Smad3促进大鼠卵巢颗粒细胞自噬

目的 探讨Smad3基因对大鼠卵巢颗粒细胞自噬的影响。方法 21d SD雌性大鼠腹腔注射孕马血清20 IU/只,48h后收集卵巢颗粒细胞进行原代培养。培养细胞分为3组：空白对照组：培养液中不加任何处理因素;敲低实验组：培养液中加入Smad3基因特异性的SiRNA及转染试剂RNAiMAX;过表达实验组：培养液中加入Smad3真核表达质粒及转染试剂Lipo 2000。免疫细胞化学方法鉴定培养细胞纯度;Western blotting方法检测Smad3蛋白表达变化,检测转染效率。Smad3基因敲低及过表达后,Western blotting方法检测自噬体膜形成标志蛋白LC3B及自噬调控相关蛋白Bcl-2的蛋白表达变化。 结果 Smad3敲低时,LC3B蛋白Ⅱ型与Ⅰ型的比值(LC3BⅡ/Ⅰ)变化不明显,Bcl-2蛋白表达明显降低;Smad3过表达时,LC3BⅡ/Ⅰ明显增加,Bcl-2蛋白表达明显增加。 结论 Smad3基因特异的SiRNA及真核表达质粒可以有效地转入大鼠卵巢颗粒细胞中,Smad3基因促进大鼠卵巢颗粒细胞自噬,其机制可能与Bcl-2蛋白相关。     

Smad2/Smad3蛋白在大鼠卵巢颗粒细胞中的表达及FSH对其活化的影响

目的 研究Smad2/Smad3蛋白在大鼠卵巢颗粒细胞中的表达及FSH对其活化的影响.方法 21d SD雌性大鼠,注射PMSG 20IU,48h后对卵巢颗粒细胞进行原代培养,用TGFβRⅡ抗体及不同浓度的FSH对细胞进行不同时间的处理,通过免疫细胞化学方法观察TGFβ信号通路中Smad2/Smad3和P-Smad2/P-Smad3(磷酸化Smad2/3)表达的变化.结果 1.Smad2/Smad3主要定位于卵巢颗粒细胞胞质,其活化形式P-Smad2/P-Smad3有少量表达;2.经FSH处理后, Smad2/Smad3向核内转移增多,P-Smad2/P-Smad3的表达增强,并与FSH的作用时间及剂量呈正相关性;3.TGFβRⅡ被抗体完全中和后再用FSH处理,Smad2/Smad3的核阳性率无显著增多, P-Smad2/P-Smad3的表达未见明显增强.结论 1.FSH促进Smad2/Smad3的磷酸化;2.FSH对 Smad2/Smad3的激活作用与TGFβ受体密切相关.     

卵泡刺激素调节大鼠卵巢颗粒细胞中Smad2/Smad3蛋白的表达及磷酸化

目的:研究卵泡刺激素(FSH)对大鼠卵巢颗粒细胞中Smad2/Smad3蛋白的调节。方法:21dSD雌鼠,腹腔注射孕马血清20IU,对颗粒细胞进行原代培养,用转化生长因子β受体Ⅱ(TβRⅡ)抗体中和卵巢颗粒细胞表面TβRⅡ,以阻断TGFβ/Smads信号通路,再以不同浓度的FSH对细胞进行不同时间的处理,免疫印迹法检测TGFβ信号通路中TβRⅡ、Smad2/Smad3及P-Smad2/P-Smad3蛋白的表达。结果:TβRⅡ、Smad2/Smad3、P-Smad2/P-Smad3蛋白的表达量与FSH的作用呈时间依赖性显著增强;TGFβ/Smads信号通路被阻断后再用FSH处理,Smad2/Smad3、P-Smad2/P-Smad3蛋白的表达量没有明显变化;细胞表面TβRⅡ恢复后,Smad2/Smad3、P-Smad2/P-Smad3蛋白的表达量有少量增加。结论:FSH刺激大鼠卵巢颗粒细胞中Smad2/Smad3的表达和磷酸化;FSH对Smad2/Smad3的激活作用在相当程度上依赖于TβRⅡ。     

