差异性。 结果 定量PCR检测结果显示TRIzol法和磁珠法具有良好的线性相关性：y=0.978x+0.063（R2=0.973）。Bland-Altman统计分析显示TRIzol法的检测平均值略低于磁珠法,但无明显统计学差异（P>0.05）. 基因型分析显示1b、2a、3a和6a 亚型之间无显著性差异（P>0.05）.结论TRIzol提取法的HCV定量检测结果和磁珠法相当,且标本用量更少,成本低廉,可在国内广泛使用,且能更大范围地应用在试剂盒的开发和HCV RNA临床检测中。     

不同RT-PCR方法学的探讨

目的:探讨微量RNA标本的RT-PCR方法。方法:采集13例新生大鼠脊髓标本,提取RNA,分别稀释至1μg/μl、1ng/μl和1 pg/μl,分别以两步法RT-PCR、Promega公司和Qiagen公司一步法RT-PCR试剂盒,扩增β-actin基因,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外透射仪下观察分析。结果:浓度为1μg/μl和1ng/μl的标本,三种方法均出现了目标带,而浓度为1 pg/μl的标本,两步法RT- PCR、Promega公司和Qiagen公司一步法RT-PCR试剂盒的阳性率分别为85%、77%和100%。结论:一步法敏感性高于两步法,微量RNA标本以采用Qiagen公司的一步法试剂盒进行RT-PCR实验为好。     

TRIzol法与磁珠法用于丙型肝炎病毒RNA定量检测的比较

目的 比较TRIzol法与磁珠法对丙型肝炎病毒(HCV) RNA定量检测结果的影响.方法 收集117例丙型肝炎病毒感染阳性患者的血清及其基因分型信息.分别采用TRIzol法与磁珠法提取患者血清样本的HCVRNA,qPCR检测提取HCV RNA的病毒载量,分析两种提取方法所得HCV RNA检测结果的差异.结果 qPCR结果显示TRIzol法和磁珠法具有良好的线性相关性:y=0.978x+0.063(R2 =0.973).Bland-Altman统计分析显示TRIzol法提取的HCV RNA病毒载量对数值的平均值略低于磁珠法,但差异无统计学意义(P＞0.05).基因型分析结果显示1a、1b、2a、3a和6a基因型中两种提取方法差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 TRIzol法提取HCV RNA的定量检测结果和磁珠法相当,且成本低廉,可在国内广泛用于试剂盒的开发和HCV RNA临床检测.     

RET原癌基因在甲状腺结节细针穿刺标本中的表达

目的探讨RET原癌基因在甲状腺结节细针穿刺标本中的表达及其对良恶性诊断的意义。方法选择我院普外科拟行手术切除甲状腺结节的住院患者65例,术前行甲状腺结节细针穿刺(FNA),细针穿刺涂片做RET免疫组化染色。以手术切除的甲状腺结节组织标本的病理诊断做为黄金标准,评价RET原癌基因在甲状腺结节良恶性诊断中的意义。结果依据术后病理诊断,良性甲状腺结节30例,恶性甲状腺结节35例(甲状腺乳头状癌28例,甲状腺滤泡状腺癌7例)。RET在甲状腺恶性结节FNA样本中的阳性率高于甲状腺良性结节中的阳性率(82.35%VS 10%,χ2=34.31,P<0.05),与普通甲状腺FNA相比,结合RET特殊染色可提高结节良恶性诊断的敏感度和特异度(82.86%VS 65.71%;90%VS 86.67%)。结论 RET在甲状腺恶性结节的阳性率高于甲状腺良性结节,FNA结合RET特殊染色可提高术前甲状腺结节良恶性诊断的敏感度和特异度。     

四种提取诺如病毒和副溶血性弧菌总RNA方法的比较

目的比较四种联合提取诺如病毒和副溶血性弧菌总RNA的方法。方法使用Trizol法、磁珠法、Qiagen~(TM) RNA Mini Kit和柱式RNA抽提试剂盒分别提取诺如病毒和副溶血性弧菌的总RNA,经核酸测定仪检测RNA的质量,并用RT-PCR法对四种提取方法进行比较。结果 Qiagen~(TM) RNA Mini Kit的提取效率最佳,对PCR的反应影响最小。磁珠法其次,但是磁珠法提取出的总RNA纯度也较高。Trizol法和柱式法总RNA抽提试剂盒所获得的总RNA比上述两者低,且存在不同程度的污染。经随机区组方差分析显示,四种提取方法之间存在显著性差异,F浓度=11.313;F(A_(260)/A_(280))=15.093;F(A_(260)/A_(280))=11.155,P均0.05。结论四种试剂的实际提取效率存在差异,应根据不同的样本情况选择合适的试剂。     

