5-FC/CD 自杀基因疗法结合热休克蛋白-多肽复合物瘤苗治疗小鼠黑色素瘤的研究

 目的　研究 5 -氟尿嘧啶 /胞嘧啶脱氨酶 (5 FC/ CD)基因疗法与热休克蛋白 -多肽复合物 (HSP- PC)瘤苗免疫疗法联合抗肿瘤效果。方法　将携带 CD基因的重组腺病毒注射到小鼠黑色素瘤体内 ,腹腔注射 5 - FC,同时皮下接种 HSP70 - PC。结果　经联合治疗后 ,70 %荷瘤小鼠肿瘤体积缩小、消退 ,小鼠存活期延长 ,肿瘤组织明显坏死 ,炎症细胞、CD+4 及 CD+8T细胞浸润明显。结论5 - FC/ CD基因疗法结合 HSP- PC瘤苗免疫疗法抗小鼠黑色素瘤作用显著 ,具有临床应用前景。     

热休克蛋白70-多肽复合物在肿瘤免疫领域的研究进展

热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是一组广泛存在于细胞内的可溶性蛋白，在应激(如热休克、高温、感染、缺氧、氧化应激、异常代谢物积聚等)条件下高效表达。主要参与胞内新生肽的结合、折叠、装配、降解与跨膜转运，在维持细胞的正常结构和功能方面起着重要作用。根据其分子量的大小分为4个家族，即HSP90(83～90kD)家族、HSP70(66～78kD)家族、HSP60家族及小HSP家族。此外还有分子量为100～110kD而特性不同于上述家族的大分子HSP。     

热休克蛋白-肽复合物在肿瘤治疗中的作用

196 2年 ,Ritossa在研究果蝇唾液腺染色体的热休克反应时发现 ,在染色体特征性突起的不连续位点处有转录活性 ,这些位点编码热休克蛋白 (heatshockproteins,HSPs)。HSPs是生物体内广泛存在的可溶性分子 ,根据分子量大小 ,可以分为Hsp110、Hsp90、Hsp70、Hsp6 0和Hsps2 8。低血糖、热休克以及其他应激反应都可诱导HSPs[1] 。近年来 ,发现HSPs在诱导抗肿瘤免疫时发挥着独特的作用 ,这引起科学工作者极大的兴趣。1概述194 3年 ,Gross在实验中对胚胎期的老鼠用肿瘤细胞免疫 ,老鼠出生后对此种肿瘤细胞发生特异性免疫反应。那么促使这种…     

肿瘤疫苗热休克蛋白-多肽复合物(HSP-PCs)的临床应用研究进展

热休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）又称应激蛋白（stress protein,SP）,是机体细胞在一些应激原如环境高温、氧化应激、感染、创伤、缺氧等条件诱导下,激活HSP基因,高效表达的一组蛋白质,广泛存在于自然界原核、真核细胞中参与细胞的损伤与修复。其所具备的一系列免疫学功能如伴侣抗原肽、提成和加工处理抗原肽及激活抗原提成细胞（antigen presentingcells,APCs）等,使其在肿瘤免疫应答过程中可充     

热休克蛋白-多肽复合物疫苗用于肿瘤治疗的研究进展

0引言 肿瘤治疗性疫苗的研究源于上个世纪小鼠肿瘤免疫排斥试验,有许多研究发现如果将肿瘤细胞灭活后制成抗原(即瘤苗)免疫小鼠,小鼠会对随后接种的相同肿瘤细胞产生排斥反应.由于肿瘤细胞来源于正常细胞的癌变,免疫原性低,通常很难被免疫系统识别,同时由于肿瘤细胞具有多种免疫逃逸机制,因而不能有效激发免疫反应清除肿瘤.     

