megsin基因转染对高糖环境中系膜细胞胞外调节蛋白激酶表达的影响

目的 观察megsin基因转染对高糖环境中小鼠肾小球系膜细胞血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）、磷酸化胞外调节蛋白激酶1/2（pERK1/2）、转化生长因子β1（TGF-β1）的表达及Ⅳ型胶原水平的影响;探讨megsin基因对细胞外信号调节激酶（ERK）通路的作用。 方法 将小鼠肾小球系膜细胞分为7组：低糖组（A组,5.5 mmol/L）、高糖组（B组,30 mmol/L）、高糖+空质粒组（C组）、高糖+megsin质粒组（D组）、高糖+megsin质粒+ERK通路抑制剂组（E组）、高糖+ megsin siRNA组（F组）和低糖+甘露醇组（24.5 mmol/L甘露醇,G组）。分别在培养12、24、48 h后,采用Western印迹法测定各组系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达,放射免疫测定法（RIA）测定各组细胞上清液中Ⅳ型胶原浓度。 结果 与A组相比,高糖刺激可上调系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达及上清液Ⅳ型胶原的水平（均P ＜ 0.05）,且有一定的时间依赖性。转染megsin基因可进一步上调高糖环境下系膜细胞PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1、Ⅳ型胶原的表达（均P ＜ 0.05）。应用ERK通路抑制剂后,与D组相比系膜细胞megsin 和PDGF-BB的表达无明显变化（均P ＞ 0.05）,而pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型胶原的表达则明显降低（均P ＜ 0.05）。转染megsin siRNA对系膜细胞megsin基因进行干扰后,系膜细胞PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达及Ⅳ型胶原的含量较B组下调（均P ＜ 0.05）。 结论 高糖环境下,转染megsin基因可使小鼠系膜细胞megsin、PDGF-BB表达增高,其可能部分通过ERK通路使TGF-β1表达上调及Ⅳ型胶原合成与分泌增加。megsin siRNA干扰可使上述指标下调,megsin基因可能在糖尿病肾病发病中起重要作用。     

转染Megsin基因对体外系膜细胞增殖和Ⅳ型胶原分泌的影响及机制

目的 了解Megsin基因高表达对体外系膜细胞增殖和Ⅳ型胶原分泌的影响，并探讨其机制。 方法 构建大鼠Megsin基因真核表达载体，体外转染系膜细胞。3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入法检测系膜细胞增殖情况。RT-PCR方法检测系膜细胞血小板源生长因子(PDGF)-BB、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β1和TNF-α mRNA表达变化。ELISA法检测细胞培养上清PDGF-BB、TGF-β1和Ⅳ型胶原浓度。观察PDGF-BB中和抗体对大鼠系膜细胞转染Megsin基因后细胞增殖和TGF-β1 mRNA表达的影响。 结果 大鼠系膜细胞转染Megsin基因后，细胞内3H-TdR掺入量显著增加，PDGF-BB和TGF-β1 mRNA表达显著上调，细胞培养上清PDGF-BB、TGF-β1和Ⅳ型胶原的浓度显著升高，3者与转染Megsin基因呈明显时间依赖性关系。PDGF-BB中和抗体显著抑制系膜细胞转染Megsin基因后细胞内3H-TdR的掺入，并下调稳定表达Megsin基因的大鼠系膜细胞TGF-β1 mRNA表达。结论 Megsin基因高表达在体外可促进系膜细胞PDGF-BB和TGF-β1的表达和分泌，进而促进系膜细胞增生和Ⅳ型胶原分泌。     

肝素对肾小球系膜细胞和细胞外基质的影响

肝素对肾小球系膜细胞和细胞外基质的影响王宗谦周希静近年来，单纯肝素或肝素并用激素治疗肾病综合征获良好疗效。Ｐｕｒｋｅｒｓｏｎ等报道，Ｎ－Ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ／ＡｃｅｔｙｌａｔｅｄＨｅｐａｒｉｎ可能延缓肾衰进程，但机理尚未明。我们通过观察肝素对体外培养...     

