携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24对肝癌细胞凋亡的影响

目的 观察携带人mda-7/IL-24的溶瘤腺病毒SG600-IL24对各种不同转移潜能肝癌细胞HepG2、SMMC7721、MHCC97L和正常肝细胞LO2的作用.方法将携带人mda-7/IL-24的溶瘤腺病毒SG600-IL24分别感染人肝癌细胞系HepG2、SMMC7721、MHCC97L和正常肝细胞LO2,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western blot检测mda-7/IL-24基因和蛋白的表达,MTT观察肝癌细胞的生长抑制,Hoechst33258和流式细胞仪(FCM)检测细胞的凋亡,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期.结果 RT-PCR和Western blot显示mda-7/IL-24在肝癌细胞和正常肝细胞中高表达,ELISA提示细胞培养上清液中mda-7/IL-24蛋白也明显增加.MTT和流式细胞仪提示mda-7/IL-24能明显抑制肝癌细胞的生长(生长抑制率分别为75%±2.5%,86%±3.5%,72%±1.8%,HepG2∶F=5.86,SMMC7721∶F=7.98,MHCC97L∶F=5.13,均P<0.01),促进肝癌细胞的凋亡(凋亡抑制率分别为56.5%±4.0%,34.4%±2.0%,43.3%±2.5%,HepG2∶F=203.4,SMMC7721∶F=130.5,MHCC97L∶F=160.6,均P<0.01),阻滞肝癌细胞在G2/M期(G2/M期阻滞分别为35.4%±4.2%,40.5%±5.0%,42.0%±5.0%,HepG2∶F=112.5,SMMC7721∶F=133.2,MHCC97L∶F=145.5,均P<0.01),而对正常肝细胞没有明显的促进凋亡和增殖阻滞作用.结论 溶瘤腺病毒SG600-IL24能特异性杀伤不同转移潜能人肝癌细胞和诱导凋亡,促进肝癌细胞增殖阻滞,而对正常肝细胞无明显促进凋亡和增殖阻滞作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of oncolytic adenovirus vector SG600-IL24expressing human melanoma differentiation associated gene-7 (mda-7/IL-24) on hepatocellular carcinoma cell lines with different metastatic potential of HepG2, SMMC7721, MHCC97L and normal liver cell line LO2. Methods The oncolytic adenovirus SG600-IL24 which carrying mda-7/IL-24 gene was transfected into hepatocellular carcinoma cell lines and normal liver cell line. The mRNA and protein expression of mda7/IL-24 in HepG2, SMMC7721, MHCC97L and LO2 cell lines was confirmed by RT-PCR,ELISA assay and Western blot respectively. MTT assay and flow cytometry were used to study tumor cell proliferation and cell cycle in vitro. Hoechst33258 and flow cytometry were studied to indicate the apoptosis effects. Results It was confirmed by RT-PCR, ELISA assay and Western-blot that the exogenous mda-7/IL-24 gene was highly expressed in HepG2, SMMC7721, MHCC97L and LO2 cell lines. MTT and apoptosis detection indicated that MDA-7/IL-24 can induce the growth suppression (the inhibition rate was 75% ±2. 5% ,86% ±3. 5% ,and promotes apoptosis ( the apoptosis rate was 56. 5% ± 4. 0% , 34. 4% ± 2. 0% , 43. 3% ± 2. 5%cell lines at G2/M phase ( the blocking rate was 35. 4% ± 4. 2% , 40. 5% ± 5. 0% , 42. 0% ± 5. 0%metastatic potential hepatocellular carcinoma cell lines but not in normal liver cell line.Conclusions Oncolytic adenovirus vector SG600-IL24 can selectively induce growth suppression, promote apoptosis in hepatocellular carcinoma lines in vitro but not in normal liver cell LO2.     