血清HCV RNA不同提取方法的对比研究

目的:探讨不同方法提取丙型肝炎患者血清HCV RNA ,比较每种方法提取的RNA用于RT-PCR荧光定量检测的敏感度.方法: 分别采用异硫氰酸胍-酚氯仿法、蛋白酶K-酚氯仿法、固相吸附法、柱式总RNA抽提法提取7例疑似 HCV感染者血清标本中的HCV RNA,采用实时荧光定量PCR法进行检测.结果:采用异硫氰酸胍-酚氯仿法、蛋白酶K-酚氯仿法提取HCV RNA用于核酸检测有漏检现象,而采用固相吸附法和柱式总RNA抽提法,敏感度均可达到100%.结论采用固相吸附法和柱式总RNA抽提法提取血清HCV RNA具有较高的敏感度,在实时荧光定量PCR法检测中具有重要的临床价值.     

两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA提取效能的比较

目的 比较两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA的提取效能.方法 用Trizol提取法和QIAamp Viral RNA Mini Kit提取法分别提取感染小鼠诺如病毒(Murine Norovirus,MNV)的小鼠小肠组织样品RNA和细胞培养物RNA,测定RNA浓度;用MNV特异的引物对分离的核酸样品进行一步法RT-PCR扩增.结果 Trizol提取法提取小肠组织的RNA浓度高于QIAamp Viral RNA Mini Kit提取法;QIAamp Viral RNA Mini Kit提取得到的细胞培养物RNA浓度高于Trizol提取法.经QIAamp Viral RNA Mini Kit提取的两种核酸样品均能扩增出特异条带,而Trizol提取的核酸样品未见特异条带.结论 在MNV的检测中,QIAamp Viral RNA Kit更适合组织样品中MNV病毒核酸的提取.     

改良DNA提取法对皮肤结核PCR检出率的影响

目的探索适用于石蜡包埋皮肤组织的DNA提取方法,提高结核分支杆菌PCR检出率。方法选择明确诊断的结核性肉芽肿或怀疑结核性肉芽肿的皮肤病理标本46例,分别以二甲苯脱蜡-试剂盒法和TES脱蜡-改良试剂盒法提取总DNA,荧光PCR扩增后分析结核分支杆菌的阳性检出率,并与抗酸染色的结果进行比较。结果 TES脱蜡-改良试剂盒法提取的总DNA浓度显著高于二甲苯脱蜡-试剂盒法(P0.05),并且提取的DNA质量更好。TES脱蜡-改良试剂盒法所提DNA的PCR总体阳性率显著高于二甲苯脱蜡-试剂盒法(P0.05)。改进后的DNA提取方法荧光PCR的阳性检出率较抗酸染色高(P0.05)。抗酸染色阳性的标本与PCR检测结果有较好的一致性(Kappa=0.804),但抗酸染色阴性的标本与PCR检测结果的一致性较差(Kappa=0.257)。结论 TES脱蜡-改良试剂盒法提取石蜡包埋皮肤组织的总DNA提取率和提取质量高于二甲苯脱蜡-试剂盒法,显著提高了结核分支杆菌的PCR阳性检出率。     

CEUS与FNA联合诊断甲状腺良恶性结节的价值分析

目的 探讨超声造影(CEUS)与细针穿刺细胞学检查(FNA)联合诊断甲状腺良恶性结节的价值.方法 选取本院2018年1月至2019年12月收治的甲状腺结节患者124例作为研究对象,均接受CEUS和FNA检查,以病理学检查为金标准,比较CEUS、FNA单独和两者联合诊断甲状腺良恶性结节的价值.结果 以病理学检查结果为金标准,124例患者中共检测出136个甲状腺结节,其中甲状腺良性结节共28个,占20.59％,甲状腺恶性结节共108个,占79.41％,FNA联合CEUS诊断甲状腺良恶性结节的敏感度、特异度、阳性预测值及阴性预测值均高于单独FNA、CEUS检测(P<0.05),且与金标准诊断结果一致性好(Kappa值=0.932,P<0.05).结论 与CEUS、FNA单独检查相比,CEUS与FNA联合诊断甲状腺良恶性结节可提高诊断价值,值得临床推广应用.     

