重组腺病毒对烫伤大鼠肝组织核因子—kB活性的调控

目的 探索腺病毒介导IkBα基因对烫伤大鼠肝组织核转录因子NF－kB活性的调控作用。方法 应用重组缺陷型腺病毒载体（AdIkBα)预处理大鼠，烫伤后不同时相点取肝组织，提取组织核蛋白，与r^-32PATP标记的NF－kB特异性探针共同反应，利用凝胶电泳迁移率改变分析方法（EMSA）检测NF－kB/DNA结合性；提取肝组织总RNA，用RT－PCR法检测IL－1β,TNFα mRNA的表达。结果 与正常对照组相比，烫伤组致伤后0．5hNF-kB/DNA结合活性显增强，致伤后24h，仍保持较强结合活性。AdIkBα预处理组，大鼠NF－kB/DNA结合活性略高于正常，但显低于烫伤组。RT－PCR分析，大鼠烫伤后0．5h与对照组相比，IL－1β，TNFα表达显升高，持续致伤后24h;AdIkBα预处理组，IL－β和TNFα表达显低于烫伤组。结论 大鼠严重烫伤后，肝组织细胞内NF－kB迅速活化，IL－1β和TNFα的表达随之显增强，经AdIkBα预处理能显抑制大鼠严重烫伤后肝组织NF－kB的活化，并下调IL－1β、TNFα的表达。     

褪黑素对烧伤脓毒症大鼠肝脏核因子-κB表达的影响

本实验旨在观察褪黑素对烧伤脓毒症大鼠肝脏核因子（NF）-κB表达的影响，为临床防治烧伤脓毒症肝损伤提供依据。[第一段]     

核因子-κBp65特异性小干涉核糖核酸重组腺病毒的抑制作用

目的 在大鼠关节内观察核因子-κB(NF-κB)p65特异性小干涉核糖核酸(siRNA)重组腺病毒对靶基因的抑制作用.方法 在SD大鼠膝关节内,筛选合适的病毒剂量.利用β-gal染色鉴定重组腺病毒感染组织的特异性,应用凝胶电泳迁移率分析(EMSA)测定重组腺病毒对NF-κB转录活性的影响,应用Western blot测定重组腺病毒对软骨和滑膜细胞内NF-κB65的抑制作用.结果 重组腺病毒在大鼠膝关节内的最佳剂量为1.6×108 pfu/ml,可以感染关节内软骨和滑膜组织,并在软骨和滑膜细胞内减低NF-κB转录活性,抑制目的 基因的表达.结论 特异性NF-κBp65siRNA的重组腺病毒载体可以在关节软骨和滑膜细胞内抑制目的 基因的表达.     

核因子-κB反义寡核苷酸对肝纤维化小鼠肝组织核因子-κB活性和病理改变的影响

目的 应用核因子(NF)-κB反义寡核苷酸(ASON)治疗肝纤维化小鼠模型,观察NF-κB p65 ASON对小鼠肝组织NF-κB活性和肝纤维化程度的影响,探讨NF-κB p65 ASON治疗肝纤维化的可能机制.方法 实验小鼠分组:正常组(8只)、肝纤维化模型组(8只)、反义寡核苷酸(NF-κB p65 ASON)治疗组(8只)、正义寡核苷酸(SON)治疗组(8只)、错义寡核苷酸(MSON)治疗组(8只)、NF-κBp65 ASON对照组(8只)、SON对照组(8只)和MSON对照组(8只);采用凝胶迁移率变动分析(EMSA)检测NF-κB DNA结合活性;病理切片(Masson染色)评价肝纤维化小鼠模型肝纤维化程度.结果 NF-κB p65 ASON治疗组小鼠肝组织NF-KB活性(12411.75±502.78)、肝纤维化病理积分(1.13±0.64)比模型组(16 346.88 ±449.05、2.88±0.64)明显降低,差异有统计学意义(P<0.01).soN治疗组(16460.38±575.26、2.75±1.17)和MSON治疗组(15 959.25±746.27、3.00±0.53)的NF-κB活性、肝纤维化病理积分与模型组比较差异无统计学意义(P>0.01).结论 NF-κB p65 ASON能显著抑制小鼠肝组织的NF-κB活性,降低肝纤维化程度.     

