结晶型硫化镍及反式-BPDE恶性转化16HBE细胞hMSH2基因甲基化的研究

背景与目的： 对结晶型硫化镍(Nickel sulfide,NiS)及反式二氢二醇环氧苯并芘(anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo[a] pyrene,BPDE)恶性转化及成瘤的人支气管上皮细胞(Human bronchial epithelial,16HBE)hMSH2基因启动子甲基化状况及其mRNA表达进行研究,探讨镍及反式-BPDE的表遗传致癌机制。材料与方法： 采用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)法和RT-PCR法检测结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子甲基化状况及其mRNA表达,与非转化的16HBE细胞进行比较;并用去甲基化因子5-Azac(5-Aza-2′-deoxycytidine)处理有异常甲基化的细胞。 结果： 发现结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子区存在CpG岛的高甲基化;与非转化16HBE细胞比较,转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因mRNA表达下降;有异常甲基化的细胞经去甲基化处理后甲基化消失。结论： 结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子区CpG岛的高甲基化使其mRNA表达下降,并可能导致hMSH2基因表达抑制,这可能是结晶型NiS及反式-BPDE诱导16HBE细胞转化和成瘤的一种表遗传致癌机制。甲基化的可逆性对今后研究其表型逆转以及药物治疗提供了重要依据。     

LncRNA PCA3在甲基丙烯酸环氧丙酯诱导16HBE恶性转化细胞中的表达及意义

目的:探讨长链非编码RNA PCA3(LncRNA PCA3)在甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱导的16HBE恶性转化细胞中的表达水平及意义。方法:收获经8 μg/mL GMA诱导的第30代16HBE恶性转化细胞及同代龄DMSO溶剂对照组细胞,应用高通量LncRNA芯片比较两组样本表达谱的差异,通过差异倍数、邻近编码基因信息分析等策略初步筛选出16HBE恶性转化细胞中LncRNA PCA3及其最可能的相关蛋白编码基因PRUNE2,采用实时荧光定量PCR(qPCR)和全基因组表达谱芯片分析LncRNA PCA3和PRUNE2的表达量,并与同代龄DMSO对照组细胞比较。结果:LncRNA芯片结果显示,与同代龄DMSO组相比,GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中LncRNA PCA3上调7.17倍,PRUNE2下调2.54倍;qPCR结果显示,与同代龄DMSO组[(1.36±0.44)×10^-5]相比,GMA诱导的恶性转化细胞[(2.67±0.63)×10^-5]中LncRNA PCA3表达上调(P<0.05);全基因组表达谱芯片显示,16HBE恶性转化细胞的PRUNE2表达量(10.95)较DMSO组(19.46)明显下调,与LncRNA芯片结果一致。结论:LncRNA PCA3可作为GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中相关特异分子标志之一。     

甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞恶性转化过程中DNMT1及MBD1基因表达的变化

目的：分析甲基丙烯酸环氧丙酯（glycidyl methacrylate,GMA）致人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中不同时点甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白家族基因的表达差异,初步探讨GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化的表观遗传机制。方法：采用人类全基因组表达谱芯片筛选GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白家族的差异表达基因,并采用实时定量PCR（Real time PCR）技术检测筛选所得差异基因DNMT1及MBD1 mRNA的表达情况。结果：芯片结果显示在转化第10代（前期）细胞中DNMT1及MBD1基因较同代龄对照细胞表达上调,实时定量PCR进一步确证DNMT1及MBD1基因表达分别上调80.60%、79.10%,与芯片结果一致。结论：甲基化可能是GMA致16HBE细胞发生恶性转化的一种机制,DNMT1及MBD1基因可能是多个甲基化相关基因转录表达下调的关键调控点,其在GMA致16HBE细胞恶性转化过程中起着重要作用。     

叶绿酸抗细胞恶变相关cDNA序列的克隆

目的:克隆叶绿酸抑制人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的相关差异表达cDNA序列。方法:以叶绿酸及反式-BPDE共同处理的16HBE细胞为实验细胞,以反式-BPDE单独处理的16HBE细胞为对照细胞,采用cDNA代表性差异分析法,比较2种细胞基因表达的差异,分离叶绿酸抗反式-BP-DE作用的相关差异表达cDNA片段。分离的片段分别与pGEM-T载体连接并转化入JM109细菌中,对质粒DNA进行测序。以BLASTN程序进行GenBank的同源性检索。结果:克隆的5条cDNA序列中,有3条为新基因序列,另2条分别与类S18/S6人核糖体蛋白及alpha-烯醇酶等有同源性。结论:克隆的5条cDNA序列所在的基因可能与叶绿酸抗细胞恶性转化分子机制密切相关。     

