Jagged1对海马放射状胶质细胞增殖和向神经元分化的影响

目的探讨Jagged1在体外培养的海马放射状胶质细胞增殖和向神经元分化中的作用。方法体外培养海马放射状胶质细胞,在培养液中加入Notch信号通路的激动剂Jagged1和(或)抑制剂{氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯,DAPT},将细胞分为空白对照组、Jagged1组、Jagged1联合DAPT组、DAPT组;细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测各组细胞活力;免疫荧光法检测脑脂结合蛋白(BLBP)/Ki67双标阳性细胞数及分化所得的微管相关蛋白-2(MAP-2)阳性细胞数。结果 Jagged1组中细胞活力明显高于其他各组,并且Jagged1组中BLBP/Ki67双标阳性细胞及分化所得的MAP-2阳性细胞数也多于其他各组。结论 Jagged1能够促进体外培养的海马放射状胶质细胞增殖,并且能够促进其更多地向神经元分化。     

海马放射状胶质细胞的体外诱导激活及其意义

为探讨海马放射状胶质细胞在切割穹窿海马伞侧海马提取液的诱导下形态发生的变化,将培养的海马胶质细胞接种于24孔培养板中,分成诱导组和对照组,诱导组加入含5%切割穹窿海马伞侧海马提取液的DMEM/F12培养液,对照组加入单纯的细胞培养液,分别于培养后1、3、7和14d时行BLBP免疫荧光检测和Hoechst标记。计算两组各天时BLBP阳性细胞占Ho-echst阳性细胞的百分比,并用LeicaQiwn图像处理软件检测BLBP阳性细胞的周长和面积(含突起)。Stata8.0统计软件行组间比较。结果显示,1d时诱导组BLBP阳性细胞的比例稍高于对照组,两组细胞胞体均较小,突起均较短较细,无明显差异;3d时,诱导组BLBP阳性细胞的比例明显高于对照组,且胞体较大,突起较粗较长;7d时诱导组BLBP阳性细胞的比例明显高于对照组达到高峰,胞体更大,突起更粗更长交织成网;14d时两组BLBP阳性细胞的比例均稍有降低,但诱导组的比例仍明显高于对照组,两组细胞的胞体稍变小,突起稍变细变短。上述结果提示,切割穹窿海马伞侧海马提取液可明显地诱导BLBP阳性放射状胶质细胞增殖,并使胞体变大,突起变粗变长,呈"激活"状态。     

切割穹窿海马伞海马提取液和银杏叶提取物联合诱导海马NSCs向胆碱能神经元的分化

为探讨切割穹窿海马伞海马提取液和银杏叶提取物(extract of ginkgo bilobo,EGb)在海马NSCs向胆碱能神经元定向分化中的作用,分别制备大鼠穹窿海马伞切割侧和正常侧海马提取液;将从鼠胚海马中分离扩增的NSCs球分成4组,应用不同的培养液促其分化:(1)联合组:含切割侧海马提取液和银杏内酯的DMEM/F12培养基;(2)提取液组:含切割侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(3)EGb组:含银杏内酯的DMEM/F12培养基;(4)对照组:含正常侧海马提取液的DMEM/F12培养基。培养14d后行ChAT免疫荧光检测,计算ChAT阳性神经元的分化率,图像处理细胞面积和周长。结果显示联合组各项指标均明显优于其它各组(P<0.01);提取液组、EGb组各项指标也均优于对照组(P<0.05);细胞面积提取液组优于EGb组(P<0.05),细胞周长EGb组优于提取液组(P<0.05),两组ChAT阳性神经元分化率无明显差异(P>0.05)。上述提示切割穹窿海马伞的海马提取液和EGb联合应用可诱导海马NSCs分化为更多、更为成熟的胆碱能神经元。     

穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用

目的 探讨穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元和AchE阳性神经元的影响。方法 切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,14d后取两侧海马制成提取液;将神经干细胞接种于3块24孔培养板中,每板分成切割组、正常组和对照组各8孔,前2组分别加入切割侧和正常侧海马提取液。第1、2块分别于第7d和14d时行MAP-2免疫荧光检测;第3块于10d时行AChE组织化学染色。计数MAP-2和AChE阳性神经元数,观察胞体大小和突起长度。结果 切割组第7d时MAP-2阳性神经元较多,胞体大、突起长,14d时细胞进一步迁移、成熟;正常组第7d时仅见少量突起短的MAP-2阳性神经元,14d时细胞稍增多,突起稍增长：对照组第7d时未见MAP-2阳性神经元,14d时仅有少量胞体小、突起短的MAP-2阳性神经元。第10d切割组AChE阳性神经元较多,突起多而长,正常组仅见少量无突起的AChE阳性神经元,对照组未见AChE阳性神经元。结论 穹窿海马伞切割侧海马提取液可明显促进神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元。     

