阿托伐他汀调控上皮间质转化抑制结肠癌细胞生长的机制研究

目的:探讨阿托伐他汀调控上皮间质转化（EMT）对人结肠癌SW480细胞侵袭和迁移的影响。方法:0.1、1、10、100 μmol/L的阿托伐他汀处理SW480细胞24 h、48 h和72 h,MTT检测细胞活力。100 μmol/L的阿托伐他汀处理细胞48 h,Transwell小室检测细胞侵袭能力及迁移能力,Western blotting检测EMT相关蛋白E-cadherin、β-catenin和Twist及PI3K/AKT信号通路PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达。结果:随着阿托伐他汀浓度升高,作用时间延长,对SW480细胞活力抑制越明显,各浓度阿托伐他汀组与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）,同一实验组不同时间点间比较差异具有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较,阿托伐他汀组细胞侵袭及迁移能力均明显降低,E-cadherin蛋白表达明显升高,β-catenin、Twist、PI3K和p-AKT蛋白表达明显降低（P<0.05）。结论:阿托伐他汀可抑制结肠癌细胞的侵袭和迁移能力,机制可能与抑制EMT及PI3K/AKT信号通路有关。     

沉默LIMK1抑制人结肠癌SW480细胞上皮-间质转化

目的:研究沉默LIMK1对人结肠癌SW480细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）的影响。方法:RT-PCR、Western blot、免疫荧光与免疫组化检测沉默LIMK1对EMT相关分子表达的影响。裸鼠实验检测沉默LIMK1对移植瘤生长的影响。结果:RT-PCR检测显示,沉默LIMK1可下调Vimentin和上调E-cadherin mRNA表达(P<0.05)。Western blot显示,沉默LIMK1可明显下调SW480细胞Snail及Vimentin蛋白表达和上调E-cadherin表达(P<0.05)。免疫荧光显示,LIMK1沉默细胞Snail与Vimentin阳性信号较对照组明显减弱,而E-cadherin阳性信号显著增强。裸鼠实验结果显示,沉默组肿瘤生长速度较SW480组明显减慢(P<0.05)。沉默组移植瘤瘤重（0.16±0.079）g较SW480组（0.86±0.165）g明显减少,瘤重抑制率为97.7%(P<0.05)。LIMK1沉默组移植瘤较对照组的Ki-67、Vimentin、Snail与CD34阳性表达明显减弱,而E-cadherin表达明显增加。结论:沉默LIMK1可体外抑制人结肠癌SW480细胞EMT。     

血管内皮诱导培养基促进结肠癌细胞向血管内皮细胞方向分化的研究

  目的   探讨结肠癌细胞在血管内皮诱导环境下向血管内皮细胞方向分化的潜能。   方法   将3种不同分化程度的结肠癌细胞HCT116、SW480和HT29分别置于含有内皮细胞诱导因子的条件培养基中培养15 d后，利用Western blot检测血管内皮特异性指标白细胞分化抗原31（cluster of differentiation 31，CD31）和白细胞分化抗原34（cluster of differentiation 34，CD34）的表达变化；利用细胞免疫荧光检测HCT116细胞在内皮诱导培养基及普通培养基中CD31、CD34的表达变化；通过三维培养观察内皮诱导培养基对HCT116细胞体外成管能力的影响。   结果   Western blot显示诱导培养15 d后的3种细胞中低分化HCT116细胞的CD31、CD34表达增强最明显，而中分化的SW480细胞和高分化的HT29变化不显著。细胞免疫荧光显示与普通培养基相比，内皮诱导培养基中HCT116细胞的CD31、CD34表达显著增强。体外三维培养发现经内皮诱导培养后的HCT116细胞较对照细胞成管能力显著增强。   结论   血管内皮诱导培养基促进具有较强干细胞样特性的结肠癌细胞向血管内皮细胞方向分化。      

