人白细胞介素2基因转移表达及抗乙型肝炎病毒和诱导LAK细胞活性…

为了探讨白细胞介素－２转基因表达抗乙型肝炎病毒的作用，应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＳＶ（Ｘ）－包装细胞系ＰＡ３１７基因转移系统，研究了ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移和表达，以及抗ＨＢＶ和诱导淋因子激活的杀伤细胞的作用。     

白细胞介素2,4及肿瘤坏死因子对LAK细胞活性的影响

为了提高淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）对乙肝病毒感染细胞的杀伤活性，研究了白细胞介素２（ＩＬ２），白细胞介素４（ＩＬ４）和肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）单独及不同组合时，所诱生的ＬＡＫ细胞对ＨｅｐＧ２细胞和２２ｌ５细胞的杀伤活性，并初步研究了ＬＡＫ细胞的活化及杀伤机制。结果表明：三种细胞因子的组合诱导较两种细胞因子组合好，而两两组合又较单独诱导好；另外，ＩＬ２单独诱导时，随其剂量的增加，细胞表面ＩＬ２受体（ＩＬ—２Ｒ）表达量也增加，细胞内溶酶体含量也增加，其对靶细胞的杀伤活性也增加，均呈正相关。提示ＩＬ—２Ｒ和溶酶体可能参与ＬＡＫ细胞的活化和杀伤机制。     

rIL－2激活的小鼠粘附性LAK细胞抗瘤活性和扩增的研究

小鼠脾脏淋巴细胞在体外ｒＩＬ－２培养下，可粘附到塑料板或玻璃瓶上，在除去非粘附性淋巴细胞后，粘附性ＬＡＫ细胞（Ａ－ＬＡＫ）在ｒＩＬ－２存在的条件下，４天内可迅速扩增３６倍，与ＬＡＫ细胞抗瘤活性相比，Ａ－ＬＡＫ细胞抗瘤活性明显增强，培养２０天后其抗瘤活性仍可达３３％，从形态学分析，Ａ－ＬＡＫ细胞主要由大颗粒淋巴细胞组成。     

白细胞介素—2与LAK细胞

自从1976年由 Morgan 等发现白细胞介素—2(IL—2)以来,尤其是 Rosenberg等首次报道用过继性免疫疗法治疗25例常规疗法治疗无效的晚期肿瘤患者的临床效果以来,许多研究者投身于此热点领域,而且取得了一定的效果。目前国内基因工程产品重组白细胞介素—2(rIL—2),已进入Ⅱ期临床试验阶段,这将为我国临床     

白细胞介素2和LAK细胞治疗微小残留白血病的实验研究

白细胞介素２和ＬＡＫ细胞治疗微小残留白血病的实验研究张乐萍，殷慧君，毛宁，周生淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）与白细胞介素２（ＩＬ２）合用治疗部分晚期实体肿瘤已取得显著效果。我们曾在建立小鼠淋巴细胞白血病Ｌ７８ｌｌ微小残留病变模型的基础上观察到单...     

体外诱导LAK细胞活性方法及其意义

目的：比较不同诱导方法对LAN细胞杀伤活性的影响。方法：外周血单个核细胞（PBMC）用重组白细胞介素-2（rIL-2）体外诱导LAK细胞，采用3H－TdR释放法测定LAK活性。结果；（1）PBMC诱导3h后，LAK活性高于或至少不低于24～72h者；（2）PBMC诱导3h后洗去游离的rIL-2，并不影响继续诱导LAN细胞活性；（3）PBMC分离后以清洗2次为佳；（4）PBMC用正常人血浆培养比用肝炎病人自体血浆培养诱导的LAK活性高。结论：在本试验系统中，PBMC分离后，清洗2次，以正常人血浆经IL-2诱导3h为最佳回输条件。     

重组白细胞介素－2治疗晚期肺癌和肺转移癌

观察了应用小剂量重组白细胞介素－２（ＩＬ－２）静脉点滴治疗晚期肺癌，胸腔内注射治疗肺转移癌。在治疗前后分别测定其自然杀伤细胞（ＮＫ）和淋巴因子活化杀伤细胞（ＬＡＫ）活性。结果显示小剂量ＩＬ－２静脉点滴治疗晚期肺癌有一定疗效，治疗后ＮＫ活性和ＬＡＫ活性显著升高。     

慢性乙型肝炎自体LAK细胞回输前后IL—2变化的意义

目的探讨ＬＡＫ细胞治疗慢性乙型肝炎的机制。方法应用生物学方法检测ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶＤＮＡ均阳性慢乙肝患者治疗前后ＩＬ－２水平。结果４０例患者治疗后ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶＤＮＡ阴转率分别为４０．４％和６８．６％。治疗前ＩＬ－２水平低于对照组（Ｐ＜０．００１），治疗后有显著提高（Ｐ＜０．００５）。依ＨＢＶ标记阴转情况分组：１组ＨＢｅＡｇ（－）、ＨＢＶＤＮＡ（－）１６例；２组ＨＢｅＡｇ（＋）、ＨＢＶＤＮＡ（－）９例；３组ＨＢｅＡｇ（＋）、ＨＢＶＤＮＡ（＋）１５例。１、２组治疗前ＩＬ－２均低于对照组（Ｐ＜０．００１），治疗后均明显提高（Ｐ＜０．００５，Ｐ＜０．０１）。３组治疗前ＩＬ－２与对照组比较无明显降低（Ｐ＞０．０５），治疗前后无显著差异（Ｐ＞０．０５），治疗后ＩＬ－２比对照组低（Ｐ＜０．０２）。结论ＩＬ－２水平明显降低的慢性乙型肝炎采用ＬＡＫ细胞回输治疗ＨＢＶ标记阴转率高。     