肿瘤疫苗热休克蛋白-多肽复合物的临床应用研究进展

热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)所具备的一系列免疫学功能如伴侣抗原肽、提呈和加工处理抗原肽及激活抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)等，使其在肿瘤免疫应答过程中可充当强有力的分子佐剂。大量的动物实验已经证实，分子量为70(HSP70)、90(HSP90)、96(GP96)的HSP家族与它们所携带的抗原肽在体内外组成热休克蛋白-多肽复合物(heat shock protein—peptide complexes，HSP-PCs)，在肿瘤的预防和治疗方面显示出独特的优势。     

肺癌gp96-多肽复合物/DC疫苗体外诱导CTL反应的实验研究

目的 研究热休克蛋白gp96－多肽复合物负载树突状细胞（dendritic cell,DC）后，能否诱导出gp96－多肽复合物特异性的细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）反应。方法 从一例肺癌患者肿瘤组织中提取gp96-多肽复合物和自体肿瘤细胞溶解物，分别负载从该患者骨髓血中培养的DC。以不同形式的抗原／DC疫苗分别刺由患者外周血中分离的淋巴细胞。采用ELISA法检测淋巴细胞所释放的IFN－γ量作为CTL反应的指标；以Cr^51释放实验分析致敏后的淋巴细胞对不同靶细胞的裂解和杀伤作用。结果 所有肿瘤抗原致敏淋巴细胞后均可以诱导产生CTL反应，其中以gp96－多肽复合物／DC疫苗诱导释放的IFN－γ量最高。肿瘤抗原致敏淋巴细胞后对原代培养的肿瘤细胞的杀伤作用高于PG细胞和K562细胞。结论 自体肿瘤组织中提取的gp96－多肽复合物能诱导出肿瘤特异性CTL反应，而负载DC后能激发起更强的CTL。     

热休克蛋白72-甲胎蛋白抗原表位肽复合物抗小鼠肝癌Hepal-6细胞免疫的实验研究

目的:以热休克蛋白72(HSP72)-甲胎蛋白(AFP)抗原表位肽复合物免疫小鼠,研究该复合物针对AFP肿瘤是否具有特异性抗肿瘤免疫.方法:以HSP72-AFP多肽复合物皮下注射免疫昆明小鼠,并分别以AFP多肽和HSP72单独免疫小鼠为对照组.ELISA法检测免疫后小鼠血清IFN-γ水平、MTT法检测各免疫组小鼠淋巴细胞对肝癌Hepal-6细胞的杀伤作用、以小鼠体内瘤负荷实验评价蛋白复合物的免疫效应.结果:HSP72-AFP多肽复合物组小鼠血清IFN-γ水平、淋巴细胞对Hepal-6细胞的杀伤作用均显著高于AFP多肽和HSP72组(P＜0.01).HSP72-AFP多肽复合物组瘤体积也明显小于AFP多肽和HSP72免疫组(P＜0.01).结论:HSP72-AFP多肽复合物疫苗可诱导荷瘤小鼠产生针对AFP肿瘤的特异性细胞免疫,其对瘤细胞的杀伤效应明显优于两者单一的多肽纯化疫苗.表明HSP72-AFP多肽复合物可诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫.     

A study on the treatment of gastric cancer by CD gene combined with 5-FC in vitro and in vivo

Objective: To study the killing effect of suicide gene CD on mouse gastric cancer. Methods: CD gene was transduced with the retroviral vector. The killing effect and bystander effect of CD gene on mouse gastric cancer cell line MFC were observed. The mouse gastric cancer model was used for in vivo study. The CD gene containing virus was injected into the tumors. The volumes of the tumors in every group were measured in time. Results: Significant killing effect and bystander effect were observed by CD gene in vitro, 70–80% cell death resulting from 20% of CD gene transduction. In vivo, CD/5-Fc caused tumor to diminution. Conclusion: CD/5-Fc system has significant killing effect on mouse gastric cancer Foundation item: This work was supported by the Scientific and Research Foundation of the Ministry of Public health of China(No. 98-1-312) and Shanghai Natural Scientific Foundation (No. 98ZB14028). Biography: GUO Shan-yu(1966–), doctor of medicine, attending physician, Shanghai Ninth People’s Hospital, majors in biological therapy of gastrointestinal cancer.     