PTTG1促进结肠癌SW480细胞侵袭和迁移的作用机制

目的 研究垂体肿瘤转化基因 1（pituitary tumor transforming gene 1, PTTG1）过表达促进人结肠癌细胞SW480侵袭和迁移作用及其可能机制。方法 采用脂质体转染法将pcDNA3.1(+)-PTTG1及空载pcDNA3.1(+)转染人结肠癌SW480细胞,G418法筛选阳性克隆。Western blot和Real-time PCR法鉴定稳定过表达PTTG1细胞株建立。Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移能力,Western blot检测MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin和Snail的表达。结果 （1）成功获得稳定高表达PTTG1的SW480克隆细胞株PTTG1-SW480;（2）过表达PTTG1基因后,SW480细胞侵袭和迁移能力增强,MMP2和MMP9表达升高,上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）标记分子E-cadherin表达降低,Vimentin和Snail的表达升高,差异均有统计学意义（P<0.01）;（3）过表达PTTG1基因后,SW480细胞中PI3K/AKT信号活化增强,使用LY29400干预后,抑制细胞侵袭、迁移和EMT,E-cadherin表达上调、Vimentin和Snail的表达下调,差异均有统计学意义（P<0.01）。结论 PTTG1基因过表达可能通过活化PI3K/AKT信号诱导SW480细胞EMT发生,发挥促进SW480侵袭和迁移作用;提示PTTG1蛋白可能成为结肠癌治疗的一个潜在靶点。     

miR-140-5p调控Nrf2影响结肠癌细胞5-FU耐药性

目的 观察miR-140-5p对结肠癌耐药细胞株SW480/5-FU及其亲本细胞株SW480 5-FU敏感性的影响及其与核因子NF-E2相关因子2（NF-E2-related factor 2,Nrf2）的关系,探讨miR-140-5p调控结肠癌细胞5-FU耐药的可能机制。 方法 用结肠癌细胞株SW480构建结肠癌耐药细胞株SW480/5-FU,qRT-PCR法检测两株细胞中miR-140-5p的表达,CCK-8法和细胞集落形成实验评估miR-140-5p对两株细胞5-FU敏感性的影响;采用qRT-PCR法、Western blot法双荧光素酶报告基因验证miR-140-5p与Nrf2的关系,CCK-8法、细胞集落形成实验探讨miR-140-5p调控结肠癌细胞5-FU敏感性与Nrf2的关系。 结果 成功构建结肠癌耐药细胞株SW480/5-FU,其miR-140-5p表达水平显著低于亲本细胞株SW480（P＜0.05）;CCK-8法、细胞集落形成实验结果显示,miR-140-5p可增强SW480/5-FU细胞对5-FU的敏感性,而降低SW480对5-FU的耐药性;qRT-PCR法、Westren blot法、双荧光素酶报告基因实验共同证实miR-140-5p可结合并抑制Nrf2的表达;CCK-8、细胞集落形成实验表明,Nrf2过表达能逆转miR-140-5p对结肠癌耐药细胞SW480/5-FU的5-FU敏感性调控结果。结论 miR-140-5p可能通过结合并抑制Nrf2表达,增加结肠癌耐药细胞株SW480/5-FU对5-FU的敏感性。     

DADS通过Rac1-ADF/cofilin1通路抑制人结肠癌SW480 细胞迁移与侵袭

  目的   研究二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）通过Rac1-ADF/cofilin1通路对人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭的作用。  方法  划痕愈合和侵袭实验分别检测DADS对SW480细胞迁移与侵袭的影响；RT-PCR与Western blot检测DADS对SW480细胞Rac1-ADF/cofilin1信号分子表达的作用。  结果  40与50 mg/L DADS处理SW480细胞24 h后，穿膜细胞分别减少57.12%与64.59%（P < 0.05）。处理48 h细胞迁移率分别为23.23%与12.87%，较对照组75.86%明显降低（P < 0.05）。RT-PCR显示，45 mg/LDADS处理SW480细胞24、48h后，与对照组比较Rac1、Rock1、PAK1、LIMK1和destrin mRNA分别显著下调（P < 0.01）；而cofilin1 mRNA无显著性差异（P>0.05）。Western blot显示，45 mg/L DADS处理SW480细胞6、12、24、48 h后，与对照组比较Rac1、Rock1、PAK1、LIMK1和destrin蛋白分别呈时间依赖性下调（P < 0.05），但cofilin1蛋白无显著性差异（P>0.05），而p-LIMK1和p-cofilin1表达分别呈时间依赖性下调（P < 0.05）。  结论   DADS可通过Rac1-ADF/cofilin1通路下调Rac1、Rock1、PAK1、LIMK1、p-LIMK1、destrin与p-cofilin1抑制SW480细胞迁移与侵袭。      

