Ihh-PTHrP信号轴调控髁突软骨内成骨相关机制的研究进展

Ihh-PTHrP信号轴调控软骨内成骨过程。近年来,国内外学者对Ihh-PTHrP信号通路的调控机制给予了广泛的关注,相关的调控机制屡见报道,对髁突软骨内成骨机制研究的需求日趋迫切。国内外许多文献报道了相关因子在Ihh-PTHrP信号轴中的重要角色,发现了一些具有指导意义的成果。本文通过对近几年国内外相关文献的总结归纳,对该信号轴调控髁突软骨内成骨的相关机制研究做一综述。     

不同静压力对大鼠髁突软骨细胞生物学特性的影响

目的探讨不同静压力对髁突软骨细胞生物学特性的影响。方法对培养到第3代的新生SD大鼠髁突软骨细胞加载12、24、36 kPa的静压力,1 h后立即收集样本,同时设不加载力的对照组,用免疫组织化学技术对样本细胞进行染色,用病理图像分析仪分析细胞胞浆中胶原表达强度的变化。结果对于对照组、12、24 kPa组,随着压力的增加,髁突软骨细胞表达Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及蛋白多糖（ PG）增加。与24 kPa组相比,36 kPa组髁突软骨细胞表达Ⅰ型胶原及PG减弱,而Ⅱ、Ⅲ型胶原表达则增加。结论适当的压力刺激可能会使髁突软骨细胞分化更加成熟,但是过大的应力则可能导致髁突软骨细胞生物学特性减弱,从而表现出去分化的某些特征。     

髁突软骨细胞受压力刺激前后的差异蛋白质电泳分析

目的:建立体外培养的髁突软骨细胞加载压力刺激前后双向电泳差异表达谱.方法:利用已建立的髁突软骨细胞的体外培养模型,抽提各组细胞总蛋白质,进行等电聚焦双向电泳,建立压力刺激前后髁突软骨细胞双向电泳差异表达谱.结果:加压组的体外培养的髁突软骨细胞蛋白质双向电泳表达谱与对照组的相比具有显著性的差异,主要表现为图谱斑点的增减以及部分斑点的染色面积和染色深浅发生了明显变化,本实验共发现了10个加压后差异表达蛋白点,其中3个在加压培养后表达消失,1个在加压培养后出现表达,4个在加压培养后表达减弱,有2个蛋白点呈进行性表达增强.结论:压力刺激髁突软骨细胞细胞会造成其表达差异性的蛋白质.     

不同静压力下髁突软骨细胞MMP-13的表达变化研究

目的:探讨在不同强度及不同时间的静压力作用下,髁突软骨细胞中MMP-13表达的变化及意义。方法 :体外分离培养SD大鼠髁突软骨细胞,用甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定;分别用0、50、100、150、200 k Pa静压力进行2 h的加压处理。另外在200 k Pa静压力下,分别对髁突软骨细胞进行0、1、2、4、8和12 h的加压,采用Western blot免疫印迹及实时荧光定量PCR,分析髁突软骨细胞在不同强度及不同时间的静压力加载后,MMP-13的m RNA和蛋白表达变化。结果 :在50~200 k Pa的静压力范围内,随着压力的增大,MMP-13蛋白及m RNA表达水平均呈下降趋势,实验组表达水平均降至对照组(0 k Pa组)以下,且差异有统计学意义(P<0.05)。在200 k Pa的静压力下,随着加压时间的延长,MMP-13表达呈先上升后下降的趋势,且4 h实验组达最高水平(P<0.05)。结论:髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有较好的适应能力,压力的改变可能影响颞下颌关节的适应性改建。     

不同静压力对新生SD大鼠髁突软骨细胞增殖与凋亡的影响

目的：探讨不同静压力对髁突软骨细胞增殖与凋亡的影响。方法：对培养到第3代新生SD大鼠髁突软骨细胞加载0、12、24、36kPa静压力1h后立即收集样本，用流式细胞仪检测细胞凋亡与增殖指数的变化。结果：随着压力的增加（0、12、24、36kPa），除24kPa外，细胞增殖指数和凋亡指数在加力结束时（0h）均减少（P〈0．05），其中，细胞增殖指数在36kPa加力结束时减幅最大，细胞凋亡指数则在12kPa加力结束时减幅最大。结论：在0、12、24、36kPa力值范围内，软骨细胞增殖、凋亡与应力值存在一定的关系，但这并非是简单的线性关系。     