适用于转录组测序的人参根总RNA提取方法的筛选

目的 筛选适用于转录组测序的人参根组织总RNA提取方法.方法 以15年生长白山人参为研究对象,比较RNAiso Plus法、Trizol法、改良CTAB法、植物总RNA提取试剂盒、多糖多酚总RNA提取试剂盒(RNA prep Pure Plant Kit)提取人参根组织总RNA,利用琼脂糖凝胶电泳、Aligent 2100 Bioanalyzer对5种方法提取的总RNA进行质量检测.结果 Trizol法和RNAiso Plus法均能提取到总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S条带清晰稳定,D(γ)260 nm/D(γ)280 nm和D(γ)260 nm/D(γ)230 nm值均在2.0左右.Trizol试剂法提取总RNA的28S条带亮度明显高于18S,所得RNA浓度达485.66 ng/μL,经Aligent 2100 Bioanalyzer检测,28S条带亮度是18S的2倍.RNA prep Pure Plant Kit试剂盒及植物总RNA提取试剂盒提取RNA的条带模糊、弥散,RNA降解严重.改良CTAB法无法完成人参根组织总RNA的提取.结论 Trizol试剂法提取的人参根组织总RNA浓度、纯度及完整性与其他方法相比效果最佳,能满足转录组测序的要求,是人参根组织总RNA提取的首选方法.     

3种核酸提取方法检测甲型H1N1流感病毒的比较

目的选择常见的3种核酸提取方法,比较其对低拷贝数甲型H1N1流感病毒核酸检测的敏感性差异,为实验室应用和结果的评价提供依据。方法对已确定阳性的甲型H1N1流感病毒标本,作10^-1～10^-4系列稀释,选用Promega公司全自动核酸提取仪及配套试剂盒、QIAGEN公司Rneasy Mini Kit和国产H公司提取试剂盒3种核酸提取方法提取上述标本核酸模板,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（荧光RT—PCR）对其进行评价。结果在对不同拷贝数流感病毒的检测中,3种核酸提取方法以Promega公司全自动核酸提取仪提取效率最高,以此提取效率作为100％,则QIAGEN Rneasy Mini Kit和国产H公司提取试剂盒的平均提取效率依次为83．27％、55．70％。经方差分析,3种方法之间存在显著性差异（P〈0．05）。结论各试剂之间提取核酸的效率存在显著差异,建议根据实际情况采用合适的核酸提取试剂和方法。     

2种提取大鼠肝RNA方法的比较

目的建立大鼠肝RNA的提取方法,为逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern blot以及cDNA文库构建等分子生物学实验奠定基础。方法用Trizol法和异硫氰酸胍提取法提取大鼠肝RNA,紫外分光光度计测定RNA产量及纯度,琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性。结果采用Trizol方法提取的RNA的OD260/OD280比值为2.28,异硫氰酸胍方法提取的RNA OD260/OD280比值为1.74。采用Trizol法提取RNA的产量高于异硫氰酸胍提取法,电泳分析18 s、28 s条带完整。结论Trizol提取的大鼠肝RNA纯度、收率都优于硫氰酸胍方法提取的RNA。     

不同RNA提取及反转录方法对环状RNA聚合酶链反应的影响

［摘要］ 目的 比较不同总RNA提取方法及不同反转录引物对喉鳞状细胞癌细胞株Hep2细胞环状RAN扩增的影响,进一步为环状RNA鉴定与扩增提供可靠的实验方法。 方法 使用Trizol抽提法和miRNeasy Mini试剂盒提取Hep2细胞中的总RNA;Nanodrop 2000对总RNA进行定量及纯度测定;使用随机引物和通用引物分别对总RNA进步反转录;实时定量聚合酶链反应检测Hep2细胞中环状RNA-circHIPK3及circFLNA的表达。 结果 Trizol抽提法提取的RNA浓度和RNA总量高于miRNeasy Mini试剂盒提取的RNA总浓度结果（P＜0.01）,但应用miRNeasy Mini试剂盒提取的RNA纯度要高于Trizol抽提法（P＜0.05）,应用随机引物反转录,能扩增出circHIPK3和circFLNA,而利用通用引物进行反转录,circHIPK3及circFLNA不能被扩增;另外,利用miRNeasy Mini试剂盒法提取总RNA后所扩增出circHIPK3及circFLNA的相对表达量明显高于Trizol抽提法（P＜0.01）。 结论 miRNeasy Mini试剂盒提取总RNA纯度更高,更有利于环状RNA的扩增,利用随机引物进行反转录而非通用引物,可顺利扩增出环状RNA。     