Intracellular prodrug gene therapy for cancer mediated by tumor cell suicide gene exosomes

Recently, we reported about exosomes possessing messenger RNA (mRNA) of suicide gene secreted from mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) engineered to express the suicide gene—fused yeast cytosine deaminase::uracil phosphoribosyltransferase (yCD::UPRT). The yCD::UPRT‐MSC exosomes are internalized by tumor cells and intracellularly convert prodrug 5‐fluorocytosine (5‐FC) to cytotoxic drug 5‐fluorouracil (5‐FU). Human tumor cells with the potential to metastasize release exosomes involved in the creation of a premetastatic niche at the predicted organs. We found that cancer cells stably transduced with yCD::UPRT gene by retrovirus infection released exosomes acting similarly like yCD::UPRT‐MSC exosomes. Different types of tumor cells were transduced with the yCD::UPRT gene. The homogenous cell population of yCD::UPRT‐transduced tumor cells expressed the yCD::UPRT suicide gene and secreted continuously exosomes with suicide gene mRNA in their cargo. All tumor cell suicide gene exosomes upon internalization into the recipient tumor cells induced the cell death by intracellular conversion of 5‐FC to 5‐FU and to 5‐FUMP in a dose‐dependent manner. Most of tumor cell‐derived suicide gene exosomes were tumor tropic, in 5‐FC presence they killed tumor cells but did not inhibit the growth of human skin fibroblast as well as DP‐MSCs. Tumor cell‐derived suicide gene exosomes home to their cells of origin and hold an exciting potential to become innovative specific therapy for tumors and potentially for metastases.     

慢病毒介导YCD/5-FC自杀基因系统对白血病Jurkat细胞杀伤和旁观者效应

目的:探讨慢病毒介导的酵母菌胞嘧啶脱氨酶(yeast cytosine deaminase,YCD)自杀基因对人白血病Jurkat细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法:制备YCD-GFP慢病毒上清,转染Jurkat细胞(即Jurkat/YCD-GFP细胞),流式细胞术检测YCD-GFP基因的表达。体外观察前体药物5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)对Jurkat/YCD-GFP细胞的杀伤情况和旁观者效应;建立Jurkat/YCD-GFP荷瘤小鼠模型,体内观察5-FC对移植瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应。以上实验均以Jukut/GFP细胞为对照。结果:成功制备YCD-GFP慢病毒和感染YCD-GFP慢病毒的Jurkat/YCD-GFP细胞,YCD-GFP慢病毒对Jurkat细胞的感染率达96.93%。232μmol/L的5-FC作用72h可使(95.61±2.07)%的Jurkat/YCD-GFP细胞死亡,且上清中5-FC含量下降80%左右。体外实验显示,Jurkat/YCD-GFP和Jurkat细胞效靶比1∶10混合培养[(68.69±4.97)%vs(97.87±1.11)%,P<0.05)]和Transwell1∶25分层培养[(1.46±0.27)×105vs(3.00±0.16)×105,P<0.01]均存在旁观者效应。体内实验显示,YCD/5-FC自杀基因系统对Jurkat/YCD-GFP荷瘤小鼠亦具有较强的杀伤作用和旁观者效应(P<0.05)。结论:慢病毒介导的YCD/5-FC自杀基因系统对人Jurkat白血病细胞具有显著的杀伤作用和旁观者效应。     

基因芯片筛选胃癌及肿瘤球细胞差异表达基因

目的：利用基因芯片技术筛选人胃癌细胞HGC-27及其肿瘤球细胞的差异表达基因。方法：无菌条件下体外培养人胃癌细胞HGC-27及其肿瘤球细胞,Trizol试剂提取两种细胞的总RNA并纯化,按Gene-Chip IVT Express Kit说明对总RNA进行杂交,所得荧光信号用Cluster和TreeView软件进行分析和显示。结果：按差异显著性标准（差异为2倍）,以人胃癌细胞为对照,在肿瘤球细胞中有610个基因表达上调,1135个基因表达下调,涉及细胞生长、信号传导、肿瘤形成等多个方面。结论：人胃癌细胞HGC-27与其肿瘤球细胞存在基因表达的差异,肿瘤球细胞与肿瘤的形成相关。     