生长期兔髁突软骨细胞体外培养方法及其生物学特性研究

目的 建立髁突软骨细胞体外培养模型,研究其生物学特性。 方法 分离4周龄健康新西兰大白兔双侧髁突软骨,采用胰酶和胶原酶联合消化方法收集4 h和12 h 2个时间点的髁突软骨细胞,连续体外培养并传代至P10。使用倒置显微镜观察细胞形态;采用甲苯胺蓝、阿利新蓝和免疫细胞化学染色对髁突软骨细胞进行鉴定;利用细胞计数绘制细胞生长曲线;通过Western 免疫印迹分析细胞Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和SOX9在蛋白水平的表达情况。采用SPSS13.0软件包对Western 印迹条带灰度值进行统计学分析。 结果 兔髁突软骨细胞体积较大,呈纺锤形或多角形,铺路石样排列,细胞爬片染色结果为阳性。随着细胞传代“成纤维样”细胞比例逐渐加重,P2代之前的细胞形态差异较小。细胞生长曲线显示,兔髁突软骨细胞的体外培养符合经典的S形生长曲线。Western 印迹结果表明,4h和12 h所收髁突软骨细胞Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和SOX9表达无显著差异。 结论 使用本方法培养兔髁突软骨细胞简单有效。髁突软骨细胞体外培养存在去分化现象,但P2代以内的髁突软骨细胞生物学特性相对稳定,适合用于后期实验研究,P3代以后的髁突软骨细胞逐渐丧失原有细胞的特性。     

下颌髁突软骨细胞凋亡的研究

近年来,有关软骨发育和软骨疾病中软骨细胞凋亡及各种调节因素逐渐受到人们重视。本文对下颌髁突软骨及其病变中的细胞凋亡及调节因素作一综述。     

下颌髁突软骨细胞凋亡的研究

近年来,有关软骨发育和软骨疾病中软骨细胞凋亡及各种调节因素逐渐受到人们重视。本文对下颌髁突软骨及其痛变中的细胞凋亡及调节因素作一综述。     

压力对髁突软骨细胞白介素4、6分泌的影响

目的:探讨下颌骨髁突软骨细胞白细胞介素4和白细胞介素6的表达随机械力的变化过程。方法:体外培养下颌骨髁突软骨细胞,采用可控液压细胞加载装置90kPa压强下分别加载60、360min,免疫组化染色观察加压前后白细胞介素4和白细胞介素6的表达、分布变化。结果:正常对照的MCC中IL-4和IL-6只有很弱的表达,90kPa加压60min后IL-6在胞浆、胞核中表达强阳性,IL-4也在胞浆、胞核中阳性表达;加压时间延长至360min后IL-6表达较60min时有所减弱,而IL-4的表达比60min时持续增强。结论:适宜的压力刺激可引起髁突软骨细胞中白介素4、6表达的增强。     

负荷改变对髁突软骨细胞合成蛋白多糖的影响

目的：研究负荷变化对髁突软骨细胞蛋白多糖合成的影响。方法：拔除成年家兔左下磨牙,分别于术后2周、1月和3月取双侧颞颌关节,进行阿辛兰和甲苯胺兰等组织化学染色和免疫组化染色。结果：酸性粘多糖和蛋白多糖术后量均降低,以非拔牙侧更显著,随着缺牙时间的延长这些变化而更显著。结论：异常负荷可导致软骨细胞蛋白多糖合成的减少及其构成的变化,从而使髁突纤维软骨的粘弹性降低。     

静压力下兔髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化

目的 研究兔髁突软骨细胞对静压力的分子生物学响应。方法：体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,使用形态学观察,COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色方法对P2代髁突软骨细胞进行鉴定;100kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3和4 h的加压处理;采用CCK-8检测压力加载后各组细胞活性的变化;通过Western免疫印迹分析髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：兔髁突软骨细胞呈多角形,“铺路石”样排列,细胞爬片COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色鉴定结果为阳性。100kPa静压力加载1 h时,细胞活性显著降低（P=0.04）,但在2~4 h后,细胞活性恢复并与对照组无显著差异。Western印迹结果显示,压力加载3 h和4 h时,COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达显著升高。其中,在压力加载4 h组ALP的表达量比3 h组低。结论：兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力,100kPa静压力加载4 h不会对髁突软骨细胞活性产生不可逆损伤。适宜的压力加载对髁突软骨细胞的成软骨和成骨能力有促进作用。髁突软骨细胞压力微环境的改变,可能影响颞下颌关节适应性改建和颞下颌关节紊乱病的病理过程。     