结晶型NiS诱发恶性转化细胞中的p16基因和FHIT基因的变化

目的 检测结晶型NiS诱发永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化过程中脆性组氨酸三联体基因(FHIT)和p16基因的变化,探讨镍化合物致癌的分子机制。方法 采用RT-PCR、DNA序列分析、银染PCR—SSCP方法检测恶性转化细胞、成瘤细胞中FHIT基因和p16基因的变化。结果 与对照组16HBE相比,转化细胞、成瘤细胞p16基因第2外显子、第2-3外显子末见突变,mRNA表达末见异常;FHIT基因第5,6,7,8外显子及第1-4外显子、第5-9外显子末见突变,但发现转化细胞、成瘤细胞FHIT基因的mRNA失表达或出现异常转录本;对其中FHIT基因第5-9外显子的一异常转录本测序分析显示,FHIT第6,7,8外显子缺失,第5,9外显子异常拼接,且中间插入一个36bp的小片段。结论 在结晶型NiS诱发16HBE恶性转化过程中,p16基因在DNA和mRNA水平末见异常改变,提示p16基因在镍致癌过程中可能不发挥作用;FHIT基因在mRNA水平出现缺失或异常转录本,表明FHIT基因在镍致癌过程中可能发挥一定作用;镍诱导的FHIT基因异常,可能是将外源致癌物、染色体脆性部位不稳定性和细胞恶变相联系起来的一个分子事件,FHIT基因可能是镍等外源致癌物作用的主要靶基因之一。     

叶绿酸抗细胞恶变相关cDNA序列的克隆

目的：克隆叶绿酸抑制人支气管上皮细胞系（16HBE）恶性转化的相关差异表达cDNA序列。方法：以叶绿酸及反式－BPDE共同处理的16HBE2细胞为实验细胞，以反式－BPDE单独处理的16HBE细胞为对照细胞，采用cDNA代表性差异分析法，比较2种细胞基因表达的差异，分离叶绿酸抗反式－BPDE作用的相关差异表达cDNA片段。分离的片段分别与pGEM-T载体连接并转化入JM109细菌中，对质粒DNA进行测序。以BLASTN程序进行GenBank的同源性检索。结果：克隆的5条cDNA序列中，有3条为新基因序列，另2条分别与类S18／S6人核糖体蛋白及alpha-烯醇酶等有同源性。结论：克隆的5条cDNA序列所在的基因可能与叶绿酸抗细胞恶性转化分子机制密切相关。     

Changes of TGF-β signal pathway in the process of 16HBE malignant transformation induced by glycidyl methacrylate

目的:分析甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate,GMA)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化过程中不同时点转化生长因子β (transforming growth factor beta,TGF-β)信号通路的改变,探讨GMA致16HBE细胞恶性转化的分子机制.方法:取经GMA染毒处理转化前期(第10代)、转化后期(第30代)及相应同代龄对照细胞,采用“人类全基因组表达谱芯片”分析不同时点转化细胞与同代龄对照细胞之间TGF-β信号通路的改变.结果:TGF-β信号通路在转化前期细胞与同代龄对照细胞之间的表达差异无统计学意义(P＞0.05),而转化后期细胞与同代龄对照细胞相比表达差异具有统计学意义(P＜0.05),且发现了11个差异表达的基因.结论:在GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中TGF-β信号通路可能发挥重要作用.     

TGF-β信号通路在甲基丙烯酸环氧丙酯诱导16HBE细胞恶性转化过程中的改变

目的:分析甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate,GMA)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化过程中不同时点转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)信号通路的改变,探讨GMA致16HBE细胞恶性转化的分子机制。方法:取经GMA染毒处理转化前期(第10代)、转化后期(第30代)及相应同代龄对照细胞,采用"人类全基因组表达谱芯片"分析不同时点转化细胞与同代龄对照细胞之间TGF-β信号通路的改变。结果:TGF-β信号通路在转化前期细胞与同代龄对照细胞之间的表达差异无统计学意义(P0.05),而转化后期细胞与同代龄对照细胞相比表达差异具有统计学意义(P0.05),且发现了11个差异表达的基因。结论:在GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中TGF-β信号通路可能发挥重要作用。     