Mda-7/IL-24基因转染对肝癌细胞凋亡影响的研究

目的 为了研究Mda-7／IL-24基因对肝癌细胞系Hep3B凋亡的影响。方法 构建了Mda-7／IL-24基因的真核表达载体pcDNA3．1／Mda-7／IL-24，用脂质体介导的基因转染法分别将真核重组体pcDNA3．1／Mda-7／IL-24和pcDNA3．1空载体质粒导人人肝癌细胞系Hep3B细胞中，经G418筛选获得细胞克隆。通过聚合酶链式反应（PCR）、免疫组织化学等方法检测基因和蛋白的表达，同时检测了细胞的生长和凋亡情况。结果 pcDNA3．1／Mda-7／IL-24转染的Hep3B细胞能够检测到Mda-7／IL-24的表达，可以抑制细胞生长，DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的“梯状”条带，转染空载体和未转染的Hep3B细胞未见凋亡表现。结论 将外源性Mda-7／IL-24基因导人Hep3B细胞后，可以促进凋亡，Mda-7／IL-24作为一种肝癌的治疗基因，具有广泛的应用前景。     

mda-7/IL-24基因mRNA在膀胱癌中的表达研究

mda 7基因编码的蛋白具有细胞因子活性,属于IL 10家族,因此又称为IL 2 4 [1] 。mda 7/IL 2 4基因在多种肿瘤组织中表达下调。我们采用RT PCR观察mda 7/IL 2 4mRNA在膀胱癌组织中的表达,现报告如下。材料与方法　本组30例。男2 1例,女9例。年龄4 2～77岁,中位年龄5 9岁。均经病理证实为膀胱移行细胞癌,其中表浅性癌19例,浸润性癌11例。取癌组织及癌周正常组织标本各1份,癌周组织取自距肿瘤2cm以外。标本离体10min之内液氮冷冻,- 80℃备用。异硫氰酸胍、水饱和酚(Biotech公司) ,单链cDNA合成及RT PCR试剂盒(Sangon公司)。引物序列…     

Ad.mda-7高选择性杀伤不同转移潜能肝癌细胞的研究

目的利用携带人MDA-7／IL-24基因的复制缺陷型腺病毒（Ad．mda7）作为载体，感染不同转移潜能的肝癌细胞MHCC97H，MHCC97L，Hep3B和正常的肝细胞L02，观察该基因对肝癌的选择性杀伤作用和增殖抑制作用。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad．mda-7感染正常肝细胞L02和肝癌细胞MHCC97H，MHCC97L和Hep3B，通过RT-PCR和ELISA方法观察MDA7基因的表达，通过四甲基偶氮哩蓝染色法（MTT）观察该基因对肝癌细胞的生长抑制，Hoechst染色和流式细胞仪观察MDA-7对肝癌细胞的杀伤作用，流式细胞仪检测细胞周期变化。结果RT-PCR提示复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株MHCC97H，MHCC97L，Hep3B和正常细胞L02中高效表达；ELISA方法检测提示细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达，而且随着感染时间延长表达量升高；MTT实验结果表明MDA7能明显抑制肝癌细胞的生长，Hoechst染色和流式细胞仪提示MDA7能促进肝癌细的凋亡；细胞周期检测提示肝癌细胞大量被阻滞在G2／M期，正常细胞没有增殖阻滞作用。各项结果提示MDA7对正常的肝细胞没有促进凋亡和增殖阻滞的作用。结论Ad．mda-7选择性的杀伤肝癌细胞，促进细胞增殖阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡与肝癌细胞的转移潜能无关。     

脂质体介导EGFP基因转染人肝癌细胞HepG2的效率研究

肿瘤基因治疗的载体分为病毒型和非病毒型，病毒型转染效率较高，但能整合宿主基因组，有致突变的危险。脂质体为非病毒载体，操作简便，细胞毒性小，转染效率虽不如病毒型高。本研究旨在观察脂质体介导EGFP基因转染人肝癌细胞HepG2的效率。     