丙戊酸通过上皮钙黏蛋白的核移位诱导结肠癌细胞EMT的作用

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）抑制剂丙戊酸（valproic acid,VPA）对结肠癌细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用。方法：以结肠癌细胞系DLD-1、HCT116、SW480 和HT29 为研究对象,用MTT法检测不同浓度（0.5、5 mmol/L) VPA对结肠癌细胞增殖的影响,用Western blotting 检测细胞EMT相关蛋白上皮钙黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（vimentin）的表达水平,免疫荧光染色法检测上皮钙黏蛋白和波形蛋白表型的变化,划痕愈合与Transwell侵袭实验检测结肠癌细胞的迁移与侵袭能力。结果：不同浓度VPA作用4 种结肠癌细胞48 h,低浓度VPA（0.5 mmol/L）对4 种结肠癌细胞增殖几乎无影响,取0.5 mmol/L为实验浓度。0.5 mmol/L VPA作用后,结肠癌细胞上皮钙黏蛋白表达水平显著下降（P<0.05）但波形蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;0.5 mmol/L VPA处理组细胞的上皮钙黏蛋白出现膜衰减和核移位,以及波形蛋白含量显著增加,上述反应在6 h 后开始且可维持24 h;0.05 mmol/L的VPA处理可增强结肠癌细胞的迁移和侵袭能力。结论：低浓度VPA可通过上皮钙黏蛋白的核移位诱导结肠癌细胞EMT的发生且明显增强细胞的迁移侵袭能力,因此在结肠癌中选择HDAC抑制剂作为一个新型抗癌药物之前应谨慎。     

化疗后残余胃癌细胞发生上皮间质转化的体外研究

  目的  观察体外化疗能否诱导胃癌细胞发生上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）。   方法  使用5-Fu（30 μg/mL）对胃癌细胞株SGC7901进行4个疗程的体外化疗,残余细胞继续培养,得到能稳定传代的细胞SGC7901/Fu。比较SGC7901及SGC7901/Fu在细胞形态、EMT标记物、化疗耐药性、侵袭能力、肿瘤干细胞特性等方面的差异。   结果   与SGC7901比较,SGC7901/Fu呈间质细胞形态、上皮表型标记物表达下调、间质表型标记物表达上调。在SGC7901细胞及SGC7901/Fu细胞中,5-Fu的中效浓度（IC₅₀）分别为（43.8±7.2）μg/mL及（64.6±5.5）μg/mL,穿过Transwell小室基底膜的细胞数分别为（51.4±8.7）个及（93.2±9.5）个,克隆形成率分别为5.2%±1.0%及13.2%±2.2%,CD44+/CD24-细胞亚群所占比例分别为4.13%±0.81%及7.97%± 0.50%,两者间的差异均具有统计学意义（P<0.05）。   结论  体外化疗后残余的胃癌细胞发生EMT,同时细胞侵袭能力增强、化疗耐药性升高,并获得了肿瘤干细胞特性。      

TRPM8激活Calcineurin-NFATc3通路调节结肠癌细胞免疫逃逸

目的  探讨TRPM8调节结肠癌细胞免疫逃逸的机制。方法 采用qRT-PCR和Western blot检测结肠癌细胞系SW620和正常人结肠上皮细胞系CCD 841 CoN中TRPM8的表达水平。将干涉和过表达TRPM8载体TRPM8 siRNA和pcDNA3.1-TRPM8转染至SW620细胞，并设置相应对照组（Control siRNA组和pcDNA3.1组），用CCK-8、集落形成实验和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡，酶标仪检测Calcineurin活性，Western blot检测Calcineurin-NFATc3信号通路相关蛋白的表达。采用CCK-8检测CD8⁺T细胞与SW620细胞共孵育的细胞活力，Western blot检测Calcineurin特异性抑制剂FK506处理SW620细胞后NFATc3和PD-L1蛋白表达。结果 与CCD 841 CoN细胞相比，TRPM8 mRNA和蛋白在SW620细胞中的表达均增加（P<0.01）。与Control siRNA组比较，干涉 TRPM8表达后SW620细胞活力、细胞增殖能力、Calcineurin活性，以及TRPM8、PD-L1和 NFATc3蛋白表达均降低（P<0.01），而细胞凋亡率和p-NFATc3蛋白表达均升高（P<0.01）；过表达TRPM8可增强细胞活力、细胞增殖能力和Calcineurin活性，上调TRPM8、PD-L1及NFATc3蛋白表达（P<0.01），下调p-NFATc3蛋白表达（P=0.002）。CD8⁺ T细胞与干涉TRPM8表达的SW620细胞共孵育后总细胞活力降低（P=0.002），而与过表达SW620细胞共孵育后总细胞活力增强（P=0.005）。FK506处理可抑制SW620细胞Calcineurin活性，下调NFATc3、PD-L1蛋白表达（P<0.01）。结论 TRPM8过表达可能通过激活Calcineurin-NFATc3信号通路而促进PD-L1表达，从而增强结肠癌细胞免疫逃逸能力，促进结肠癌细胞增殖。     