Trizol RNA提取法在雪貂组织的流感病毒H3N2定量PCR检测中优于RNeasy mini kit (Qiagen)柱子法

目的 比较RNeasy mini kit (Qiagen)柱子法和Trizol法提取RNA在雪貂肺和肠组织H3N2 SYBR Green PCR定量中的去干扰作用,从而找到适合该定量体系的RNA提取方法.方法 比较Trizol法,RNeasy mini kit柱子法,改良RNeasy mini kit柱子法1和改良RNeasy mini kit柱子法2提取肺肠组织RNA的质量,RNA逆转录成cDNA后,利用SYBR Green PCR方法检测样品中H3N2的载量,比较产物的特异性,综合评价RNA提取方法.结果 4种方法提取的肺和肠组织的RNA质量不相同,紫外分光光度仪测得RNeasy mini kit柱子法提取的RNA 的A260/280低于1.8,其余3种方法的A260/280在1.8～2.1之间,A260/230只有Trizol法能达到2.0左右,其余3种方法均远低于2.0.电泳可见Trizol法提取的RNA有3条带:28 s、18 s和5 s,而RNeasy mini kit柱子法的RNA除了有28 s、18 s外,还有基因组DNA,改良RNeasy mini kit柱子法1和2提取的RNA只有28 s和18s带.RNA逆转录后进行荧光定量PCR,从溶解曲线看,不论是鼻甲刮取物还是肺肠组织的样品模板,4种方法获得的样品与标准品均为单一峰溶解曲线峰,并且波峰位置重叠.而鼻甲刮取物定量的产物跑琼脂糖凝胶电泳均为单一的特异性条带,而肺肠组织的产物电泳发现:Trizol法获得的模板定量产物与标准品一致,为单一的特异性条带,而其它3种方法获得的模板则均有非特异性条带.结论 鼻甲刮取物的病毒定量选用RNeasy mini kit柱子法提取定量结果与Trizol法一样可靠,说明对于简单样品该体系及引物非常适用,结果可信.对于组织样品肺和肠,Trizol法获得的样品定量结果比其它3种方法可靠.     

两种提取人参水煎液miRNA方法的比较

目的 筛选获取新鲜人参水煎液中高质量miRNA的提取方法.方法 选择改良Trizol法和通用植物miRNA提取试剂盒法提取新鲜人参水煎液miRNA,所得miRNA经DNaseⅠ处理后进行琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100生物分析仪检测,比较两种方法所得miRNA的纯度和质量.结果 改良Trizol法步骤简单、快捷省时、成功率较高但纯度较低;通用植物miRNA提取试剂盒法步骤较多耗时较长,但miRNA纯度高质量好.结论 通用植物miRNA提取试剂盒法更适用于提取人参水煎液中miRNA,提取的miRNA完整性好、纯度高,可以满足荧光定量PCR、建库测序等后续研究的需要.     

两种冻存方法在肿瘤微转移检测中的运用

目的 建立科学的外周血有核细胞的冻存方法,为肿瘤的微转移逆转录ＰＣＲ检测打好基础。方法 分离１５例ＣＥＡ分泌性肿瘤患者外周血有核细胞,分别用两种方法冻存,设为两组。对细胞进行总结ＲＮＡ的抽提,测定ＲＮＡ ＯＤ值并行１％琼脂糖凝胶电泳,进一步逆转录ＰＣＲ反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析最终产物。结果 经两种方法冻存的细胞,其总ＲＮＡ ＯＤ值差异无显著性,电泳均见竹节样带。两组逆转录ＰＣＲ结果一致,阳性率     

三种提取人腰椎间盘纤维环总RNA效率方法比较

目的：通过比较利用不同方法抽提人腰椎间盘纤维环RNA的效果来评定抽提人腰椎间盘纤维环总RNA的有效的方法和步骤。方法：对60例腰椎间盘突出症患者在腰椎间盘摘除手术时切取摘除的椎间盘组织,60份标本分别用异硫氰酸胍法、Trizol法和膜结合柱分离法提取组织中的RNA,用紫外可见分光仪测定所得RNA的浓度和OD260/OD280的比值并分别记录,另外记录提取RNA所用的时间和OD比值大于1.60的阳性率以及平均每份标本所需的费用。结果：利用异硫氰酸胍法,平均耗时160 min,RNA平均浓度为95.44μg/μl,平均OD比值为1.62,阳性率58.3%;利用Trizol法提取总RNA,平均耗时105 min,RNA平均浓度为531.40μg/μl,平均OD比值1.40,阳性率18.5%;利用膜结合柱分离法提取标本总RNA,平均耗时41 min,RNA平均浓度为690.34μg/μl,平均OD比值为1.83,阳性率100%。结论：膜结合柱分离法是提取人腰椎间盘高质量总RNA的有效方法。