霉酚酸酯对高糖所致大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

霉酚酸酯（MMF）是一种新型的免疫抑制剂。本研究旨在探讨MMF对不同浓度葡萄糖所致的系膜细胞增殖及细胞外基质增多是否有抑制作用。     

NG2基因小发夹结构RNA抑制高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖

目的构建针对NG2基因的小发夹结构RNA（shRNA）真核表达载体，观察该shRNA诱导的RNA干扰（RNAi）对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞（RMC）增殖的影响。方法体外培养RMC，高糖（30mmol／L）刺激24h，观察NG2基因表达的变化。设计两条针对NG2mRNA不同靶序列的干扰序列，构建针对NG2基因的shRNA表达载体Pgenesil—siNG21和Pgenesil-siNG22；选择不与任何基因同源的序列NC作为阴性对照。运用脂质体将3种质粒分别转染RMC，24h后荧光倒置显微镜观察转染效率，即增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达率，荧光定量PCR法和Western印迹法观察NG2的干扰效率。以高糖刺激转染的RMC，用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTY）和流式细胞仪（FCM）检测RMC增殖的变化。结果与低糖和甘露醇对照组比较，高糖刺激RMC后NG2表达水平明显升高，分别增高（65±32）％和（63±28）％，差异有统计学意义（P〈0．01）。质粒转染RMC24h后，EGFP的表达率为（50±10）％。高糖刺激后，干扰质粒转染组RMC增殖缓慢，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论针对NG2基因的shRNA对高糖诱导的RMC增殖有明显的抑制作用。     

NG2蛋白多糖促进肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质积聚

目的 探讨NG2蛋白多糖参与肾小球硬化过程的可能机制。 方法 构建针对NG2的特异性shRNA（Psilencer-NG2）和对照shRNA（Psilencer-NC）。将Psilencer-NG2、Psilencer-NC和全长型NG2真核表达载体pcDNA/NG2以及空质粒pcDNAⅠ分别转染到体外培养的大鼠系膜细胞（RMC）。实时定量PCR和Western印迹检测转染质粒对NG2 的干扰效率和过表达效率;MTT法观察各组细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞周期变化;实时定量PCR检测各组层粘连蛋白（laminin）的表达。 结果 转染pcDNA/NG2后的HBZY-1细胞NG2 mRNA和蛋白表达水平均明显增加（P < 0.05,P < 0.05）,而针对NG2的特异性shRNA干扰导致HBZY-1细胞NG2 mRNA和蛋白表达水平均显著下调（P < 0.01;P < 0.01）,分别表明达到过表达和沉默NG2的效应。过表达NG2后,RMC中laminin β1表达显著增加（1.25±0.04比 1.00±0.09,P < 0.05）;RMC增殖明显,处于S期的细胞数明显增加,而G0/G1期的细胞数减少。而沉默NG2后,laminin β1表达显著减少（0.81±0.02比1.00±0.08,P < 0.05）;RMC增殖缓慢,处于G0/G1期的细胞数明显增加,而S期的细胞数减少。 结论 NG2蛋白多糖可能通过促进系膜细胞增殖和细胞外基质积聚参与肾小球硬化的过程。     

内皮素1对人肾小球基质金属蛋白酶3及其组织抑制剂1表达的影响

内皮素1(ET-1)是一种强烈的缩血管活性肽，能够促进肾小球系膜细胞增殖及多种细胞外基质(ECM)组分的合成，但ET-1对ECM降解代谢的影响还不甚清楚。基质金属蛋白酶3(MMP-3)是一种基质溶解酶，能够降解多种ECM组分，活性受其组织抑制物1(TIMP-1)所抑制。本实验通过研究ET-1与MMP-3／TIMP-1的关系探讨ET-1对肾小球ECM降解代谢的影响。     

糖肾汤对大鼠肾小球系膜细胞分泌细胞外基质的影响

目的:研究糖肾汤对高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞外基质的影响.方法:在体外高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞中,加入糖肾汤含药血清进行干预,用酶联免疫吸附法检测培养上清中纤维连接蛋白(FN)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)的含量.结果:高糖可刺激肾小球系膜细胞分泌LN,糖肾汤对此无对抗影响;但能抑制高糖环境下肾小球系膜细胞高分泌Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白的作用,且有一定的量效依赖关系,优于开搏通对照组.结论:糖肾汤能抑制高糖环境下肾小球系膜细胞高分泌Ⅳ型胶原,纤维连接蛋白的作用,具有一定的量效依赖关系.     

葡萄糖转运蛋白1基因转染对系膜细胞功能的影响

目的通过建立葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的基因转染系统,观察GLUT1的过度表达对系膜细胞功能的影响。方法利用逆转录病毒载体建立CLUT1基因转染的大鼠系膜细胞(MCGT1),以β-半乳糖苷酶转染细胞(MCLacZ)为对照。用2-脱氧-3H-萄萄糖(2-DG)测定细胞葡萄糖摄入,流式细胞仪分析细胞表型,3H-脯氨酸掺入和流式细胞仪分别检测细胞胶原和纤维连接蛋白(FN)的合成,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞胶原Ⅳ、FN的表达。结果MCGT1的2-DG摄入率明显高于MCLacZ[(741．0±60．5)dpm·μgprot-1比(92．2±9．0)dpm·μgprot-1,P＜0．01]。动力学分析发现MCGT1的Vmax是MCLacZ的3．7倍,而两者Km值无明显差别。在相同的葡萄糖浓度下,MCGT1的乳酸生成增多,表现出细胞体积增大、RNA/DNA和蛋白质/DNA比值增高等细胞肥大表型。与对照相比,MCGT1的胶原和FN合成与表达明显增加。结论GLUT1的过度表达使系膜细胞具有糖尿病肾病(DN)的细胞表型。GLUT1的功能状态直接影响系膜细胞的糖代谢及功能变化。     