大鼠穹隆海马伞切割对海马伞内神经干细胞再生的影响

目的 检测损伤的穹隆海马伞内自体神经干细胞的再生情况.方法 SD大鼠7只,切割左侧穹隆海马伞,术后腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU).术后7d取脑组织制备冷冻切片,行Nestin、BrdU免疫荧光检测;取穹隆海马伞组织进行神经干细胞的体外分离培养,对获得的细胞球进行增殖性、胚胎性以及多分化潜能的检测.结果 切割...     

切割穹窿海马伞后海马齿状回内Lhx8的表达变化及其对RGCs向胆碱能神经元分化的影响

目的:明确Lhx8在SD大鼠切割穹窿海马伞后海马齿状回颗粒下层和门区中的表达变化。方法:切割SD大鼠穹窿海马伞,成功制备海马去神经支配动物模型后,通过Western Blot的方法检测切割后第1、3、7、14、21、28 d海马中Lhx8蛋白的表达变化;通过免疫组织化学方法检测切割后第7天海马齿状回颗粒下层和门区中Lhx8阳性细胞的表达定位,并通过免疫荧光化学方法检测Lhx8/ChAT双标阳性细胞的共定位情况;切割SD大鼠穹窿海马伞并制备海马提取液,将其加入至细胞培养液中,模拟体内海马神经再生微环境,检测培养的海马放射状胶质细胞(radial slia cells,RGCs)向胆碱能神经元分化的情况。结果:切割穹窿海马伞后第7 d,Lhx8蛋白表达量较其他各时相点明显增高;海马齿状回颗粒下层和门区中Lhx8阳性细胞数目和光密度也明显高于正常侧,Lhx8/ChAT双标阳性细胞数目也较正常侧增多;体外细胞培养,切割穹窿海马伞侧海马提取液也较正常侧海马提取液更能促进海马放射状胶质细胞向胆碱能神经元的分化。结论:切割穹窿海马伞后,Lhx8表达明显上调,与海马齿状回的胆碱能神经再生有关。     

神经生长因子对穹窿海马伞切割后海马自体神经干细胞增殖和向神经元分化的影响

目的 探讨切割穹窿海马伞及脑室给予神经生长因子(NGF)后,对大鼠海马自体神经干细胞增殖和分化为神经元的影响.方法 12只SD大鼠,随机分成给药组和对照组,每组6只,切割右侧穹窿海马伞,两组切割后即时及第2d、4d向侧脑室分别注射NGF和人工脑脊液, 并在术后第3～7d每日腹腔注射2次BrdU.于术后28d灌注取脑、冷冻切片,行BrdU/NF-200免疫荧光双标检测.结果 海马齿状回内BrdU阳性细胞数,给药组和对照组切割侧明显多于正常侧,给药组切割侧和正常侧分别多于对照组切割侧和正常侧;海马齿状回内的BrdU/NF-200双标神经元数,给药组切割侧最多,给药组正常侧和对照组切割侧较少,而对照组正常侧则无.结论 切割穹窿海马伞后,可致大鼠海马齿状回自体神经干细胞增殖加快并向神经元分化,脑室施加 NGF可促进其增殖和分化.     

激活的星形胶质细胞分泌聚集素蛋白及其对海马神经干细胞向神经元分化的促进作用

目的 探讨切割穹隆海马伞的侧海马提取液“激活”的星形胶质细胞分泌聚集素蛋白（CLU）及体外CLU诱导海马神经干细胞分化为神经元的情况。
方法 分别用切割穹隆海马伞的海马提取液、正常海马提取液、DMEM/F12 培养基培养星形胶质细胞,制备切割12h、24h、48h组,正常组和对照组条件培养基;ELISA检测比较不同条件培养基中CLU蛋白的浓度;体外细胞培养采用CLU诱导海马神经干细胞分化,设诱导组和空白对照组,7d后通过微管相关蛋白2（MAP-2）免疫荧光及Hoechst标记观察海马神经干细胞向神经元的分化情况。 结果 正常组和对照组条件培养基中CLU浓度较低,约为（0.1037±0.0119）ng/L和（0.1170±0.0078）ng/L;切割组12h、24h、48h条件培养基中其浓度明显增高,分别为（0.1940±0.0364）ng/L、（0.4250±0.0724）ng/L和（0.2903±0.0472）ng/L,以24h组最高,约为正常组和对照组的4倍。CLU诱导组中MAP-2阳性细胞数明显高于空白对照组（P<0.05）,其占总细胞数的百分比分别为(11.67±2.57)%和（4.52±1.54）%,且诱导组中MAP-2阳性细胞突起更长、更丰富。 结论 切割穹隆海马伞侧海马提取液“激活”的星形胶质细胞可分泌更多的CLU,体外细胞培养中CLU可促进海马神经干细胞向成熟的神经元分化。     