结肠癌细胞通过Fas/FasL诱导淋巴细胞发生凋亡

背景与目的:研究发现,肿瘤组织中Fas配体阳性表达区肿瘤浸润淋巴细胞的凋亡率比FasL阴性区高,推测肿瘤细胞可通过增加表达FasL来杀伤肿瘤浸润淋巴细胞。本研究拟在体外验证结肠癌细胞SW480是否可以诱导淋巴细胞发生凋亡。方法:结肠癌细胞系SW480(效应细胞)与对Fas介导凋亡敏感的Jurkat细胞(靶细胞)共培养,分为3种效靶比20∶1,10∶1,5∶1。生长曲线法、流式细胞术、荧光显微镜观察分别检测Jurkat细胞的凋亡情况。结果:流式细胞仪检测结果显示,SW480接种浓度为0(对照)、0.5×105/ml、1×105/ml、2×105/ml时,Jurkat细胞凋亡率为(1.8±0.21)%、(5.49±0.17)%、(11.18±0.14)%、(18.22±0.11)%。荧光显微镜观察结果表明,SW480接种浓度为0(对照)、0.5×105/ml、1×105/ml、2×105/ml时,Jurkat细胞凋亡率为(1.58±0.12)%、(5.22±0.13)%、(9.74±0.21)%、(19.33±0.18)%。3种效靶比条件下,SW480细胞均能诱导Jurkat细胞发生凋亡。随着SW480接种浓度的升高及共培养作用时间的延长,Jurkat细胞凋亡率逐渐增加。每个实验组与对照组相比,P值均小于0.01。结论:结肠癌细胞SW480可以通过Fas系统诱导淋巴细胞发生凋亡,这为结肠癌的免疫逃逸、反击机制提供了又一证据。     

基因沉默HIF-1α在结直肠癌SW480细胞的缺氧与上皮-间质转化中的作用

目的通过基因沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α),研究其对结直肠癌SW480细胞的生长增殖、侵袭迁移能力,及对锌指转录因子(Snail)与上皮钙黏蛋白(E-cadherin)表达的影响和作用。方法利用氯化钴(CoCl2)化学诱导建立结直肠癌SW480细胞的缺氧模型,设计合成HIF-1α的小干扰RNA(HIF-1α-siRNA)并将其转染入细胞内。通过四甲基偶氮唑兰(MTT)法检测细胞的体外生长增殖活性,体外侵袭实验(Transwell法)检测细胞的体外侵袭迁移力,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫蛋白印迹(Western blot)检测细胞中HIF-1α、Snail及E-cadherinmRNA与蛋白的表达情况。结果 MTT法检测结果显示,缺氧条件下,基因干扰组的OD值及细胞存活率均降低(P<0.05);体外侵袭实验结果显示,基因干扰组侵袭迁移率降低(P<0.05);RT-PCR与Western blot检测结果显示,基因干扰组中HIF-1α和Snail mRNA和蛋白的表达明显降低,E-cadherin mRNA和蛋白的表达明显增强(P<0.05),对3种因子进行相关性分析,结果显示HIF-1α和Snail的表达呈正相关,HIF-1α和Snail均与E-cadherin的表达呈负相关(P<0.05)。结论 RNA干扰沉默HIF-1α基因可抑制结直肠癌SW480细胞的体外生长增殖和体外侵袭迁移能力,其机制可能是由于基因沉默HIF-1α导致细胞中Snail低表达,E-cadherin高表达,抑制了EMT发生、发展所致。     