复方丹参对大鼠急性脊髓损伤后核因子-κB活性的影响

目的探讨复方丹参对于大鼠急性脊髓损伤后核因子-κB（NF-κB）活性的影响。方法成年Wistar大鼠36只，体重200～250g，雌雄不限，随机分为3组，正常组4只，脊髓损伤后复方丹参处理组（A）和生理盐水对照组（B）各16只，损伤后不同时间点（12h、1d、3d、5d）处死大鼠，用苏木精-伊红（HE）染色观察脊髓组织病理变化，用免疫组化染色检测NF-κB阳性细胞。免疫印记分析法，检测细胞内NF-κB的活性变化。结果HE染色发现脊髓组织病理学改变A组轻于B组。免疫组化免疫印记分析A、B2组均发现NF-κB表达，且NF-κB表达为B组大于A组。结论急性创伤性脊髓损伤后，复方丹参可以抑制NF-κB的活性表达，对减轻NF-κB介导的炎性反应起到有益作用。     

氯胺酮抑制内毒素诱导大鼠肺组织核因子-κB的表达

目的 观察氯胺酮对内毒素大鼠肺组织核因子-κB(NF-κB)活性的影响，探讨氯胺酮抑制炎性反应的机制。方法 成年大鼠24只随机分为四组(每组6只)，对照组，静脉注射生理盐水；内毒素(LPS)组，静脉注射内毒素8mg／kg 气管内注射内毒素100μg／kg；处理组(K4、K8组)，注射LPS后30min静脉分别注射氯胺酮4mg／kg或8mg／kg，随后每60min腹腔注射同等剂量氯胺酮。在注射生理盐水或LPS后240min开胸采集标本，用凝胶电泳迁移改变分析(EMSA)法检测肺组织NF—κB活性；同位素99mTc法测定肺血管通透性；并测血清中MDA和NO^-2／NO^-3浓度。结果 LPS组肺组织NF-κB活性较对照组明显升高，血中MDA和NO^-2／NO^-3浓度也较对照组明显增加；处理组肺组织NF—κB活性和血中NO^-2／NO^-3浓度较LPS组明显下降，与对照组比较差异无显著性。结论 氯胺酮能明显抑制内毒素诱导大鼠肺NF-κB活性，降低血中NO^-2／NO^-3含量，对内毒素所致肺损伤有保护作用。     

可调控性人PTEN基因重组腺病毒的构建与表达

目的　体外构建和表达可调控性人抑癌基因PTEN重组腺病毒。方法　将人PTEN基因全长cDNA约 1.4kb经过穿梭载体 ,与可调控性腺病毒载体骨架连接 ,得到重组人PTEN基因腺病毒 (Ad PTEN) ,酶切与聚合酶链反应 (PCR)鉴定后 ,在HEK2 93细胞包装、扩增 ,空斑试验测定病毒滴度 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Westernblot法分别在mRNA、蛋白水平检测PTEN的表达。Ad X TRE βgal病毒作为对照。 结果　构建的Ad PTEN病毒滴度为 1.8× 10 7pfu/ml ,转染前列腺癌细胞株PC 3后RT PCR扩增出特异条带 ( 4 62bp) ,Westernblot检测PTEN蛋白 ( 60×10 3 )有高表达 ,对照病毒转染后未测到PTEN的表达。结论　用体外连接法成功地构建了可调控性人抑癌基因PTEN重组腺病毒载体 ,并得到了正确、特异的表达。     

核因子-κB参与人骨髓间充质干细胞的增殖上调研究

目的探讨核因子(NF)-κB在人类骨髓间充质干细胞增殖调节中的作用。方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞后:①蛋白免疫印迹法(Western-blot)观察脂多糖(LPS)作用下NF-κB活性亚型p65及其活性形式磷酸化p65的表达水平随时间变化的情况;②Western-blot法观察NF-κB活性抑制剂PDTC对磷酸化p65表达水平影响;③Western-blot法检测PDTC与LPS单独及共同作用下,细胞增殖标志物增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平的变化;④MTT法检测PDTC与LPS作用下细胞增殖水平的变化。结果 LPS可显著上调p65及其磷酸化状态的表达水平,上调作用可被PDTC部分地抑制;NF-κB上调后可提高细胞增殖蛋白PCNA的表达水平,并促进细胞增殖。结论初步证实了NF-κB参与人骨髓间充质干细胞增殖的调节。     