白花丹提取物对高糖诱导的肾小球系膜细胞分泌炎症因子及细胞外基质的影响

目的探讨白花丹提取物对高糖诱导的肾小球系膜细胞分泌炎症因子及细胞外基质的影响。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,随机分为对照组,模型组,白花丹提取物低剂量(1 mg/L)、中剂量(2 mg/L)、高剂量(4 mg/L)组,甘露醇(24.5 mmol/L)组,收集各组细胞及细胞培养基,以酶联免疫吸附法检测各组细胞上清液中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)水平;检测各组细胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;以实时荧光定量法检测各组细胞miR-155、SOCS1 mRNA水平;采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞纤维连结蛋白(fibronectin,FN)、Ⅳ型胶原蛋白(collagen IV,Col IV)、细胞因子信号传导抑制蛋白1(cytokine signal transduction inhibitor 1,SOCS1)蛋白表达。结果与对照组相比,模型组、甘露醇组细胞上清液中TNF-α、IL-6及TGF-β1水平升高,细胞MDA、miR-155、FN及Col IV表达升高(P0.05),细胞SOD水平、SOCS1 mRNA及蛋白表达明显降低(P0.05)。与模型组相比,白花丹提取物低、中、高剂量组细胞上清液中TNF-α、IL-6及TGF-β1水平降低,细胞MDA、miR-155、FN及Col IV表达降低(P0.05),细胞SOD水平、SOCS1 mRNA及蛋白表达升高(P0.05),且各项变化均对白花丹提取物呈剂量依赖性(P0.05)。结论白花丹提取物可抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞分泌炎症因子及细胞外基质,下调miR-155表达、上调SOCS1表达可能是其作用机制。     

晚期糖化蛋白刺激系膜细胞合成和分泌内皮素的研究

目的　观察晚期糖化蛋白对系膜细胞合成和分泌内皮素 (ET)的影响。方法　体外正常培养系膜细胞 ,将系膜细胞分泌的基质与 6 磷酸葡萄糖孵育 ,快速制备晚期糖化基质蛋白 ;进而检测该糖化终产物作用后 ,系膜细胞中ET 1和内皮素A受体 (ET AR)mRNA表达的改变 (采用RT PCR) ,以及细胞上清液中内皮素浓度的变化 [用放射免疫法 (放免法 )测定 ]。同时 ,观察高糖对系膜细胞中内皮素表达产生的效应。结果　经晚期糖化蛋白作用的系膜细胞 ,与对照相比 ,其对ET 1和ET AR的mRNA表达明显增加 ,分别为对照组的 1.74倍和 1.47倍。加入氨基胍 (AG)抑制系膜基质糖化和交联后 ,系膜细胞中ET 1和ET AR的mRNA表达随之下降 ,以ET 1mRNA表达下降明显 ,约 5 3% ,ET ARmRNA表达仅下降 18%。系膜细胞对内皮素的分泌亦受糖化基质的作用而显著增加 ,为对照组的 7.15倍 ,氨基胍干预后 ,其分泌明显减少 ,内皮素浓度下降 73.49%。用高糖干预的系膜细胞组 ,却以高糖产生的高渗效应最为明显 ,细胞中ET 1mRNA水平为对照组的 10 .1倍。结论　高糖状态下 ,转变为糖化终产物的细胞外基质对系膜细胞合成和分泌内皮素有直接的上调作用 ,且不依赖于高糖环境。     

地塞米松对肾小球系膜细胞中细胞因子产生与基因表达的影响

目的 观察地塞米松(DEX)对内毒素(LPS)诱导的肾小球系膜细胞(MC)中细胞因子的产生及其基因表达的影响。方法 采用免疫学和分子生物学方法。结果 1.细胞因子在正常MC中分泌量极微,其mRNA表达处于低水平。2.LPS诱导MC细胞因子的产生及mRNA表达增加。3.DEX对细胞因子的产生及mRNA表达有明显的抑制作用,呈剂量依赖关系。结论 DEX是MC产生细胞因子的较强抑制剂,为今后临床上治疗肾小球肾炎,提供了理论及实验依据。     