EMT介导口腔鳞癌淋巴结转移及其机制研究

  目的  探讨EMT在口腔鳞癌淋巴结转移中的作用及其调控机制。   方法  应用免疫组织化学SP法检测CXCR4及EMT相关因子在60例口腔鳞癌中的的表达,应用χ2或Fisher确切概率法分析各指标与口腔鳞癌患者临床病理资料的关系、Spearman相关性分析CXCR4与EMT相关因子的相关性。   结果   χ2或Fisher确切概率法检验显示CXCR4、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Twist、Snail在淋巴结转组与非淋巴结转移组中表达的差异有统计学意义（P < 0.05）,且CXCR4与分化程度有关,β-catenin与分化程度及T分期有关,E-cadherin与原发部位及分化程度有关,Twist与分化程度有关（P < 0.05）。Spearman分析显示β-catenin的表达与CXCR4呈负相关,相关系数为-0.497;Snail、Twist、N-cadherin的表达与CXCR4呈正相关,相关系数分别为0.256、0.300、0.333（P < 0.05）。   结论   提示EMT在口腔鳞癌的淋巴结转移过程中发挥重要作用,CXCL12/CXCR4生物学轴可能作用于EMT的某个环节,并调控其发生      

Twist 和Snail 在滑膜肉瘤中的表达*

目的:检测上皮- 间充质转换的转录因子Twist和Snail在滑膜肉瘤组织中的表达,分析二者之间关系及其对滑膜肉瘤远处转移的影响,并探讨其预后意义。方法:通过组织病理学观察和免疫组织化学染色,检测133 例滑膜肉瘤组织标本中Twist和Snail的表达情况,应用统计学软件SPSS13.0 分析二者的不同表达与各临床病理参数特点的关系,并作Kaplan Meier生存分析。结果:Twist和Snail在滑膜肉瘤组织中表达部位为细胞质和/或细胞核,133 例组织标本中Twist高表达者55例（55/133）且与组织学分型、临床分期以及融合基因类型有关（P<0.05）;Snail高表达者82例（82/133）,与组织学分型有关（P<0.05）。 二者的表达与不同性别、年龄、肿瘤大小、部位、组织学分级等无关（P>0.05）。 Twist和Snail在滑膜肉瘤组织中的表达存在正相关（r s=0.191,P=0.027）,Log-Rank test 显示Twist高表达组,患者总生存期和无转移生存期明显低于低表达组,差异有统计学意义（χ2=8.620,P=0.03和χ2=11.462,P=0.001）;Snail高表达组,患者无转移生存期明显低于其弱表达者,差异有统计学意义（χ2=4.575,P=0.032）,但两组的总生存期差异无统计学意义（χ2=0.602,P=0.438）;且二者联合表达组患者总生存期和无转移生存期明显低于其弱表达组,差异有统计学意义（χ2=13.619,P=0.003 和χ2=15.548,P=0.001）。 结论:滑膜肉瘤组织中存在EMT 的主要转录因子Twist和Snail的高表达,二者可独立诱导EMT ,且二者的联合表达更加促进肿瘤转移的发生,提示患者预后不良。      

乳腺癌中P53的表达与上皮-间质转化的相关性及其临床意义

  目的   探讨乳腺癌组织中P53的表达和上皮-间质转化（EMT）的相互关系及其临床意义。方法:免疫组织化学法检测63例乳腺癌组织中P53、Twist、Snail、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Fibronectin的表达情况，分析乳腺癌突变型P53蛋白表达与临床病理特征，患者预后和EMT发生之间的关系。   方法   免疫组织化学法检测63例乳腺癌组织中P53、Twist、Snail、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Fibronectin的表达情况，分析乳腺癌突变型P53蛋白表达与临床病理特征，患者预后和EMT发生之间的关系。   结果   P53、Twist和Snail的阳性率以及EMT的发生率分别为44.4%（28/63）、54.0%（34/63）、68.3%（43/63）和41.3%（26/63）。乳腺癌P53表达与组织学分级相关（P < 0.05），与其他临床病理特征无关（P>0.05）。P53与Twist、Snail的表达存在相关性，而Twist、Snail和EMT发生相关（P < 0.05）。多因素分析显示，淋巴结转移、P53和EMT是乳腺癌患者预后的独立影响因素。   结论   P53的表达与乳腺癌组织学分级和EMT的发生相关，是患者预后的独立影响因素，可作为乳腺癌治疗的重要靶点。