聚合酶链反应检测人乳头瘤病毒的进展

聚合酶链反应以其特异、敏感和快速准确等特点已广泛用于人乳头瘤病毒感染的临床诊断及流行病学研究。以此为基础 ,结合核酸杂交、酶谱分型、DNA芯片等技术 ,使人乳头瘤病毒研究手段日益增多 ,检测方法逐渐完善。就聚合酶链反应检测人乳头瘤病毒的进展作一综述     

一人同患3种人乳头瘤病毒性皮肤病

临床资料　患者 ,女 ,2 6岁 ,已婚未孕。1年前右前臂始长扁平丘疹 ,半年前左上眼睑见刺状丘疹 ,2个月前外阴部见疣状丘疹 ,逐渐增大 ,伴轻度瘙痒就诊。患者否认冶游史 ,其配偶有尖锐湿疣病史。体检　一般情况良好。皮肤科检查 :左上眼睑见 2个棘刺状丘疹 ,长约 3ｍｍ ,基底部互相融合 ,约 2个高梁粒大小 ;右前臂见 3个孤立的绿豆大小扁平丘疹 ,表面平滑 ;外阴部、大阴唇内侧、小阴唇及尿道口可见簇集性疣状丘疹 ,绿豆至黄豆大小。上述皮损分别诊断为寻常疣 (左上眼睑 )、扁平疣 (右前臂 )及尖锐湿疣。治疗　上述部位皮损均采用局麻后微波处…     

人乳头瘤病毒16通过DNA甲基化和组蛋白修饰路径的致癌机制研究进展

许多研究表明,人乳头瘤病相关肿瘤中存在DNA甲基化、组蛋白修饰等各种表观遗传学改变。在这些表观遗传学改变的研究中,提示E6和E7可能对人乳头瘤病毒相关肿瘤的DNA甲基化及组蛋白修饰存在直接或间接的影响。其中一个重要的机制可能是E6和E7直接与上述表观遗传学路径中涉及的相关蛋白酶相互作用。进一步明确E6、E7通过DNA甲基化和组蛋白修饰路径的致癌机制。     

外耳道乳头状瘤人乳头瘤病毒DNA的研究

研究了１４例外耳道乳头状瘤的１５个皮损，组织病理学上所有病例均呈乳头瘤样增生，５例在棘层上方有少数灶性空泡细胞，空泡细胞的超微结构发现其染色质周围颗粒和染色质间颗粒数增多，核小体易见，未发现典型的病毒颗粒。用聚合酶链反应检测发现所有标本均含有ＨＰＶ６，未发现有ＨＰＶＳ、１１、１６、１８、３１和３３。结果说明外耳道乳头状瘤是由ＨＰＶ６感染所致。     

人乳头瘤病毒DNA表达与皮肤恶性黑素瘤的关系及意义

皮肤恶性黑素瘤(简称恶黑)的发病原因可能主要与紫外线照射有关^[1],但其他原因如外伤也可能与某些类型的恶黑发病有关,某些发生在非暴露部位的恶黑也不能用紫外线照射来解释.以上事实提示其他因素可能直接或间接参与了恶黑的发生与发展.     

人乳头瘤病毒DNA在角化棘皮瘤中的表达

目的 探讨角化棘皮瘤组织中人乳头瘤病毒（HPV）感染率,及HPV DNA阳性细胞的分布特征。方法 原位杂交方法检测46例KA和34例正常人皮肤石蜡切片组织标本中HPV6/11、16/18、31/33亚型。结果 31例角化棘皮瘤黏膜型HPV DNA阳性,总阳性率67.39%,两种以上HPV混合感染达83.87％（26/31）,各亚型均以游离型为主;阳性信号位于细胞核内或核边缘,阳性细胞多分布于火山口底部棘层的浅中部及其周围唇部,分布形式多为带状、片状或灶状聚集。正常皮肤对照组HPV DNA各亚型检测均阴性。结论 角化棘皮瘤患者HPV6/11、16/18、31/33感染率高于正常人群,且以游离形式存在为主,推测HPV感染在角化棘皮瘤的发病机制中起作用。     