海马去神经支配损伤后放射状胶质细胞表达RUNX1T1的变化及向神经元分化的影响

目的 观察海马去神经支配损伤后,海马放射状胶质细胞表达RUNX相关转录因子1转位1（RUNX1T1）和向神经元分化的情况。方法 取6只大鼠,采用物理切割大鼠穹隆海马伞术制备海马去神经支配损伤模型,并制备海马提取液,海马放射状胶质细胞体外培养,培养液中加入海马提取液。实验分为去神经支配组、正常组和空白对照组,共6块24孔板,每组各48孔。采用Real-time PCR、Western blotting及免疫荧光技术检测各组放射状胶质细胞表达RUNX1T1 mRNA和蛋白的变化,以及分化成微管相关蛋白 2（MAP-2）阳性神经元比例。结果 体外培养的海马放射状胶质细胞具有细而长的突起,且表达RUNX1T1,去神经支配组中RUNX1T1阳性细胞的荧光强度高于正常组和空白对照组约1.8倍,细胞突起也较后两组长。去神经支配组RUNX1T1 mRNA和蛋白表的表达量各上调2.9倍和2.4倍,且39.33%细胞表达MAP-2,与正常组和空白对照组相比,阳性细胞数比例明显增高。结论 海马去神经支配损伤后海马放射状胶质细胞上调表达RUNX1T1,并可更多地向神经元分化。     

海马胆碱能刺激肽促进神经干细胞向神经元分化

目的探讨海马胆碱能刺激肽(HCNP)在神经干细胞向神经元分化过程中所起的作用。方法切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,14天后取切割穹窿海马伞侧海马制成海马提取液;将神经干细胞接种于24孔板中,分为HCNP与海马提取液联合培养组、HCNP组以及空白对照组,每组八孔;细胞分化至14天时行Tuj-1、MAP-2免疫荧光检测;计数Tuj-1、MAP-2阳性神经元数及细胞周长,并观察胞体大小和突起长度。结果联合培养组Tuj-1、MAP-2阳性神经元最多,胞体大,突起长;HCNP组神经元数量较前组少,胞体较小,突起数量和长度均小于前组;对照组则仅有少量胞体小、突起短的神经元。HCNP与切割穹窿海马伞侧海马提取液联合培养组神经元成熟度优于其它两组。结论 HCNP对神经干细胞向神经元的分化具有明显促进作用。     

海马放射状胶质细胞激活后Rest和Runx1t1基因的表达变化

目的 探讨经切割穹隆海马伞侧海马提取液诱导而激活的海马放射状胶质细胞的基因表达变化.方法 将分离、纯化后的海马放射状胶质细胞分别加入正常侧和切割穹隆海马伞侧海马提取液,7d后利用免疫荧光法检测两组细胞的数量和生长情况;利用基因芯片分析细胞内基因表达情况;利用实时定量PCR分析神经干细胞向神经元分化的相关基因Rest和Runx1t1的转录情况.结果 与正常组相比,切割组放射状胶质细胞的数量明显增多,胞体增大,突起增粗变长.基因芯片结果显示,在所检测的709个基因中,切割组中10个基因表达明显上调,10个基因明显下调;实时定量PCR结果表明,切割组Rest和Runx1t1的转录水平均显著高于正常组(P＜0.05).结论 切割穹隆海马伞海马提取液可诱导海马放射状胶质细胞的激活,提高Rest和Runx1t1基因转录水平.     

纤维蛋白支架促进神经干细胞向神经元分化并抑制星形胶质细胞增生

目的探讨纤维蛋白支架对神经干细胞和星形胶质细胞分化及增殖的影响。方法分别培养胚胎大鼠脊髓来源的神经干细胞和新生鼠脊髓神经胶质细胞,接种于纤维蛋白支架上,同时用多聚赖氨酸修饰的玻片作为对照。于体外培养不同时间后,用神经丝蛋白(NF200)对神经细胞进行免疫荧光染色,测量各复孔(n=4)内NF阳性细胞的突起长度,计算其平均值;用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)对胶质细胞进行染色,各复孔(n=4)内统计5个不同视野的胶质细胞总数和GFAP阳性细胞数,计算GFAP阳性细胞相对数量的平均值。比较在纤维蛋白支架和玻片上神经干细胞分化、神经纤维延伸及神经胶质细胞增殖的差异。同时用免疫印迹技术对荧光染色结果进行验证。上述实验各重复3次。结果纤维蛋白支架组的NF阳性纤维明显长于对照组,GFAP阳性星形胶质细胞相对数量明显少于对照组,GFAP的表达水平明显低于对照组。结论纤维蛋白支架可促进神经干细胞向神经细胞分化,并有利于神经纤维的延伸而抑制星形胶质细胞的增殖和成熟。     