融合穿膜肽的HSP70基因联合CIK细胞对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效果

观察融合穿膜肽的HSP70基因联合CIK细胞对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效应。方法：采用编码11个精氨酸（11R）的穿膜肽序列融合HSP70基因序列,构建重组腺病毒载体AdCMV-HSP70s、AdCMV-HSP70（无穿膜肽对照）和AdCMV-EGFV（空载体对照）。Western blotting、ELISA法检测重组腺病毒介导的HSP70基因在胃癌SCG-7901细胞中的表达,MTT检测重组腺病毒感染后HSP70分泌性表达对胃癌细胞的抑制作用。裸鼠移植瘤模型的抗瘤实验检测HSP70基因联合CIK细胞对胃癌移植瘤的抗瘤效应。结果：与AdCMV-HSP70感染细胞比,AdCMV-HSP70s感染细胞的HSP70表达量明显增加[胃癌SGC-7901细胞：（360.72±20.89） vs（121.01±15.94）ng/ml,P<0.05 ;胃黏膜上皮GES-1细胞：（188.62±10.82） vs（135.00±13.96） ng/ml,P<0.05]。融合11R的HSP70蛋白能够穿膜并分泌到细胞外后对胃癌细胞产生一定的增殖抑制作用[MOI=100 pfu/cell时,细胞存活率（66.33±4.33）% vs（101.33±7.64）%,P<0.01]。AdCMV-HSP70s+CIK联合治疗对胃癌移植瘤的抑制率显著高于AdCMV-HSP70+CIK组[（66.5±7.3)% vs (43.6±5.6)%, P<0.05],该组移植瘤组织间质中CD3+T细胞浸润数量也明显多于后者。结论：融合穿膜肽可明显促进HSP70蛋白的表达和分泌,和CIK细胞联合治疗能增强抗瘤免疫效应,从而显著抑制裸鼠胃癌移植瘤。     

CD基因联合mIL-2/mGM-CSF基因治疗胃癌的研究

目的：观察ＣＤ基因联合ｍＩＬ－２／ｍＧＭ－ＣＳＦ基因对小鼠胃癌的治疗作用。方法：ＣＤ基因构建于逆转录病毒载体ｐＬｘＳＮ,ｍＩＬ－２和ｍＧＭ－ＣＳＦ基因构建于ｐＩＲＥＳ。先用ＣＤ／５－ＦＣ治疗胃癌细胞株,然后联合ｍＩＬ－２／ｍＧＭ－ＣＳＦ两种细胞因子基因治疗小鼠模型胃癌,以期产生显革的抗肿瘤作用。ＲＴ－ＰＣＲ检测基因表达。结果：体外结果显示２０％的转基因细胞即可杀灭７０％￣８０％的肿瘤细胞。动物实验     

CD/5－FC体系对人乳腺癌基因治疗作用的实验研究

目的：探讨ＣＤ／５－ＦＣ体系对人乳腺癌的实验治疗作用。方法：应用ＭＴＴ法测定人乳腺癌细胞对５－ＦＣ的敏感性。结果：实验显示,５－ＦＣ对导入ＣＤ基因的人乳腺癌细胞有明显的细胞毒作用,而对未导入ＣＤ的人乳腺癌细胞的毒性较低,５－ＦＣ对导入和未导入ＣＤ基因的人乳腺癌细胞的ＩＣ５０分别为４１８μｇ／ｍｌ和１２４９μｇ／ｍｌ。结论：ＣＤ／５－ＦＣ体系对体外转基因的人乳腺癌细胞有一定的抗肿瘤作用。     