GMA致人支气管上皮细胞恶性转化过程中抑癌基因P15 甲基化状态的研究

目的： 观察甲基丙烯酸环氧丙酯 (glycidyl methacrylate，GMA)致人支气管上皮 (16HBE)细胞恶性转化过程中不同时点P15基因甲基化状态，探讨其在细胞恶性转化过程中可能的作用。方法：收获GMA转化前期 (第10代)、转化中期 (第20代)、转化后期 (第30代)16HBE 细胞，应用甲基化芯片技术和甲基化特异性PCR (MSP)检测P15基因在GMA诱导16HBE细胞恶性转化不同阶段的甲基化状态。结果：甲基化芯片结果显示，P15基因在转化中期、转化后期出现甲基化而转化前期未见甲基化，MSP法检测结果与芯片结果一致。结论：P15基因可能为GMA诱导细胞恶性程度相关的特异性基因，可考虑将其作为诱导细胞恶性转化的生物标志物。     

甲基丙烯酸环氧丙酯诱导16HBE细胞恶性转化过程中LncRNA表达特征分析及ceRNA调控网络预测

目的： 筛选甲基丙烯酸环氧丙酯（GMA）诱导人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中不同时期差异表达的LncRNA并以此为基础构建ceRNA调控网络,分析相关信号通路和生物学功能。方法： 收集用GMA和溶剂DMSO分别处理的16HBE细胞。采用LncRNA芯片检测并分析两组细胞中LncRNA表达量的差异,运用TargetScan和MiRanda数据库筛选出关键的差异表达LncRNA,使用Cytoscape构建以差异表达LncRNA为核心的ceRNA调控网络,之后对差异表达LncRNA的靶基因和通路进行分析预测,通过实时荧光定量PCR （qPCR）对上述LncRNA相对表达量进行检测验证。结果： 芯片筛选结果发现,与DMSO对照组相比,GMA处理组共16个LncRNA在细胞恶性转化过程中表达上调。在此基础上筛选构建了由3个LncRNA,32个mRNA和204个miRNA组成的LncRNA相关ceRNA调控网络,其中有3个调控轴（LncRNA G013234-hsa-miR-378b-TMEM129、LncRNA CTA-384D8.35-hsa-miR-486-3p-LYPD、LncRNA G087116-miR-29b-3p-NAV1）与GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程相关（P<0.05）,提示这3个调控轴是与此恶性转化过程关联较为密切的ceRNA三元组。qPCR验证结果表明在细胞恶性转化过程的不同时期LncRNA G013234,CTA-384D8.35和G087116的相对表达水平变化趋势与LncRNA芯片结果一致。结论： 在GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化过程中,LncRNA G013234、CTA-384D8.35、G087116在恶性转化不同时期均发生上调,以此为基础构建的ceRNA调控网络及预测得到细胞恶性转化相关的关键mRNA,为GMA诱导16HBE细胞恶性转化机制研究提供了支持数据。     

肺腺癌癌旁组织及胚胎肺的基因表达谱研究

目的 利用基因芯片技术研究肺腺癌组织、癌旁组织及胚胎肺组织中的基因表达差异。方法 分别抽取肺腺癌组织、癌旁组织和胚胎肺组织的总RNA,并纯化mRNA。采用逆转录的方法,制成cDNA链,并以两种荧光Cy5和Cy3标记后做探针,与含有1152条人类全长基因芯片进行杂交。以ScanArray 4000荧光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,并用计算机处理和分析。结果 4例肺腺癌组织和癌旁组织标本中,共同表达差异基因25个,其中上调基因3个,下调基因22个;胚胎肺组织和癌旁组织标本中,表达差异基因316个,其中上调基因192个,下调基因124个;胚胎肺组织和癌旁组织中表达差异基因与肺腺癌组织和癌旁组织比较,共同表达差异基因16个,其中上调基因12个,下调基因4个。结论 肺腺癌与癌旁组织共同表达差异的25个基因可能与肺癌的发生、发展有关;胚胎肺组织与癌旁组织表达差异的316个基因与生长发育环境有关;胚胎肺组织和癌旁组织与肺腺癌组织和癌旁组织共表达差异的16个基因可能与早期肺腺癌启动有关。     