康莱特诱导人肝癌细胞HepG2 凋亡的实验研究

目的 探讨康莱特注射液(KLT)诱导肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制.方法 用不同浓度的KLT培养肝癌细胞HepG2,应用流式细胞仪检测HepG2凋亡细胞的发生,应用ELISA法检测相关凋亡蛋白Bcl-2的变化.结果 流式细胞术证实KLT可诱导肝癌细胞HepG2凋亡(P＜0.01), 且具有时间、剂量依赖关系.KLT处理组HepG2细胞中Bcl-2蛋白的表达分别为(16.91±0.20)units/ml、(10.78±1.41)units/ml和(7.66±0.64)units/ml,对照组为(22.65±2.83)units/ml.结论 KLT可诱导肝癌细胞HepG2凋亡;且KLT诱导HepG2细胞凋亡过程中,Bcl-2蛋白表达的下调对调控细胞凋亡有重要作用.     

mda-7/IL-24联合阿霉素诱导裸鼠肝癌凋亡的初步研究

目的:探讨重组腺病毒介导的mda-7/IL-24基因联合阿霉素（ADM）治疗裸鼠肝癌的作用及机制。方法:采用mda-7/IL-24的重组腺病毒载体（Ad-mda-7）和/或ADM治疗实验性肝癌裸鼠，观察各组裸鼠生长时间及肿瘤体积变化，并对各组瘤体组织进行TUNEL检测。结果:成功构建了重组腺病毒mda-7/IL-24基因载体。Ad-mda-7＋ADM联合治疗组裸鼠平均生存时间为（83.8±4.82）d，明显长于其他3组（P<0.01）;Ad-mda-7＋ADM组肝癌体积明显缩小，抑癌率为79.78%，与单独用药组和对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）;联合组癌组织凋亡增加，凋亡指数为38.1%±4.2%，与其余3组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论:重组腺病毒介导mda-7/IL-24联合阿霉素有明显的协同抗肿瘤作用，效果优于单独治疗组，主要作用机制与促进癌组织凋亡有关。     

重组腺病毒介导MDA-7/IL-24对Hep3B选择性杀伤和抑制增殖的研究

目的观察黑色素瘤分化相关基因7（MDA-7／IL-24）基因对人肝癌细胞Hep3B和正常的肝细胞L02的作用，并且探讨其该作用机制。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞Hep3S，逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）和ELISA方法观察MDA-7／IL-24基因的表达，噻唑蓝染色法（MTT）观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制，Hoechst染色和Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检二种细胞的凋亡，利用PI染色后流式细胞仪检测细胞周期，RT-PCR方法检测bcl-2的表达变化。结果Ad．mda-7能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株Hep3B和正常细胞L02中高效表达，细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达（Hep3B：L02分别为790：810ng／L）。MDA-7／IL-24能明显抑制肝癌细胞的生长（抑制率分别是83％和1．2％），能促进肝癌细胞的凋亡（58％：2．2％），阻滞肝癌细胞在G2／M期（48．29％：7．95％）。而对正常的肝细胞没有促凋亡和增殖阻滞作用；能明显的抑制Hep3B的凋亡抑制基因bcl-2的表达。结论Ad．mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性的杀伤肝癌细胞Hep3B，促进细胞增殖阻滞，其机制是通过抑制bcl-2的表达诱导肿瘤细胞凋亡。     

mda-7/IL-24对人前列腺癌细胞的凋亡诱导效应

黑色素瘤分化相关基因-7(mda-7)是从人黑色素瘤细胞中分离出的一种肿瘤抑制基因，基于其蛋白结构、细胞因子样特性以及生物学作用模式，mda-7蛋白最近被正式归类为IL-24。携带mda-7的无复制能力的腺病毒(Ad．mda-7)可以诱导多种癌细胞凋亡．同时对正常纤维细胞和上皮细胞不产生毒作用。最近,Lebedeva等人证实Ad．mda-7通过诱导雄激素敏感性前     