乳头瘤病毒与皮肤恶性肿瘤及瘤样病变相关的研究进展

人乳头瘤病毒是一种感染表皮和粘膜鳞状上皮的肿瘤病毒，可以引起被感染细胞的过度增殖及恶性转化。近年来的研究表明，许多上皮增生性病变甚至恶性肿瘤的发生与人乳头瘤病毒感染有关。就近年人乳头瘤病毒与皮肤恶性肿瘤及瘤样病变的相关性的研究进展进行综述，论述了高危型人乳头瘤病毒在肛门生殖器肿瘤发生发展过程中的重要作用，并进一步从多方面阐述了人乳头瘤病毒在恶性肿瘤中的作用机制。     

尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒11型L1基因的克隆及序列分析

目的克隆和分析HPV11的晚期表达基因序列L1及其编码的氨基酸序列,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研制提供基础。方法采用PCR技术扩增了1例尖锐湿疣患者疣组织中HPV 11 L1基因,并对其进行了克隆及全序列分析。结果本例尖锐湿疣临床标本HPV 11 L1基因与GenBank收录的原型(收录号:M14119)比较有8个碱基变异。结论 中国地区尖锐湿疣HPV 11 L1基因存在着变异。     

北京地区人乳头瘤病毒16E6E7基因变异和序列分析

目的 了解北京地区人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7结构特点，为研制HPV16疫苗奠定基础。方法 从HPV感染组织中提取DNA，PCR鉴别其型别，从单独HPV16感染的标本中分离HPV16 E6E7基因，克隆入载体pGEM-3ZF，进行双向测序，与德同标准株进行比较。结果 构建了北京地区HPV16E6E7的重组质粒。测序结果表明该基因全长为776bp，与已发表的德同标准株长度相等，3处核苷酸发生变异，同源性99．7％。分别位于第60、96和565nt(相当于HPV16全长序列中第142、178和647nt)，2处位于F6区，1处位于E7，其对应氨基酸分别为第20、32和188个氨基酸，分别由Pro(CCA)、Asp(GAT)和Asn(AAT）变异为Pro(CCG)、Glu(GAG)和Ser(AGT)。结论 北京地区HPV16E6E7基因结构与德国标准株存在差异。     

尖锐湿疣组织中HPV型别检测及HPV11型L1基因的克隆与测序

目的分析黑龙江地区尖锐湿疣组织感染的HPV型别分布情况,并对HPV11型流行株L1基因进行克隆和测序,检测序列变异情况。方法提取30例尖锐湿疣组织标本中的DNA,用HPVL1区通用引物及特异性HPV6b,11,16,18型引物进行PCR扩增,分析尖锐湿疣组织中感染的HPV型别分布。对其中4株HPV11型阳性标本L1基因,经酶切、连接,分别构建pSP73-HPV11L1重组质粒,并对其L1片段进行测序。结果30例标本中,HPV6b和11型感染数分别为11例,各占36.7%;有2例合并HPV6b/11/16型的混合感染,占总病例数的6.7%;1例HPV16型单独感染,未鉴定出HPV18型感染,其他型别5例。pSP73HPV11L1重组质粒测序后,4株HPV11L1基因序列完全一致,可认为是黑龙江省流行株。其序列与原始株序列相比,仅发现了两处同义点突变。结论黑龙江地区尖锐湿疣组织中HPVDNA检出率为100%,以6b和11型为主,偶见高危型别16型感染。克隆测序表明黑龙江省流行株HPV11型L1基因高度保守。     