大鼠髁突软骨细胞冻存复苏后的生物学特性观察

目的观察低温冻存1月后,不同年龄大鼠髁突软骨细胞的生物学特性。方法体外培养出生后1天、7天、14天、28天共4组SD大鼠髁突软骨细胞。对冻存复苏后的细胞进行形态学观察;甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色检测其对糖胺聚糖(GAG)、Ⅱ型胶原的合成能力;台盼蓝拒染试验测定细胞成活率;MTT法观察细胞增殖能力;实时定量-聚合酶链式反应(real time-PCR)检测冻存后细胞增殖核抗原(PCNA)基因表达情况。结果低温冻存后,各年龄组大鼠髁突软骨细胞仍能保持软骨细胞特有的形态及特性;细胞成活率均大于90%;生长曲线近似"S"型;冻存后各年龄组细胞pcna基因表达较冻存前无显著统计学差异(P>0.05)。结论低温冻存1月后的大鼠髁突软骨细胞成活率高,并保持了其生物学特性及增殖活性。     

白介素1受体拮抗剂基因转染髁突软骨细胞的作用

目的:研究经人白介素1受体拮抗剂(hIL-1ra)基因转染后的人颞颌关节髁突软骨细胞对IL-1作用的影响。方法:将hIL-1ra基因以阳离子脂质体介导转染体外培养的人颞颌关节髁突软骨细胞,在转染细胞和对照组细胞培养基中加入IL-1β,描记细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间,MTT法检测细胞增殖情况的变化,硝酸还原酶法测定培养液中NO2-/NO3-浓度的变化。结果:转染细胞与对照组细胞增殖情况存在差异,转染细胞高于对照组,硝酸还原酶法测定细胞培养液中NO2-/NO3-浓度,细胞培养液中NO的生成显著低于对照组(P<0.01)。结论:转染细胞hIL-1ra基因的表达对于IL-1作用存在拮抗和抑制作用。     

周期性单轴压应力对大鼠髁突软骨细胞Stress70/GRP75的早期影响

目的:探讨体外周期性单轴压应力对大鼠髁突软骨细胞糖调控蛋白Stress70/GRP75的早期动态变化影响。方法:利用四点弯曲细胞力学加载仪,对第3代大鼠髁突软骨细胞进行体外周期性单轴压应力加载,力值为4000μstrain,时间分别为0、15、30、60、120、240min;采用Western免疫印迹技术和图像分析技术,研究大鼠髁突软骨细胞糖调控蛋白Stress70/GRP75的动态变化,对结果进行单因素方差分析。结果:4000μstrain周期性单轴压应力作用下,大鼠髁突软骨细胞糖调控蛋白Stress70/GRP75的表达发生变化,0min条带灰度值为114.2±5.08;30min时降至最低,为86.1±5.09(P<0.001);60min后有所回升,至104.0±4.41(P<0.01),但仍表达下调;120min后表达开始增强,灰度值为134.5±3.74(P<0.001)。结论:4000μstrain压应力刺激,对大鼠髁突软骨细胞糖调控蛋白Stress70/GRP75存在时间效应性,初期表达下调;随着应力加载时间延长,其表达反馈增强。     

大鼠髁突软骨细胞发育中差异蛋白的表达变化

目的：初步建立大鼠髁突软骨细胞发育过程中蛋白表达差异谱,寻找并鉴定其差异表达蛋白。方法：体外培养出生后1、7、14、28d共4组SD大鼠髁突软骨细胞,应用甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定软骨细胞。提取各组软骨细胞总蛋白．采用iTRAQ标记定量蛋白．2Dnano—HPLC和基质辅助激光解吸／电离串联飞行时间质谱（MALDI—TOF—TOF）技术动态、定量观察出生后大鼠髁突软骨细胞发育过程中差异蛋白的表达及其量变情况,所得数据用MASCOT软件处理,筛选样本之间有意义的差异蛋白,运用GO法进行蛋白分类。结果：共鉴定500种差异蛋白．其中137种具有可信度表达．包括15种高可信度表达,相对分子量在7806．24～608459．2．主要功能为参与各类代谢及发育过程、细胞骨架结构、信号转导,响应各类刺激、免疫应答以及细胞间联系及运输等。结论：本研究获得了目前较为全面的大鼠髁突软骨细胞发育中差异蛋白表达谱．并运用质谱技术成功鉴定了差异表达蛋白．为进一步研究髁突软骨细胞内蛋白功能及在颞下颌关节疾病中的改变与作用奠定基础。     