Smad2和Smad4蛋白在成年大鼠睾丸的表达

目的 探讨转化生长因子－β超家族肽类的细胞内信号转导分子Smad2和Smad4蛋白在成年大鼠睾丸的表达及在精子发生中的作用机理。方法 用免疫组织化学ABC法结合葡萄糖氧化酶－DAB－硫酸镍铵增强技术,检测成年大鼠睾丸Smad2和Smad4蛋白的表达和定位。结果Smad2蛋白主要表达在大鼠睾丸生精小管的精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、支持细胞和间质细胞中,免疫反应物质主要定位于细胞质,胞核为阴性;而Smad4蛋白同主要表达于间质细胞的胞质中,支持细胞呈弱阳性染色,结论 Smad2蛋白主要表达于睾丸生精小管各级生精细胞,Smad4蛋白表达于间质细胞,为揭示TGF－β超家族在精子发生中的分子机理提供了直接证据。     

Smad2/3与Smad7在大鼠化疗性卵巢早衰卵泡中的表达和意义

目的 探讨顺铂对大鼠卵巢结构和功能损伤的影响及其可能的分子机制。方法 3月龄SD 雌性大鼠随机分为对照组（C组,5只）和化疗组（H组,5只）。H组给予每只大鼠腹腔注射顺铂2 mg/（kg.d）,C组给予腹腔注射等体积生理盐水,连续注射7 d后检测大鼠卵巢指数（卵巢湿重/体重）;酶联免疫吸附法检测血清雌二醇（E₂）和促卵泡刺激素（FSH）水平;苏木素-伊红染色观察卵泡发育并计数各级卵泡;免疫组织化学和Real-time PCR法检测各组Smad2、磷酸化Smad2（p-Smad2）、Smad3、磷酸化Smad3（p-Smad3）、Smad4和Smad7的蛋白和mRNA表达。结果 与C组相比,H组大鼠卵巢体积减小,生长卵泡数明显减少（P<0.05）,大鼠卵巢指数下降（P<0.05）,血清中E2水平降低和FSH水平上升（P<0.05）。免疫组织化学和Real-time PCR结果显示,Smad2（p-Smad2）、Smad3（p-Smad3）、Smad4和Smad7蛋白在卵巢各级卵泡均有表达,H组Smad2蛋白和mRNA表达增加（P<0.05）,Smad2磷酸化水平（p-Smad2）表达增高（P<0.05）;Smad3、Smad4和Smad7蛋白和mRNA表达减少（P<0.05）,p-Smad3 表达降低（P<0.05）。结论 顺铂诱导大鼠卵泡损伤并促进卵巢早衰,引起卵泡细胞内Smad2表达增加,Smad3、Smad7表达降低,Smad细胞内信号通路参与了化疗性卵巢损伤的过程。     

Smad7过度表达抑制3T3细胞增殖和TGF-β1基因表达

研究Smad7过度表达对TGF β1基因表达的调控和对 3T3细胞增殖的影响。实验将Smad7质粒 ,通过脂质体介导转染NIH3T3细胞 ,应用RT PCR方法鉴定转染结果和检测TGF β1mRNA的表达 ,以及用免疫细胞化学检测TGF β1蛋白的表达情况 ,并观察基因转染对细胞增殖的影响。结果显示转染Smad7后 ,NIH3T3细胞中TGF β1mRNA的表达显著减少 (P <0 0 5 ) ,TGF β1蛋白的表达下降 ,细胞增殖明显减缓 (P <0 0 5 )。提示Smad7过度表达能够抑制 3T3细胞的增殖和TGF β1基因的表达 ,可以通过阻断TGF β细胞内信号传导来调控TGF β1的生物学行为。     

胰岛素促进体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞增殖

目的：研究胰岛素对体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响,探讨胰岛素的促增殖作用是否与浓度相关。方法：未成熟小鼠卵巢颗粒细胞原代培养,四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定颗粒细胞增殖指数,观察不同浓度胰岛素对颗粒细胞增殖的影响。结果：与对照组相比,5ng·ml^-1。胰岛素对颗粒细胞没有促增殖作用（P〉0.05）,10ng·ml^-1有促增殖作用（P〈0.05）,100ng·ml^-1、1000ng·ml^-1的促增殖作用更强（P〈0.01）,100ng·ml^-1、1000ng·ml^-1作用无明显差异（P〉0.05）。结论：生理浓度的胰岛素能促进颗粒细胞增殖,高浓度胰岛素促增殖作用更强,本实验为进一步研究高胰岛素血症在多囊卵巢综合症（PCOS）的卵泡发育停滞机制奠定基础。     