钙网蛋白基因120片段和人乳头瘤病毒6bE7基因诱导的小鼠细胞免疫反应

目的研究嵌合DNA疫苗钙网蛋白基因120片段(CRT120)和人乳头瘤病毒6b型E7基因(HPV6bE7)的免疫学特性。方法克隆、构建重组质粒即嵌合DNA疫苗pcDNA3．1-GFP-CRT120／ HPV6bE7、pcDNA3．1-GFP-HPV6bE7、pcDNA3．1-GFP-CRT120;经脂质体转染获得HPV6bE7转染阳性 B16细胞株;用肌内注射法对C57BL/6小鼠进行重组质粒DNA疫苗免疫;检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群变化、小鼠脾细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性以及与靶细胞共孵育后白介素2和干扰素γ的分泌水平。结果获得构建正确的嵌合DNA疫苗pcDNA3．1-GFP-CRT120／HPV6bE7以及稳定表达HPV6bE7 的阳性细胞株。CRT120／HPV6bE7较之HPV6bE7能引起免疫小鼠外周血中CD8 T淋巴细胞亚群分化和 TCRγδ T细胞上调(P<0．05),脾淋巴细胞与靶细胞共孵育上清液中白介素2和干扰素γ的浓度也明显高于HPV6bE7和CRT120组(P<0．05);CRT120／HPV6bE7免疫的小鼠淋巴细胞对靶细胞B16／HPV6bE7 有明显的杀伤活性。结论 CRT120／HPV6bE7嵌合DNA疫苗能够诱导免疫小鼠的病毒抗原特异性细胞免疫。     

人类乳头瘤病毒16全基因在体外培养的正常人角质形成细胞 …

目的 利用含有人类乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６全基因的质粒转染正常人角质形成细胞,观察ＨＰＶ１６ｍＲＮＡ在转染细胞的表达。方法 用ＦｕＧＥＮＥ＾ＴＭ６转染试剂,将携带ＨＰＶ１６全基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ／１６转染体外培养的正常人角质形成细胞,在转染后２４ｈ提取细胞总ＲＮＡ和ＤＮＡ,进行ＲＴ－ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析,结果 ２４ｈ后,ＲＴ－ＰＣＲ成功地扩增出１１０ｂｐ的片段,转染细胞中已出现Ｈ     

人类乳头瘤病毒16全基因在体外培养的正常人角质形成细胞中的瞬时表达

目的 利用含有人类乳头瘤病毒(HPV)16全基因的质粒转染正常人角质形成细胞,观察HPV16 mRNA在转染细胞的表达。方法 用FuGENE^TM6转染试剂,将携带HPV16全基因的质粒pSV2-neo/16转染体外培养的正常人角质形成细胞,在转染后24h提取细胞总RNA和DNA,进行RT-PCR和Southern印迹分析。结果 24h后,RT-PCR成功地扩增出110bp的片段,转染细胞中已出现HPV16 mRNA的表达,Southern印迹证实转染细胞中含有HPV16全基因7.9kb。结论 pSV2-neo/16转染正常人表皮角质形成细胞,24h内即可检测到HPV16mRNA表达。     

外阴鳞状上皮内瘤变皮损中人乳头瘤病毒16、18癌基因整合性研究

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)16、18在外阴鳞状上皮内瘤变(VIN)皮损中的感染和其癌基因在人基因组中的整合情况。方法采用捕获杂交法及PCR技术筛选高危型HPV和HPV16、18DNA阳性VIN标本：经RT-PCR、巢式PCR及DNA杂交研究HPV16、18 DNA阳性VIN标本中的HPV基因转录。结果 32例VIN患者皮损中24例(75%)为高危型HPV阳性,23例为HPV 16阳性,1例为HPV 18阳性。23例HPV 16阳性标本中除1例VIN Ⅱ皮损无HPV转录外,15份标本为游离体型HPV 16基因转录,其余7例VIN Ⅲ标本呈现整合型HPV 16癌基因转录；1例HPV 18阳性VIN Ⅲ标本发现为整合型HPV 18癌基因转录。结论大部分VIN Ⅱ、Ⅲ标本存在HPV 16感染,HPV癌基因的整合多发生于VIN Ⅲ的皮损；推测高危型HPV癌基因在人基因组中的整合与VIN的发生及其向外阴鳞状细胞癌的发展有关。     