烫伤大鼠组织肿瘤坏死因子mRNA表达与内毒素血症的关系

目的 探讨烫伤后不同组织肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）ｍＲＮＡ的动态表达及其与内毒素血症的关系。方法 采用大鼠３５％体表面积Ⅲ度烫伤模型,实验随机分为正常对照组、烫伤组、多粘菌素Ｂ治疗组。血浆内毒素水平采用改良过氯酸预处理血浆偶氮显色法鲎试验定量测定;组织ＴＮＦ－αｍＲＮＡ含量采用逆转录聚合酶链反应检测。结果 烫伤后门静脉及体循环内毒素水平均显著升高,８ｈ达高峰,２４ｈ则逐渐下降。给予低剂量多粘菌素Ｂ     

烫伤大鼠创面脓毒症发生后肝组织中脂代谢相关基因表达水平的变化

目的检测烫伤大鼠创面脓毒症发生后肝脏组织中脂代谢相关基因表达水平的变化，并分析其意义。方法将60只背部30％TBSAⅢ度烫伤大鼠随机分为创面脓毒症组和对照组，每组30只。创面脓毒症组大鼠创面涂布铜绿假单胞菌菌液，并对相应指标进行检测以确定该组大鼠是否符合创面脓毒症诊断标准。对照组除创面不涂菌液外，其余操作及检测同创面脓毒症组。两组大鼠于伤后96h断颈处死，通过基因芯片杂交方法检测两组肝组织中表达水平有显著差异的基因，并按其功能筛选出与脂代谢相关的基因。结果两组大鼠肝组织中共检出47种表达水平差异较显著的基因，其中9种基因与脂代谢相关。创面脓毒症组大鼠这9种基因中表达上调的是与脂肪酸转运和活化功能相关的多种酶基因，表达下调的是与脂肪酸在线粒体内氧化供能相关的多种酶基因。结论烫伤大鼠创面脓毒症的发生引起肝脏组织中多种脂代谢相关基因表达水平改变，加重了烫伤后的脂代谢紊乱；初步判断脂代谢障碍的发生部位为线粒体。     

核因子-κB与急性肺损伤

核因子-κB是一种对许多参与免疫与炎症反应等有关基因的表达具有调控作用的转录因子。其在急性肺损伤发 病机制及诊疗中的作用已日益引起人们关注。本文就核因子-κB构成、活化、生物学效应及其在急性肺损伤中的作用作一综 述。     

核因子-κB活性在创伤性炎症大鼠肝脏损伤中的变化及其意义

目的探讨核因子-kB（NF-kB）活性在创伤性炎症大鼠肝脏损伤中的变化及其意义。方法Wistar大鼠60只，随机分成对照组和创伤性是症组。运用匀浆法提取肝细胞的核蛋白，运用凝胶阻滞实验检测创伤性炎症术后肝脏组织NF-kB的活性，检测血浆转氨酶的水平，在光镜下观察肝细胞损伤程度，电镜下观察肝脏超微结构改变，以线拉体的肿胀程度作为肝细胞损伤的评价指标。结果大鼠创伤性炎症术后第3小时，肝脏NF—kB的活性开始升高，第12小时达高峰，第72小时后基本降至正常。血浆ALT含量在伤后明显上升。于第24小时达高峰，同时肝细胞出现明显的水肿、变性和坏死，肝小叶结构破坏明显。结论大鼠创伤性炎症肝脏损伤后，NF—kB活性明显升高。与肝脏结构和功能改变基本一致，NF—kB在创伤性炎症肝脏损伤中具有重要意义。     