转录靶向性KDR启动子调控双自杀基因系统对人大细胞肺癌细胞L9981的杀伤作用

背景与目的 研究KDR启动子转录调控双自杀基因系统(CDglyTK)对人大细胞肺癌细胞L9981的杀伤作用.方法 应用分子生物学技术克隆KDR基因的启动子KDRP,构建KDR启动子调控的双自杀基因(CDglyTK)真核表达质粒pcDNA3-KDRp-CdglyTK.并将其导AL9981和人肝癌细胞HepG2中.给予不同的前药(GCV和/或5-FC)处理后,应用MTT法检测各组细胞的存活率.并应用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期和凋亡.结果 成功的克隆KDR启动子和构建pcDNA3-KDRp-CdglyTK质粒.pcDNA3-KDRp-CdglyTK转染后,L9981细胞中均可检测到CD和TK mRNA,而HepG2细胞中则无.联合应用5-FC+GCV处理对转双自杀基因细胞(L9981)的杀伤作用显著高于单独应用5-FC或GCV(P<0.05),且二者显示了良好的药物协同作用.结论 KDR基因启动子调控双自杀基因系统可以靶向性杀伤人肺癌细胞.     

PNP/MeP-dR系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的探讨新型嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤-2′-脱氧核糖核苷(PNP/MeP-dR)自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用。方法构建PNP基因真核表达载体pcDNA3.0/PNP,脂质体介导法将其导入HepG2细胞,利用G418筛选获得稳定转染PNP基因的细胞株HepG2/PNP。采用台盼蓝拒染法测绘细胞生长曲线,MTT法和FCM检测细胞对MeP-dR的敏感性及旁观者效应,HPLC检测PNP酶活性。结果HepG2/PNP细胞对MeP-dR十分敏感,作用4d后MeP-dR对HepG2/PNP的IC50为4.5μmol/L,而100μmol/L的MeP-dR即可最大限度地杀死HepG2/PNP细胞。100μmol/L MeP-dR作用8d后,混合细胞中HepG2/PNP比例仅占5%即可导致所有细胞死亡。HPLC结果显示,PNP基因产物能够将MeP-dR转化为6-MP。结论PNP/MeP-dR系统对肝癌细胞的杀瘤效果明显优于传统的自杀基因系统。本研究为该系统应用于肝癌体内治疗打下基础。     

慢病毒载体介导的自杀基因系统YCD/5-FC对人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞杀伤效应的研究

背景与目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶(yeast cytosine deaminase,YCD)可将无毒性的抗真菌药5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)转化为细胞毒性产物氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU),进而阻抑DNA、RNA和蛋白质合成,引起细胞死亡.本研究中构建含YCD基因的慢病毒载体质粒,体内外观察YCD/5-FC自杀基因系统的杀伤效应.方法:应用亚克隆技术将YCD和绿色荧光蛋白基因(green fluorescence protein,GFP)连接至慢病毒空载体pFUW,构建获得pGC-FU-YCD-GFP.将3质粒系统(含包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒)脂质体法共转染包装细胞293T,获得的慢病毒转染人Jurkat细胞,流式细胞仪(FACS)和Western blot检测Jurkat/YCD-GFP表达水平;加入前体药物5-FC,观察对靶细胞的杀伤情况和旁观者效应.转基因细胞接种至裸鼠前肢皮下,观察体内肿瘤杀伤情况.结果:慢病毒载体3质粒系统感染293T细胞后,获得的慢病毒滴度为1.2×108TU/mL.该病毒可高效转染人Jurkat细胞,感染率达96.93%,Western blot显示转基因细胞可分泌YCD蛋白.100 μmol/L 5-FC作用96 h可杀伤(89.37±6.57)%的Jurkat/YCD-GFP细胞.混合培养提示存在明显的旁观者效应.转基因细胞可在小鼠体内致瘤,5-FC可明显抑制肿瘤生长.结论:成功构建慢病毒载体pGC-FU-YCD-GFP,YCD/5-FC自杀基凶系统在体内外均有显著的特异性杀伤效应.