白细胞介素2—乙型肝炎病毒前S抗原融合蛋白的免疫原性研究

目的　为协同人白细胞介素（ＩＬ－２）与乙型肝炎（乙肝）病毒（ＨＢＶ）前Ｓ抗原的生物学功能，探索治疗慢性乙肝的特异性免疫药物。方法用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和基因重组技术构建了ＨＢＶ完整前Ｓ抗原和ＩＬ－２的嵌合基因，并在大肠杆菌中高效表达了ＩＬ－２－前Ｓ抗原融合蛋白。结果该融合蛋白保留了ＩＬ－２和前Ｓ抗原天然分子的生物学活性，能维持白细胞介素２依赖株细胞增殖，其比活性约１０~７Ｕ／ｍｇ蛋白。该融合蛋白能与前Ｓ１和前Ｓ２单克隆抗体结合及与多聚人血清白蛋白（ＰＨＳＡ）结合，说明其具有相应抗原表位及受体。其诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠产生抗前Ｓ抗体的效价分别是单独的前５抗原、前Ｓ抗原与ＩＬ－２的混合物及ＭＳ－２－前Ｓ融合分子的１３、９和１１倍多。结论ＩＬ－２．前Ｓ抗原融合蛋白能增强前Ｓ抗原的免疫原性，促进机体的免疫应答；另外，ＩＬ－２－前Ｓ抗原融合蛋白在人体内具有双重导向作用，可能成为新一代慢性乙肝和肝癌的免疫治疗剂。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在昆虫细胞中表达产物的鉴定

目的 :在昆虫细胞中表达乙型肝炎病毒 ( HBV)的表面抗原。方法 :利用已构建的含有 HBV S基因的重组杆状病毒 Bac- S,在昆虫细胞中进行表达 ,并用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹对表达产物进行检测。结果 :重组杆状病毒感染昆虫细胞后 ,可表达相应大小的 S蛋白 ,且该蛋白可被 HBs Ag特异性单抗 ( m Ab)所识别。结论 :利用杆状病毒表达系统 ,成功地表达了具有生物学活性的 HBV S蛋白。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的分离培养及功能研究

目的　研究慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞 (DC)免疫诱导T淋巴细胞增殖的能力及其与DC免疫功能的相关性。方法　慢性乙型肝炎患者 1 0例 ,从外周血中分离单个核细胞 ,在含rhGM -CSF、rhIL - 4、TNF -α的完全培养基中诱导培养为DC ,并与同种异体T细胞作用 ,用液体闪烁仪观察DC对T细胞增殖的作用。另选取健康成人 1 0例作为正常对照。结果　慢性乙型肝炎患者组DC其诱导同种异体T淋巴细胞增殖的能力每分钟液闪计数 (cpm为 1 0 635± 876) ,明显低于正常对照组 (cpm为 42 91 8±7889,P <0 .0 1 )。结论　慢性乙型肝炎患者外周血DC免疫功能低下     

应用RNA干扰技术抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,观察其对HBV复制和表达的影响。方法 将构建成功的pSIHBV／C与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞,转染后24、48、72h,用Abbott试剂检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,并用免疫荧光染色法观察细胞内病毒核心抗原和表面抗原的表达。结果 成功构建了针对HBV核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,并发现它能明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌,转染后第2天抑制率达高峰,分别为92％、85％,而随机序列的siRNA无此作用。免疫荧光染色结果也证实转染24b后,随pSIHBV／C比例的升高,其对HBV抗原表达的抑制作用也随之增加,当pSIRNA／C与pHBV1．3比例为1：20时,pSIHBV／C对细胞内HBsAg和HBcAg表达的抑制作用最强。结论 乙型肝炎病毒核心区的siRNA具有显著和特异的抗HBV复制和表达的作用。     