转化生长因子-β和Smad4在绝经过渡期大鼠卵巢颗粒细胞中的表达

目的 探讨转化生长因子-β（TGF-β）、Smad4 在绝经过渡期大鼠卵巢颗粒细胞中的表达,分析其与卵巢功能衰退的关系。 方法 雌性SD大鼠分为对照组（C组,6月龄,阴道涂片筛选,n=9）、绝经过渡期组（MT组,12~14月龄,阴道涂片筛选,n=8）,大鼠麻醉处死后迅速取出卵巢,采用机械分离方法释放卵泡颗粒细胞,于CO₂培养箱中培养,利用免疫细胞化学法检测促卵泡刺激素受体（FSHR）蛋白的表达,鉴定卵巢颗粒细胞;免疫细胞化学法检测TGF-β、Smad4蛋白在两组卵巢颗粒细胞的表达;采用Real-time PCR的方法检测各组颗粒细胞中TGF-β、Smad4 mRNA的表达。 结果 免疫细胞化学显示分离培养的颗粒细胞纯度＞95%,MT组TGF-β、Smad4蛋白表达水平低于对照组（P<0.05）;Real-time PCR结果显示,两组均有TGF-β、Smad4 mRNA的表达,MT组TGF-β、Smad4 mRNA表达水平显著低于对照组（P<0.05）。 结论 TGF-β、Smad4参与绝经过渡期大鼠卵巢功能的衰退过程,绝经过渡期大鼠功能衰退的部分原因可能与卵巢颗粒细胞中TGF-β、Smad4 的表达降低有关。     

修复相关基因Smad3的研究进展

修复相关基因Smad3及其产物对创面愈合非常重要。Smad3基因的失控可能是创面愈合延迟、不愈合或过度愈合 (增生瘢痕形成 )的真正原因。Smad3蛋白通过介导 β转化生长因子 (TGF β)的细胞内信号传递和调节角化细胞及单核细胞的功能 ,发挥其生物学活性     

Smad3基因敲除小鼠肾Smad2和p-Smad2表达的变化

目的:观察Smad3基因敲除小鼠肾Smad2和p-Smad2表达的变化,探讨Smad3基因敲除小鼠肾是否有Smad2和p-Smad2代偿性增加.方法:4只Smad3基因敲除小鼠,10只野生型小鼠,应用免疫组织化学显色技术,检测Smad2和p-Smad2蛋白的定位和表达情况,并用Motic病理图像分析系统对图像进行半定量分析.结果:野生型小鼠肾Smad2蛋白在肾远端小管和肾集合管细胞胞质中有广泛弱表达,p-Smad2蛋白在肾远端小管和肾集合管细胞胞质、胞核中也有弱表达,而Smad3基因敲除小鼠的Smad2和p-Smad2的表达比野生型小鼠有显著升高.结论:Smad3基因敲除能引起小鼠肾Smad2和p-Smad2表达的代偿性增加.     

siRNA沉默Smad3对肝星状细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究

目的: 观察 Smad3 小干扰RNA(siRNA-Smad3)沉默肝星状细胞(HSCs) Smad3 基因对肝星状细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法: 肝星状细胞株HSCs-T6分为3组:空白对照组、阴性对照组、siRNA-Smad3转染组。siRNA-Smad3转染HSCs细胞株,转染不同时间后,CCK-8检测HSCs增殖的变化,流式细胞术检测HSCs凋亡的变化,免疫细胞化学法检测HSCs凋亡相关蛋白P53和Bcl-2表达的变化。结果: (1)24 h、48 h、72 h siRNA-Smad3转染组HSCs增殖受到显著抑制且凋亡明显增多(P<0.01)。(2)转染48 h后,siRNA-Smad3转染组P53蛋白表达显著增多,Bcl-2蛋白表达显著减少(P<0.01)。结论: siRNA-Smad3沉默Smad3基因可以在一定时间内显著抑制HSCs的增殖并诱导其凋亡,其可能通过上调凋亡相关蛋白P53表达、下调Bcl-2的表达来发挥诱导凋亡的作用;Smad3沉默有望成为抗肝纤维化治疗的一个新途径。     

siRNA沉默Smad3对人KFB细胞增殖、凋亡及合成MMP3的影响

目的 研究siRNA特异性沉默Smad3基因对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast,KFB)增殖、凋亡及合成基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase3,MMP3)的影响.方法 设计合成3对Smad3特异性siRNA片段(Smad3-siRNA-Y1,Y2,Y3)和1对无关干扰片段,转染人KFB细胞,RT-PCR和Western blot方法检测Smad3-siRNA片段对Smad3基因的特异性沉默效果,MTT法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡的变化,免疫细胞化学法检测MMP-3表达量的变化.结果 75 nmol/L Smad3-siRNA-Y1处理KFB细胞48小时后可特异并有效地抑制Smad3基因的表达;抑制细胞增殖,使S期细胞减少,G0/G1幅期细胞增多;凋亡指数增加;细胞表达MMP-3增加.结论 Smad3-siRNA可特异性抑制KFB细胞中Smad3基因表达,明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,并加快其合成MMP3.     