重组腺相关病毒介导的MDA-7基因对人肝癌细胞的选择性凋亡诱导效应

目的 探讨PEG启动子调控腺相关病人毒介导的黑色素瘤分化相关基因MDA-7对肝癌细胞的选择性凋亡诱导效应.方法 以重组腺相关病人毒rAAV-PEG-MDA-7表达系统感染人肝癌细胞株HepG2细胞和正常人肝细胞株LO2细胞,Westerm Blot检测转染细胞内MDA-7蛋白,MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术分析细胞周期、Annexin-Ⅴ、线粒体跨膜电位(△Ψm),RT-PCR检测bcl-2基因mRNA.结果 重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA7可特异性转染HepG2细胞,MDA7蛋白在HepG2细胞中高效表达,并呈时间依赖性;重组腺相关病毒rAAV-PEC-MDA-7可抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡,细胞周期分析处于G0/G1期细胞百分比明显增多,处于G2/M期的细胞减少,并且可见到较明显的凋亡峰的形成,从24 h开始Annexin-Ⅴ阳性细胞比例增多,△Ψm降低,抗凋亡基因bcl-2 mRNA表达降低.而重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA-7对LO2细胞无类似效应.结论 构建出的重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA-7表达系统可选择性抑制肝癌细胞增殖和诱导其凋亡,其诱导凋亡机制受到bcl-2家族经线粒体途径的调节.     

环氧合酶-2表达上调与人肝细胞癌新生血管生成的关系

目的探讨环氧合酶-2(COX-2)表达上调与人肝细胞癌(HCC)新生血管生成的关系。方法采用免疫组化法和逆转录-聚合酶链反应法检测8 0例肝癌组织中COX-2,VEGF,bFGF,Ang-2和CD 3 4的表达情况;用W eidner分析法计算CD 3 4标记的平均微血管密度(MVD)。结果COX-2,VEGF,bFGF和Ang-2在HCC中表达率分别为7 5.0%,6 2.5 0%,6 0.0%和6 1.2 5%。VEGF,bFGF和Ang-2在COX-2强阳性组的免疫染色积分分别是5.9 8±1.1 6,4.5 7±0.2 6和5.8 7±0.1 2;而在COX-2中弱阳性组的积分分别是3.3 0±0.2 2,2.6 1±0.1 6和2.6 3±0.1 3;VEGF,bFGF和Ang-2在COX-2强阳性组的表达率分别是1 0 0.0%(9 5/9 5),9 4.2 9%(3 3/3 5)和9 7.1 4%(3 4/3 5),而在中弱阳性组分别是6 0.0%(1 5/2 5),6 0.0%(1 5/2 5)和6 0.0%(1 5/2 5)。两组的新生血管生成差异有显著性(P<0.0 1);COX-2与VEGF,bFGF和Ang-2表达呈明显正相关性(r分别为0.8 5 7,0.706,0.9 0 1;P分别<0.0 1)。MVD在COX-2强阳性组和中弱阳性组分别为7 3.1 8±1 2.4 3和33.42±7.52(P<0.0 1),COX-2与MVD呈正相关(r=0.8 1 2,P<0.0 1)。结论COX-2高表达与HCC血管生成密切相关。     

肝切除治疗原发性肝癌自发性破裂出血

目的: 探讨肝切除治疗原发性肝癌自发性破裂的疗效。方法:回顾性分析1988年以来采用肝切除术治疗肝癌破裂15例的临床资料。结果:全组15例，男12例，女3例；平均年龄48岁。8例行急症肝切除，2例手术止血后40d行二期手术，5例保守治疗40d行择期手术。右肝叶部分切除术8例，中肝切除术1例，左肝外叶切除术2例，左肝内叶切除术2例，左半肝切除术1例，右肝肿瘤切除1例、左肝肿瘤术后综合治疗1例。肝功能Child B级中1例术后5d死于肝衰竭，手术死亡率6.7%，14例生存者12例获得随访，中位生存时间18个月。1，3，5年生存率为58.3%，25.0%，16.7%。其中1例无瘤生存6年2个月。结论:肝切除是治疗肝癌破裂的最好方法，当有可能时应争取施行。肝切除治疗肝癌破裂可能使患者获得长时间生存。     