胰腺癌伴淋巴结转移的基因芯片研究

目的 利用基因芯片技术分析伴与不伴淋巴结转移胰腺癌组织中的差异表达基因。方法 将4000个人类全长基因的PCR产物点样于特殊处理后的玻片上制备基因芯片。用逆转录的方法,分别将两种荧光Cy3-dUTP和Cyt-dUTP标记正常胰腺组织和胰腺癌组织mRNA,以制备cDNA探针,并与芯片杂交。以ScanArray 3000荧光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,获得的荧光信号图像用计算机分析。每点上两种荧光信号的强度分别代表Cy3-dUTP和Cy5-dUTP的量。最后,计算每点的Cy5和Cy3比值。结果 在所检测的2例伴淋巴结转移和2例不伴淋巴结转移的胰腺癌标本中,56个基因（其中包括24个已知基因）有表达差异。结论 基因芯片技术为阐明人类胰腺癌伴淋巴结转移的特异性基因表达提供了有效方法。     

胃癌患者原癌基因和抑癌基因的表达谱研究

目的 :用基因表达谱芯片对人正常胃和胃癌组织原癌和抑癌基因表达的差异进行研究比较。方法 :利用胃和胃癌组织的mRNA通过逆转录方法 ,将Cy3和Cy5 2种荧光分别标记到 2组cDNA上制成探针 ,然后和表达谱芯片进行杂交后扫描 ,通过计算机分析判定 2种基因是否在上述组织中存在差异表达。结果 :在 195条原癌及抑癌基因中 ,存在差异表达的共 13条 ,表达上调的 6条 (0 0 71% ) ,表达下调的 7条 (0 0 83% )。结论 :认为应用这种方法识别出的 2种基因对胃癌的诊断和治疗具有重要的潜在价值     

基因芯片技术筛选非小细胞肺癌A549细胞顺铂耐药相关基因的研究

目的:采用基因芯片技术筛选人非小细胞肺癌(NSCLC)耐顺铂(DDP)A549细胞与A549细胞之间的差异表达基因,为进一步研究其耐DDP相关分子机制提供资料。方法:分别抽取耐DDPA549细胞与A549细胞的总RNA,采用逆转录的方法,制成cDNA链,并以2种荧光Cy5和Cy3标记后作为探针,与含有17101条人类16KcDNA基因表达谱芯片进行杂交,扫描荧光强度,并用计算机进行分析,寻找两组差异表达基因。结果:在17101条基因中,3株A549/DDP和3株A549细胞共同差异表达基因24条,其中上调基因12条,下调基因12条。结论:A549细胞发生DDP耐药过程中有多个基因参与,两者共同差异表达的24条基因可能参与其耐DDP分子机制。     

LD-RTPCR:A NEW METHOD FOR LABELLING TRACE cDNA MICROARRAY PROBE

cDNA microarrays are now being employed formRNA expression analysis in cancer cell lines[1] orexcised surgical specimens[2]. However, broaderapplication of cDNA microarrays is limited by theamount of RNA required: 50-200 mg of total RNA or 2-5 mg of poly A+ RNA. To broaden the use of cDNAmicroarrays, methods aiming at intensifying fluorescence signal[3-5] have been tried and resulted in modest improvement. LD-RTPCR (SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit, Clontech) is a PCR-based …     

应用cDNA芯片分析与食管鳞癌相关的基因表达

目的：应用cDNA芯片技术研究食管鳞癌的异常基因表达,并对这些基因的功能进行初步分析。方法：选择382个肿瘤相关基因克隆,制备成cDNA芯片,提取食管鳞癌组织以及相应正常食管组织RNA,反转录后标记为cDNA探针,与自行制备的cDNA芯片杂交,经扫描及分析后筛选出两种组织中差异表达基因。结果：发现差异表达基因75个,表达上调基因44个,下调基因31个,包括癌基因、抑癌基因、细胞周期相关蛋白、粘附因子、基质金属蛋白酶、信号传导因子、生长因子及其受体、与细胞代谢相关的酶等。结论：食管鳞癌的发生发展涉及多基因改变,cDNA芯片技术是疾病基因筛选的有效方法。     