干扰素α治疗对慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞抗原提呈作用的影响

目的　探讨干扰素α治疗对慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞 (DC)抗原提呈作用的影响。方法　分别采集 2 3例慢性乙型肝炎患者干扰素α治疗前和治疗满 4个月时的抗凝外周静脉血 ,分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,在重组人白细胞介素 4和重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子的作用下培养 7d使DC增殖、成熟 ,随后与HBsAg共同孵育 3h ,丝裂霉素C处理后再分别与自体PBMC共同培养 72h ,培养结束前 1 2h加入 7 4× 1 0 4Bq3 H TDR ,收集细胞测定cpm值。实验中以 8名正常健康人作为对照。结果　干扰素α治疗 4个月时慢性乙型肝炎患者DC的增殖水平明显高于治疗前 ,在相同培养条件下 ,细胞总量平均增加了 2 .8倍 ;治疗前DC的抗原提呈作用显著低于健康对照组和治疗后组 (均为P <0 .0 0 1 ) ,治疗 4个月时DC的抗原提呈作用与健康对照组之间差异无显著意义 (P >0 .0 5 ) ;进一步分析发现 ,与无应答组比较 ,完全应答组不论是治疗前还是治疗后 ,DC的抗原提呈作用均显著增强 (P <0 .0 1和P <0 .0 0 1 ) ,而部分应答组与无应答组之间差异无显著意义(P >0 .0 5 )。结论　慢性乙型肝炎患者外周血DC的抗原提呈能力低下 ,干扰素α治疗可显著提高DC的抗原提呈作用 ,并且DC的抗原提呈能力似乎与患者对干扰素α的应答密切相关     

广西汉族IL-10启动子区基因多态性与HBV易感性及感染转归的关系

目的探讨白细胞介素-10(IL-10)基因启动子区-592A/C、-1082G/A位点单核苷酸多态性与乙型肝炎病毒(HBV)易感性及后临床转归之间的关系。方法 256例慢性HBV感染者,其中乙型肝炎肝硬化59例,慢性乙型肝炎151例,慢性HBV携带46例,以52例健康体检者作为对照组。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)技术,检测各组IL-10基因启动子区-592A/C、-1082G/A位点基因型及等位基因分布频率。结果肝硬化组、肝炎组、携带组与对照组的IL-10-592A/C位点AA、AC、CC基因型及A、C等位基因分布频率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);IL-10-1082G/A位点GG、GA和AA基因型分布频率比较,差异有统计学意义(P<0.05),AA基因型频率分布依次为肝硬化组>肝炎组>携带组>对照组(P<0.05);各组IL-10-1082G/A位点G、A等位基因频率比较,差异有统计学意义(P<0.05),肝硬化组的A等位基因频率分布最高,其余依次为肝炎组、携带组及健康对照组(P<0.05)。不同HBV-DNA水平组的IL-10-592A/C、IL-10-1082G/A两位点基因型及等位基因分布频率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论IL-10-1082G/A位点AA基因型及A等位基因可能与广西汉族人群HBV易感性及其临床结局有关;而IL-10基因启动子区-592A/C、-1082G/A位点多态性可能与广西汉族人群感染HBV后的病毒复制水平无明显关系。     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

Expression of co-stimulatory molecules B7-2 and PD-L1 on peripheral blood mononuclear cells in patients with chronic hepatitis B virus infection

Objective

To explore the roles of the expression of the co-stimulatory molecule, B7-2, and the co-inhibitory molecule, PD-L1, on peripheral blood mononuclear cells in the mechanism of immunotolerance in chronic hepatitis B virus infection.

Methods

Thirty HBV infected patients in the immunoreactive phase and 20 patients in the immunotolerant phase were enrolled in the study, while 20 healthy volunteers were used as controls. RT- PCR and real-time PCR methods were used to detect the expression levels of B7-2 and PD-L1 mRNA in peripheral blood mononuclear cells in chronic HBV infected patients.

Results

The B7-2 expression in immunoreactive and immunotolerant patients was significantly lower than that in the controls (P all < 0.01); B7-2 expression in immunoreactive patients was significantly lower than in immunotolerant patients (P < 0.01). PD-L1 expression in immunoreactive patients and immunotolerant patients was significantly higher than that in normal controls (P all < 0.01). The PD-L1/B7-2 ratios in immunoreactive and immunotolerant patients were significantly higher than that of the healthy controls (P all < 0.01); the PD-L1/B7-2 ratio was significantly higher in the immunoreactive patients than in the immunotolerant patients (P < 0.01).

Conclusion

In chronic HBV infection, changes in the expression of co-stimulatory and co-inhibitory molecules imply a protective adjustment against the patient's immune response that may result in increased immunotolerance and persistent HBV infection.     

乙型肝炎表面抗原基因重组2型腺相关病毒的免疫原性研究

目的观察含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的2型重组腺相关病毒(rAAV-2-HBsAg)在Balb/c小鼠体内的免疫原性。方法以5×1011的重组病毒颗粒单次注射Balb/c小鼠,RT-PCR扩增肝脏组织中HBsAg基因cD-NA:ELISA检测肝组织中HBsAg的表达;RIA法检测血清中表面抗体(抗一HBs)滴度;51Cr释放分析检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果外源性HBsAg基因己整合到肝细胞染色体DNA并有效地转录和翻译,表达水平最高可达33.8pg/(mglivertissue),rAAV-HBsAg免疫小鼠后可以诱导机体产生表面抗体并激发特异性CTL。结论外源性HBsAg基因可以转移到小鼠肝细胞并稳定表达;rAAV-2-HBsAg免疫小鼠可以同时诱导体液和细胞免疫反应的出现。提示基于rAAV-2载体的乙型肝炎(HBV)疫苗,对于防止HBV感染,尤其是作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗可能只有潜在的应用价值,值得做进一步的系统研究。