体外培养髁突软骨细胞表型特征的研究

目的：研究体外培养的髁突软骨细胞（mandibular condylar chondrocyte,MCC)表型变化的特征。方法：消化法培养2周新西兰白兔的MCC,采用相差显微镜观察、图象分析、MTT、免疫组化等方法对不同代数的MCC进行细胞形态和大小、生长曲线以及Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达等方面的比较。结果：培养早期（1－3代）MCC以多角形为主,5－6代后梭形细胞增多;培养早期MCC的面积较小,大小较为均一;细胞的增殖速度随着传代次数的增加而逐渐减慢;1－3代Ⅱ型胶原的表达率较高,第7代后Ⅰ型胶原的表达率增加。结论：MCC在体外培养时的细胞形态大小的变化、Ⅰ、Ⅱ型胶原表达的更迭等特征与体内MCC从增殖层向钙化软骨层的变化特征近似。MCC在体外培养末期可发生分化。     

Involvement of PI3K/Akt pathway in rat condylar chondrocytes regulated by PTHrP treatment

Objective

The aim of this study was to explore the mutual communication of the parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) and phosphatidylinositol 3-kinase/threonine protein kinase (PI3K/Akt) pathway on the proliferation and differentiation of condylar chondrocytes from Sprague-Dawley (SD) rats.

Methods

Condylar chondrocytes from the condylar cartilage were cultured and an organ culture system of mandibular condyles was employed. The distribution of PI3K, phospho-Akt (p-Akt), and PTHrP in condylar cartilage was detected by either immunohistochemistry or immunofluorescence. The second passage chondrocytes and condyle specimens in the organ culture system were treated with PTHrP, LY294002, PTHrP and LY294002 in combination, or dimethyl sulfoxide (DMSO), separately. The mRNA and protein levels of type II (Col II) and type X collagen (Col X) were investigated by real-time polymerase chain reaction (PCR) and Western blot analysis. The condyle growth in organ culture system was analysed by haematoxylin–eosin staining.

Results

PTHrP, PI3K, and p-Akt were mainly located in the proliferative and hypertrophic zones. PTHrP promoted the proliferation of condylar chondrocytes, while LY294002 limited this effect. The mRNA and protein levels of Col II and Col X in these cells were reduced by PTHrP and enhanced by LY294002. Organ culture showed a significant enhancement of condyle elongation with PTHrP treatment or a combination of PTHrP and LY294002 treatment. After treatment with LY294002, the length of condyles was reduced compared with the samples treated with DMSO.

Conclusions

We conclude that the PI3K/Akt pathway plays an essential role in the proliferation and differentiation of condylar chondrocytes and is a potential target for PTHrP in regulating chondrocyte differentiation at condylar cartilage.     

兔下颌骨髁突软骨年龄相关性改变的组织学研究

目的 探讨不同年龄段兔下颌骨髁突软骨的生理特征变化。方法 选取1、4、12和32周龄健康雌性新西兰大白兔各3只,脱钙处理后进行5 μm 连续切片,苏木精-伊红染色。分别对关节盘所覆盖的髁突表面纤维软骨区域软骨各层厚度进行测量分析。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学处理。结果 髁突软骨全层（P=0.008）、成熟层（P=0.008）和肥大层（P=0.007）在1周和4周组间厚度显著下降,在4~32周内厚度变化不明显。连续各组之间纤维层和增殖层厚度无显著改变;32周组纤维层厚度显著高于1周组（P=0.024）。结论 兔髁突软骨全层、成熟层和肥大层在1~4周内明显变薄,成骨活性大于成软骨活性,为下颌骨生长发育的重要阶段;在4~32周内各层厚度改变不明显,成骨和成软骨活性相对平衡。成年期髁突适应和耐受关节腔微环境变化的能力可能较强。     

骨髓基质细胞诱导分化修复髁突软骨面缺失的实验研究

目的:采用骨髓基质细胞(BMSCs)体内修复髁突软骨全层缺失。方法:15只山羊,9只作为实验组,将BMSCs和少量软骨细胞(7:3比例混合)按5×107/mL与生物可降解材料复合后,植入山羊髁突软骨全层缺失处;对照组6只山羊,髁突软骨全层缺失区植入支架材料,分别于术后4、8、12周每个时间段取材3只实验动物,2只对照组动物;2组分别用HE染色、Ⅱ型胶原分泌的免疫组化法进行评价。结果:实验组术后4周,山羊髁突软骨缺失区能形成成熟的软骨组织,12周时软骨未退变。对照组不能形成成熟的软骨组织。结论:骨髓基质细胞在自体软骨细胞基质的诱导下,可以修复山羊颞下颌关节髁突软骨面全层缺失。