蜂毒素基因重组腺病毒转染对肝癌细胞周期及磷脂酶A2表达的影响

蜂毒素(Melittin,Mel)是一种动物毒素,具有显著的抗肿瘤作用,但其溶血副作用限制了临床应用。为达到减毒增效的目的,将编码蜂毒素的基因置于人甲胎蛋白(AFP)基因启动子后,以复制缺陷型腺病毒为载体构建重组腺病毒。在初步证实该重组腺病毒对AFP阳性肝癌细胞具有特异性杀伤作用的基础上,通过观察其对肝癌细胞周期及磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)表达的影响,探讨其作用机制。     

氟伐他汀对糖尿病大鼠肾组织核因子-κB活性的影响

目的：观察氟伐他汀对实验性2型糖尿病大鼠肾组织中核因子-κB（NF-κB）活化的影响。方法：应用单侧肾切除后饮食加小剂量链脲佐菌素（STZ）方法,制备2型糖尿病肾病（DN）大鼠模型。将实验动物随机分为假手术组、2型糖尿病组及氟伐他汀治疗组（2mg·kg^-1·d^-1）。给药治疗6周后,检测各组动物血糖、血脂、血肌酐（Scr）、24h尿蛋白定量（TP／24h）等指标。采用电泳迁移率变动分析（EMSA）方法检测NF-κB活性变化,采用RT—PCR方法检测单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）mRNAg达水平。结果：小剂量氟伐他汀未影响血糖、血脂。治疗6周后,可明显降低2型DN大鼠肾组织中NF-κB活性,减少MCP-1 mRNA表达,并降低蛋白尿。结论：氟伐他汀对实验性2型糖尿病大鼠具有非依赖降脂的肾脏保护作用,其机制至少部分与降低肾组织中NF-κB活性,下调MCP-1基因表达有关。     

厄贝沙坦对2型糖尿病大鼠肾组织中核因子-κB的调节

目的 建立2型糖尿病大鼠模型。观察血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)受体拮抗剂厄贝沙坦对该模型大鼠肾组织中核因子-κB(NF-κB)活化的影响。方法 应用高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素(STZ)制备2型糖尿病大鼠模型。采用免疫组织化学技术检测各组肾小球中NFκB及单核/巨噬细胞(ED-1)的表达水平。结果 (1)高糖高脂饮食加低剂量STZ使大鼠血糖升高(22.48±6.54 vs 4.71±0.34,P<0.01),并出现胰岛素抵抗。继续喂养6周后,模型成功动物具有血胰岛素不低,内生肌酐清除率、尿微量白蛋白、肾重/体重增加等特征。(2)糖尿病组大鼠肾组织中NF-κB、ED-1表达较对照组明显增加。厄贝沙坦治疗6周后,NF-κB活性降低(5.10±1.80 vs 8.45±1.09,P<0.01),单核/巨噬细胞浸润减轻,肾功能指标及组织病理学损害得以改善。结论 (1)通过饮食加小剂量STZ的方法,成功复制了2型糖尿病大鼠模型。该模型在6周后已出现糖尿病肾病的早期改变。(2)上述大鼠肾组织中NF-κB活性增加,厄贝沙坦的肾脏保护作用至少部分与减少肾组织中激活的NF-κB表达,减轻肾组织中单核/巨噬细胞浸润有关。     

核因子-κB活性在创伤性炎症大鼠肝脏损伤中的变化及其意义

目的探讨核因子-κB(NF-κB)活性在创伤性炎症大鼠肝脏损伤中的变化及其意义。方法 Wistar 大鼠60只,随机分成对照组和创伤性炎症组。运用匀浆法提取肝细胞的核蛋白,运用凝胶阻滞实验检测创伤性炎症术后肝脏组织NF-κB的活性,检测血浆转氨酶的水平,在光镜下观察肝细胞损伤程度,电镜下观察肝脏超微结构改变,以线粒体的肿胀程度作为肝细胞损伤的评价指标。结果大鼠创伤性炎症术后第3小时,肝脏NF- κB的活性开始升高,第12小时达高峰,第72小时后基本降至正常。血浆ALT含量在伤后明显上升,于第24小时达高峰,同时肝细胞出现明显的水肿、变性和坏死,肝小叶结构破坏明显。结论大鼠创伤性炎症肝脏损伤后,NF-κB活性明显升高,与肝脏结构和功能改变基本一致,NF-κB在创伤性炎症肝脏损伤中具有重要意义。     