洛伐他汀对系膜细胞凋亡及Bcl-2和Bax基因表达的影响

目的 观察洛伐他汀对系膜细胞凋亡及Bcl-2和Bax基因表达的影响。并探讨其作用的可能机制。方法 用不同浓度的洛伐他汀处理大鼠系膜细胞，用流式细胞仪观察细胞凋亡指数，吖啶橙荧光活体染色观察细胞凋亡率，电镜观察凋亡细胞形态，免疫印迹法及细胞免疫结合图文分析观察洛伐他汀对系膜细胞Bcl-2和Bax基因表达的影响。结果 洛伐他汀对系膜细胞凋亡有明显诱导作用，呈一定剂量依赖性；并能明显抑制Bcl-2基因表达，促进Bax基因表达，致使两者比例明显下降。结论 洛伐他汀可剂量依赖性地诱导大鼠系膜细胞凋亡，其机制可能通过对凋亡抑制或促进基因的调控，改变Bcl-2/Bax比值而诱导MC的凋亡。     

体外肾系膜细胞对成骨细胞增殖及功能的影响

目的:从生长因子角度研究肾小球系膜细胞对成骨细胞增殖及功能的影响和机制。方法:应用体外细胞培养的方法,将成骨细胞分为正常血清组和系膜细胞组,分别予10%正常血清培养液及20%系膜细胞培养上清液。MTT法分别检测培养24、48、72、120 h后两组成骨细胞增殖情况;在培养72及144 h后检测上清液骨钙素(BGP)及骨桥蛋白(OPN)浓度;在培养144 h后检测培养液胰岛素样生长因子-α(IGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)的浓度。结果:在培养的各个时间点,系膜细胞组的成骨细胞增殖均明显高于正常血清组(P<0.05)。在培养72、144 h后,系膜细胞组BGP及OPN的浓度分别高于正常血清组11.3%、16.4%和55.0%、39.6%。在培养144 h后,系膜细胞组的IGF-α、TGF-β浓度比正常血清组分别增高10.1%和47.7%。结论:肾小球系膜细胞能直接作用于成骨细胞,促进成骨细胞的增殖及功能。这种作用可能是通过促进成骨细胞分泌TGF-β来实现的。     

微丝功能对成纤维细胞胶原酶及金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达的影响

目的 研究微丝功能对正常皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞胶原及金属蛋白酶组织抑制因子－1mRNA表达水平的影响。方法 采用细胞培养、Northern blot分析等方法，以α-32P-dCPT标记的胶原酶及金属蛋白酶组织抑制因子－1 cDNA为探针，检测正常皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞胶原酶及金属蛋白酶组织抑制因子－1mRNA表达水平的变化。结果 用细胞松弛素B破坏微丝后，正常皮肤及增生性瘢痕成纤维性细胞的胶原酶及金属蛋白酶组织抑制因子－1mRNA含量明显升高。结论 微丝骨架可在基因转录水平参与对成纤维细胞合成细胞外基质的调控。     

高糖培养下人肾小球系膜细胞蛋白表达谱变化的研究

目的 利用比较蛋白质组学双向电泳技术研究体系,观察高糖培养下人肾小球系膜细胞（HMC）蛋白表达谱的变化。 方法 人肾小球系膜细胞分为高糖培养组（30 mmol/L）和正常糖组（5 mmol/L）,培养48 h后收集细胞,提取总蛋白,以DIGE饱和荧光标记,双向荧光差异凝胶电泳。应用Typhoon多功能成像系统扫描凝胶,DeCyder 2-D差异分析软件进行图像分析,寻找差异表达蛋白质。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和蛋白质数据库检索鉴定差异蛋白。 结果 通过DeCyder 2-D差异分析软件,发现正常糖组和高糖培养组之间差异大于1.5倍的蛋白质斑点147个,对其中96个差异蛋白质斑点进行了肽质指纹图分析,鉴定出37种蛋白质。其中磷脂酰乙醇胺结合蛋白 1（PEBP-1）、粒溶素、ATP合成酶H+转运线粒体F0复合体亚基F2仅在高糖组表达。高糖刺激后表达上调的蛋白质有24个,包括嗜酸细胞阳离子蛋白、RGS膜相互作用蛋白16（MIR16）、肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶、disks large homolog DLG2、早发性乳腺癌2（BRCA2）、儿茶酚-邻-甲基转移酶等;表达下调的蛋白有5个,包括O-GlcNAc transferase-interacting protein 106 000 isoform 1、proteasome beta 6 subunit precursor、NEFA-interacting nuclear protein NIP30等。 结论 高糖培养下HMC内147种蛋白质的表达发生变化。这些蛋白质广泛参与高糖对HMC的细胞骨架、糖代谢、细胞分裂、基因转录、信号转导、磷酸化、细胞增殖、凋亡等的调节。深入分析这些差异表达蛋白的功能与调控,有望为阐明糖尿病肾病的发病机制提供重要的实验依据。