体外模拟海马神经再生微环境下的NSCs增殖和向神经元分化

目的:探讨用切割穹窿海马伞海马提取液在体外模拟体内海马神经再生微环境下,对海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和向神经元分化的影响。方法:分别制备正常侧和切割穹窿海马伞侧海马提取液。实验分为对照组、正常组和切割组,分别在海马NSCs中加入DMEM/F12培养基、含正常侧海马提取液及切割侧海马提取液的DMEM/F12培养基。用WST-8和Ki67/Sox2免疫荧光检测NSCs的增殖,用DCX免疫荧光检测NSCs向神经元的分化情况。结果:切割组与正常组及对照组相比,WST-8检测OD450比值明显增高(P<0.05);Ki67阳性细胞和Sox2阳性细胞的比例均明显增高(P<0.001)。结论:用切割穹窿海马伞侧海马提取液在体外模拟海马神经再生微环境,可以促进海马NSCs的增殖和向神经元的分化。     

穹隆海马伞切割后大鼠海马内RUNX1T1 mRNA和蛋白的表达变化

目的 观察穹隆海马伞切割后不同时间点海马内RUNX1T1 mRNA和蛋白的表达变化及定位。方法 行穹隆海马伞切割术,制备模型大鼠。实验分为正常组、切割3d组、切割7d组、切割14d组、切割21d组、切割28d组。1.提取海马组织总mRNA,用Real-time PCR 检测大鼠海马组织中RUNX1T1mRNA 的表达;2.提取海马组织总蛋白,用Western blotting 检测海马内RUNX1T1蛋白的表达;3.行脑冷冻切片,行RUNX1T1免疫荧光检测和Hoechst标记,观察海马齿状回中RUNX1T1/Hoechst双标阳性细胞。 结果 Real-time PCR检测显示,切割3d组海马组织中RUNX1T1 mRNA的表达明显上调,其余各组差异不明显;Western blotting检测结果显示,正常组海马中有微量RUNX1T1蛋白表达,而切割3d组海马组织中RUNX1T1蛋白表达量明显上升,并达到高峰,7d时仍有较多的表达,此后,14d、21d、28d组中RUNX1T1蛋白表达很快又恢复到正常水平;免疫荧光检测结果表明,正常组海马齿状回中有少量的RUNX1T1/Hoechst阳性细胞,切割3d组海马齿状回中RUNX1T1/Hoechst阳性细胞数量最多,切割7d组逐渐减少,切割14d组、21d组和28d组与正常组差别不明显。结论 穹隆海马伞切割后海马内RUNX1T1 mRNA和蛋白表达在早期呈短暂性上调,并定位于海马齿状回颗粒下层,推测可能与海马神经再生过程中神经干细胞向神经元分化有关。     

小鼠放射状胶质细胞和小脑皮质的发育

目的探讨小鼠小脑皮质发育过程中放射状胶质细胞的分化。方法应用免疫荧光及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)检测技术,标记小鼠胚胎8d至生后180d小脑(57例,分为19组,每组3只)的神经干细胞、放射状胶质细胞、普肯耶细胞及颗粒细胞。结果放射状胶质细胞于胚胎13d的神经上皮出现,尔后该细胞分化为各种神经元和贝格曼胶质细胞,并在小脑皮质层状结构的形成中起着重要作用。结论放射状胶质细胞来源于神经上皮细胞,是神经细胞和神经胶质细胞的前体细胞。在小脑皮质的发育过程中,放射状胶质细胞能分化为普肯耶细胞和颗粒细胞,并为神经细胞的迁移提供路径和支架。     