MiR-382促进大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖

目的 探讨miR-382对大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖和凋亡的影响。方法 BRL-3A细胞瞬时转染miR-382的模拟物和抑制物48 h, MTT法测定细胞活性;流式细胞术检测细胞周期;Real-time PCR检测细胞增殖和凋亡相关基因的表达情况。结果在 大鼠BRL-3A细胞中,转染模拟物可以显著增加miR-382的表达,转染抑制物可以显著降低miR-382的表达(P＜0.01)。MTT检测表明,miR-382过表达后,BRL-3A细胞活性明显提高;流式细胞术检测表明,miR-382过表达组S期的细胞数明显增加,而miR-382干涉组S期的细胞数明显减少;用Real-time PCR检测细胞增殖/凋亡相关基因mRNA表达水平表明,miR-382过表达后,BRL-3A细胞增殖相关基因增殖细胞核抗原（PCNA)、Bcl-2和Ccnd1的mRNA表达水平上调,细胞凋亡相关基因Caspase-3和Bax的mRNA表达水平下调,而miR-382干涉组与上述结果相反。结论 miR-382通过促进细胞增殖相关基因表达,抑制细胞凋亡相关基因表达而促进大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖。     

SnoN和Smad2/3信号蛋白与糖尿病大鼠肾小管-间质纤维化的关系

目的 观察核转录共抑制因子SnoN和Smad2/3信号蛋白在糖尿病（DM）大鼠肾组织中的动态表达,并初步探讨它们与糖尿病肾病（DN）肾小管-间质纤维化的关系。方法 尾静脉注射链尿佐菌素（STZ）复制DM大鼠模型,随机分为DM2、4、8、12、16和24周组,每组均设鼠龄匹配的正常对照组(n=6)。免疫组化及Western blotting法检测肾组织SnoN、转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad2/3、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤连蛋白（FN）的蛋白表达;RT-PCR检测SnoN的mRNA;生化方法测血糖、血肌酐及24h尿蛋白量。结果 DM4周起肾组织中SnoN蛋白表达明显减少(P < 0.01),DM各组SnoN的mRNA表达无变化;TGF-β1、Smad2/3及FN的蛋白表达随DM病程进展逐渐增多;DM12周始肾小管上皮细胞可见α-SMA阳性表达。结论 SnoN蛋白表达减少与TGF-β1/Smad信号通路共同参与了DN的发生发展过程。     

跨种属研究Smad3在肝癌组织中的表达及意义

 目的：研究Smad3在人、大鼠、树鼩等不同种属的肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达和意义,进一步验证跨种属筛选肝癌关键蛋白研究策略的可行性。方法：采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测人、大鼠和树鼩的肝癌及其相应癌旁组织以及正常肝组织中Smad3 mRNA和蛋白表达水平。结果：Smad3 mRNA在人、大鼠和树鼩的肝癌中表达水平均低于其相应的癌旁组织（均P<0.05）;在大鼠肝癌组织中的表达低于正常肝组织（P<0.05）;在树鼩癌旁组织中的表达高于正常肝组织（P<0.05）;其余各组织间mRNA表达水平的差别无统计学意义（均P>0.05）。Smad3蛋白在人和大鼠的肝癌组织中的表达水平均低于其相应的癌旁组织及正常肝组织（均P<0.05）;在树鼩肝癌组织中的表达水平也低于相应的癌旁组织和正常肝组织,但差别无统计学意义（均P>0.05）;3个种属的癌旁组织与正常肝组织比较,差别无统计学意义（均P>0.05）。结论：Smad3在人、大鼠和树鼩3个种属的肝癌组织中的mRNA和蛋白表达水平均下调,提示该蛋白表达水平的改变可能在肝癌发生发展中起重要作用,有可能成为防治肝癌的靶分子。