大鼠TRESK基因重组腺病毒载体的构建

目的 构建大鼠TRESK基因重组腺病毒载体.方法 从大鼠背根神经节细胞中克隆TRESK全长cDNA,进行PCR鉴定及DNA测序验证,构建以CMV启动子转录调控的pAd/CMV/V5DEST-TRESK.转化DH5α大肠杆菌,挑选阳性重组克隆行PCR鉴定并行DNA测序.将测序正确的质粒经PacⅠ酶切线性化,转染包装293T细胞,包装产生腺病毒,逐孔稀释滴度法测定病毒滴度.结果 从大鼠背根神经节细胞中克隆的TRESK全长cDNA为781 bp,DNA测序验证DNA序列与GeneBank 中收录的大鼠TRESK序列完全一致.以pAD-GFP空载体为对照,pAD/CMV/V5-DEST-TRESK gDNA为模板的PCR扩增,目的 片段781 bp,鉴定结果 与预期相符.腺病毒滴度为1.31×109 TU/ml.结论 本研究成功地构建了大鼠TRESK基因重组腺病毒载体:pAD/CMV/V5-DEST-TRESK.

Abstract：

Objective To construct rat TRESK gene recombinant adenovirus expression vector.Methods TRESK full-length cDNA was cloned from rat dorsal root ganglion cells and confirmed by RT-PCR and sequencing. pAd/CMV/V5-DEST-TRESK was then constructed under the control of CMV-promotor. DH5α colibacillus was translated and the positive recombinants were subsequently identified by PCR and DNA sequencing. 293T cells were cotransfected and packed to produce adenovirus. Results The titer of virus was tested using Hole-by-dilution titer method. The full length of TRESK from rat dorsal root ganglion cells is 781 bp. It was demonstrated that the DNA sequencing was completely consistent with TRESK sequencing of rat recorded in GeneBank. The PCR amplification of the pAd/CMV/V5-DEST-TRESK gDNA was matched with pAD-GFP blank vector as anticipated. The titer of the concentrated virus was 1.31×109 TU/ml. Conclusion Rat TRESK gene recombinant adenovirus vector is constructed successfully.     

烫伤大鼠组织肿瘤坏死因子mRNA表达与内毒素血症的关系

目的探讨烫伤后不同组织肿瘤坏死因子(TNF-α)mRNA 的动态表达及其与内毒素血症的关系。方法采用大鼠35%体表面积Ⅲ度烫伤模型,实验动物随机分为正常对照组、烫伤组、多粘菌素 B 治疗组。血浆内毒素水平采用改良过氯酸预处理血浆偶氮显色法鲎试验定量测定;组织 TNF-α mRNA 含量采用逆转录聚合酶链反应检测。结果烫伤后门静脉及体循环内毒素水平均显著升高,8h 达高峰,24h 则逐渐下降。给予低剂量多粘菌素 B 治疗可显著降低门静脉内毒素峰值(P<0.05)。另一方面,烫伤后2h 肺、肝、肠、肾等组织 TNF-α mRNA 表达较伤前值即有显著升高(P<0.05～0.01),烫伤后8h 达高峰,约为伤前值的1.7～2.6倍,且一直持续至伤后24h。给予多枯菌素 B 抗内毒素治疗后可不同程度抑制 TNF-α mRNA 的表达(P<0.05～0.01)。相关分析显示,门静脉内毒素水平同肺、肠、肾组织 TNF-α mRNA 呈显著正相关关系(r 值分别为0.365,0.381,0.484,P<0.05),但与肝组织无显著相关。结论肺、肝、肠、肾等组织 TNF-α mRNA 表达在烫伤早期即显著增多,并呈一逐渐升高的趋势。创伤后内毒素血症对机体多种组织 TNF-α基因表达具有重要影响。