TNFα刺激的星形胶质细胞条件培养液对海马神经元的兴奋作用

目的:探讨肿瘤坏死因子-α刺激的星形胶质细胞对神经元的作用。材料和方法:体外纯化培养大鼠海马星形胶质细胞,采用反相高效液相法测定TNFα刺激后细胞培养液内谷氨酸的含量;将TNFα刺激后的星形胶质细胞条件培养液（Astrocytic Conditioned Medium,ACM）作用于培养的海马神经元,运用免疫细胞化学方法和图像分析技术研究神经元NF-κBp65和谷氨酸的表达。结果:（1）TNFα可明显促进星形胶质细胞释放谷氨酸;（2）ACM作用15min即可诱导神经元NF-κBp65的核表达,30min达高峰,180min恢复至对照水平;（3）ACM作用60min可使谷氨酸免疫反应阳性神经元平均光密度明显升高,持续至240min。结论:TNFα刺激的星形胶质细胞可通过释放谷氨酸等可溶性物质使神经元快速激活、兴奋性升高。     

新生大鼠海马神经元的体外原代培养

目的研究体外原代培养新生大鼠海马神经元的方法,并观察其发育分化过程中形态学的变化。方法取出生24 h内的Wistar大鼠分离海马,消化后差速贴壁,种植在涂有多聚-L-赖氨酸的盖玻片上,于不同时间在倒置相差显微镜下观察形态变化;采用NSE免疫细胞化学技术鉴定神经元。结果神经元12~24 h后大部分贴壁,随时间延长形态多变,突起逐渐增多,神经元突起间互相接触形成网络。培养第7~10天时细胞最为丰满,至28天时培养液中有悬浮的细胞碎片。NSE鉴定结果显示神经元纯度为(92.3±6.8)%。结论该方法简单易行,神经元纯度较高,可作为神经元体外培养的良好模型用于以后的研究。     

星形胶质细胞条件培养液促进新生大鼠海马神经干细胞分化

目的探讨星形胶质细胞条件培养液(ACM)对神经干细胞(NSCs)体外分化的影响。方法行新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的纯化培养后收集ACM,将新生大鼠海马NSCs单克隆培养后行nestin免疫细胞荧光染色,诱导分化5d后行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(GALC)免疫细胞荧光染色;将单克隆培养的NSCs分为对照组和实验组,对照组为单纯NSCs培养液,实验组根据NSCs培养液与ACM比的不同分3组:A组(2:1),B组(1:1),C组(1:2)。各组培养1周,采用NSE免疫细胞荧光检测方法标记神经元并计数和统计学分析。结果纯化的星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记阳性率为96.5%;单克隆培养的海马NSCs呈nestin阳性,诱导后呈NSE、GFAP和GALC阳性表达。ACM培养的海马NSCs各组分化为神经元的比例明显高于对照组(<0.01),其中A组的比例最高。结论ACM可以促进新生大鼠海马NSCs向神经元分化。     

一种同时培养原代神经元和原代星形胶质细胞的实验方法

目的 建立一种简便实用的可同时提取原代神经元和原代星形胶质细胞的培养方法.方法 选用出生24 h的SD乳鼠,75％乙醇消毒,断脊法处死.用眼科镊拨开脑膜各层,取出完整大脑.游离海马,剥离血管,木瓜蛋白酶消化,然后吹打、离心、过滤,以合适密度种植于相应培养皿.4h后更换培养基,以后每2天半量换液培养.第5天用免疫荧光法鉴...     

HCNP与海马提取液对神经干细胞向胆碱能神经元分化的协同作用

目的:探讨海马胆碱能神经元刺激肽(hippocampal cholinergic neurostimulating peptide,HCNP)与海马提取液对海马神经干细胞向神经元及胆碱能神经元分化的协同作用。方法:取孕17 d SD大鼠海马组织进行神经干细胞的培养、增殖、传代,并将其接种于2块24孔板中,培养基中均含B27、微量脑源性神经营养因子(BD-NF),将培养孔分为6组:H+T组,加入HCNP和切割穹窿海马伞侧海马提取液;H+N组,加入HCNP和正常侧海马提取液;H组,加入HCNP;T组,加入切割穹窿海马伞侧海马提取液;N组,加入正常侧海马提取液;对照组,不加HCNP和海马提取液。分化14 d后行MAP-2/ChAT免疫荧光双标检测。结果:与其它各组相比,H+T组分化的MAP-2阳性神经元最多,ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例最高(P<0.05);与N组相比,H+N组MAP-2阳性神经元较多,ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例也较高(P<0.05);与对照组相比,H组T组均可见一定数量的MAP-2阳性神经元及ChAT/MAP-2双标阳性神经元(P<0.05);N组以及对照组中MAP-2阳性神经元的数量和ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例则最低。结论:在微量BDNF存在的情况下,HCNP可促进海马神经干细胞向神经元和胆碱能神经元分化,切割侧海马提取液与HCNP可发挥协同作用。