沙棘籽渣黄酮诱导人乳腺癌细胞凋亡相关基因的表达谱变化

背景与目的:研究显示,沙棘含有多种黄酮类化合物,具有抗氧化、防辐射等作用。cDNA基因表达谱芯片技术具有高通量、高效、快捷的特点,本实验拟利用cDNA基因表达谱芯片研究沙棘籽渣黄酮(flavonoidsfromseedresiduesofHippophaerhamnoidesL.,FHR)诱导人乳腺癌细胞Bcap鄄37凋亡相关基因的表达谱变化。方法:抽提FHR作用前后的Bcap鄄37细胞总RNA,经逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针,与含有13824个cDNA基因的人14K基因表达谱芯片杂交,利用Genespring软件分析实验组和对照组之间差异表达的基因,对所获得的基因进行生物信息学分析。结果:实验组与对照组中表达上调的基因有305条,表达下调的基因有361条。差异表达的与细胞凋亡相关的基因有32条,占芯片基因总数的0.23%,其中表达上调的有25条(平均Ratio值为3.071),下调的有7条(平均Ratio值为0.418)。生物信息学分析表明,FHR在对Bcap鄄37细胞作用的过程中,该32条差异表达基因与Bcap鄄37细胞凋亡有关,其中包括CTNNB1、TSSC3、IGFBP4、IGFBP6、GADD34、TNFRSF10B、Caspase鄄9和PCNA等。结论:FHR诱导Bcap鄄37细胞凋亡的机制是由多基因协同,并通过胞内和胞外信号转导途径共同调节完成。     

结肠癌淋巴结转移相关基因的表达谱研究

 目的 利用基因芯片技术分析伴与不伴淋巴结转移结肠癌组织中的差异表达基因。方法 将含有16 084 条人类全长基因的PCR 产物点样于特殊处理后的玻片上制备基因芯片。用反转录的方法，分别将两种荧光Cy3-dUTP 和Cy5-dUTP 标记结肠癌组织和淋巴结转移组织mRNA，以制备cDNA 探针，并与芯片杂交。以Agilent 荧光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号，获得的荧光信号图像用计算机分析。结果 在16 084条基因中，结肠癌原发灶与转移淋巴结组织间存在差异表达的基因共999条，有537 条基因出现显著性表达上调，462条基因出现显著性表达下调。在4 例患者中出现共同表达上调基因44条，共同表达下调基因30条。包括癌基因、抑癌基因、黏附分子、基质金属蛋白酶、信号转导因子、细胞代谢和免疫相关基因等。结论 结肠癌转移是多基因作用的综合结果，转移相关基因表达谱的分析为预防和控制结肠癌的转移提供了新的思路与线索。     

采用基因表达谱芯片筛选肺癌细胞系差异表达基因的初步探讨

目的:探讨基因芯片技术分析高低不同转移能力肺癌细胞系的差异表达基因.方法:采用基因芯片技术检测具有高低不同转移能力的肺癌细胞系BE-1和LH-7的差异表达基因.抽提细胞mRNA,利用荧光标记dUTP逆转录制备cDNA探针,与人肺癌表达谱基因芯片杂交,以ScanArray 4000荧光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,获得的荧光信号图像用计算机分析,每点上两种荧光信号的强度分别代表Cy3-dUTP和Cy5-dUTP的量,最后计算每点的Cy5和Cy3的比值.结果:在所检测的人高低肺癌转移细胞系BE-1和LH-7中,20个基因有表达差异,其中高表达14条,低表达6条.结论:基因芯片技术为筛选人类肺癌转移基因提供了有效方法.     

二羟环氧苯并芘诱导致癌相关差异表达cDNA序列的克隆

目的 克隆苯并（a）芘代谢物二羟环氧苯并芘（dihydroxyepoxy benzo pyrene,BPDE）诱导的人上皮细胞致癌相关差异表达cDNA序列。方法 以BPDE诱导恶性转化的人支气管上皮细胞株16HBE为模型,采用cDNA代表性差异分析方法,比较转化细胞及正常对照细胞间基因表达的差异,分离恶变细胞中差异表达的cDNA片段。分离的片断分别与pGEM-T载体连接并转化人JM109细菌中,对质粒DNA进行测序,以BLASTN程序进行GenBank的同源性检索。结果 克隆的13条cDNA序列中,有5条为新基因序列,已在dbest数据库中注册,其登录号分别为BG354691、BG354692、BG354693、BG354694和BG354695;8条cDNA有同源序列,分别与核糖体蛋白S23、MLN137、ACTN4、转移生长因子及G蛋白基因等有同源性。结论 克隆的13条cDNA序列可能与BPDE诱发细胞恶性转化密切相关。