乙肝病毒X基因对肝癌细胞表达RhoC的影响

目的：探讨X基因对肝癌细胞表达RhoC基因的影响。方法：用定向克隆的方法构建X基因的真核表达载体pcDNA3.1-X，脂质体转染HEPG2细胞;潮霉素选择培养稳定表达X基因的HEPG2-X细胞;免疫组化鉴定HEPG2-X细胞RhoC蛋白表达。结果：构建的真核表达载体pcDNA3.1-X在HEPG2细胞中有稳定表达，HEPG2-X细胞表达RhoC蛋白增强。结论：体外条件下，X基因可促进肝癌HEPG2细胞RhoC表达增强。这可能与肝癌的侵袭、转移有关。     

BC047440基因在肝细胞癌中的表达及其意义

目的:探讨肝癌相关的新基因BC047440在肝细胞癌(HCC)中的表达及其病理学意义。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测36例HCC及其相应的癌旁肝组织中BC047440 mRNA的表达，并将该基因在HCC中的表达分为过高表达组及较高表达组，分析其与肿瘤病理变化的关系。〖KG(*8〗结果：36例HCC中BC047440基因mRNA的表达较癌旁肝组织高,其平均光密度比值分别为0.2594±0.0928和0.0942±0.0443,差异有极显著性意义（P<0.01）;过高表达组与较高表达组相比较，前者肝癌直径较大，门静脉受侵较严重，差异有显著性（P<0.05）。结论：BC047440基因与HCC的发生、发展和侵袭转移有关。     

三氧化二砷与阿霉素对人肝癌细胞株HepG2中survivin表达的影响

目的探讨三氧化二砷与阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的可能机制。方法用不同浓度的As2O3或／和ADM干预人肝癌细胞株HepG2不同时间，以免疫细胞化学和RT—PCR方法检测HepG2细胞中survivin表达的改变。结果(1)未加药物干预之前，HepG2细胞中可见survivin强烈表达；(2)不同浓度的As2O3或ADM均可降低HepG2细胞survivin表达程度，并且随药物浓度的增加或作用时相的延长，降低程度更明显；浓度与时相之间存在交互作用；(3)ADM降低HepG2细胞survivin表达的作用比As2O3更明显，两者联用后，作用进一步增强。结论(1)单用As2O3或ADM均可降低HepG2细胞中survivin表达，并呈浓度和时间依赖性；(2)相同浓度下，ADM对HepG2细胞中survivin表达的减弱作用较As2O3更强，但两者的联用较单用者能更显著降低survivin表达；(3)As2O3和ADM可能通过下调survivin表达而参与诱导癌细胞凋亡，从而发挥其抗癌作用；两者联用有叠加抗癌作用，从而可降低各自的临床使用剂量。     

稳定表达线粒体融合素基因2肝癌细胞株的建立及其意义

目的探讨将线粒体融合素基因2（mfn2）转染培养人肝癌细胞株HepG2，建立长期表达mfn2的肝癌细胞模型的可行性。方法基因重组构建mfn2真核表达质粒pEGFPnffn2，用脂质体将质粒转染培养人肝癌细胞株HepG2，经G418筛选阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应检测转染后30d细胞mfn2 mRNA的表达水平；Western—blot检测线粒体融合蛋白的表达。结果（1）成功构建表达真核质粒pEGFPmfn2；（2）成功将质粒pEGFPmfn2转染肝癌细胞株HepG2，并获得阳性细胞克隆；（3）经脂质体转染的人肝癌细胞株HepG2可较稳定表达mfn2。结论成功地建立稳定表达mfn2的肝癌细胞株，为进一步研究mfn2在肝癌发生发展中的作用奠定了基础。