尖锐湿疣患者外周血中HPV DNA的检测

目的 检测尖锐湿疣(CA)患者外周血中的人乳头瘤病毒(HPV)DNA。方法 采用聚合酶链反应(PCR)检测30例CA患者皮损和外周血中的HPV DNA,20例正常人外周血作对照。采用限制性内切酶RsaⅠ、PstⅠ对HPV作分型鉴定。选取1例皮损与外周血均为阳性的PCR产物进行测序。结果 30例CA患者皮损均检出HPV DNA,血浆中未检测到HPV DNA,有8例外周血单一核细胞(PBMC)中检测到HPV DNA(阳性率为26.7%),20例正常人对照为阴性,两组阳性率经χ²校正检验χ²=4.52,P<0.05,差异有显著性。酶切和测序结果显示PBMC中的HPV型别与其皮损处的型别有一致性。结论 CA患者在HPV感染的病程中可能存在病毒血症,这可能是CA易于复发的原因之一。     

宫颈液基薄层细胞检测联合HPV检查在宫颈癌筛查中的应用

目的：探讨宫颈液基薄层细胞检测联合HPV检查在宫颈癌筛查中的应用价值。方法：应用宫颈液基薄层细胞检测和HPV检查以及两种方法的联用,对5586名妇女进行宫颈癌筛查,并与阴道镜活检的结果进行比对。结果：细胞学检查结果显示,ASCUS 411例（占7.36%）,LSIL 105例（占1.88%）,HSIL67例（1.20%）,SCC 10例（0.18%）。而单用HPV检查,发现阳性患者890例,且随着宫颈病变级别升高,高危型HPV感染率增加（P〈0.05）。宫颈液基细胞学检查联用HPV检查与两种方法单独应用相比能明显提高检查的特异性和阳性预测值,并能降低假阳性率。与此同时,先进行HPV检查,后进行细胞学检查的方案,具有较高的特异性和阳性预测值,同时假阳性率和假阴性率较低,明显优于先进行细胞学检查,后进行HPV检查的方案。结论：先进行HPV检查,后进行细胞学检查的方案对宫颈癌的筛查准确性高,不失为一种先进的宫颈癌筛查方法。     

Recombined DNA vaccines encoding calreticulin linked to HPV6bE7 enhance immune response and inhibit angiogenic activity in B16 melanoma mouse model expressing HPV 6bE7 antigen

Calreticulin (CRT) has been reported to have an effect of upregulating MHC class I presentation as well as inhibiting angiogenesis in vitro and in vivo. Combination of dual mechanisms of enhanced immunogenicity of human papillomavirus (HPV) 6bE7 antigen and antiangiogenesis may be introduced in the strategy of vaccines against condyloma acuminatum (CA) resulting from HPV infection. Therefore, we constructed DNA vaccines by employing different lengths of CRT chimerically linked to a model antigen HPV6bE7 and investigated the immunological and antiangiogenic effects of these vaccines in a B16 melanoma model that express HPV6bE7 antigen. Our results showed that vaccination with CRT180/HPV6bE7 or CRT120/HPV6bE7 enhanced the presence of CD8⁺ T cells and TCRγδ T cells in vivo, increased the specific lysis activity against E7-expressing cells and secretion levels of IL-2 and IFN-γ by activating T cells in vitro significantly. Moreover, recombined CRT180 or CRT120 with HPV6bE7 vaccines could elicit a more efficient E7-specific immune response than HPV6bE7 alone. The similarity of immunological enhancement of CRT180/HPV6bE7 and CRT120/HPV6bE7 implies that the immunologically active region mainly exist in fragment 1–120 aa. Furthermore, CRT180/HPV6bE7 and CRT180 displayed remarkable superiority over CRT120/HPV6bE7 in vivo angiogenesis assay, suggesting that the antiangiogenic activity of CRT resides in a domain between aa 120 and 180. Vaccination with CRT180/HPV6bE7 generated the best protective effect of delaying tumor formation and reduction of tumor size in tumor growth inhibition experiment among all DNA constructs. Therefore, CRT180/HPV6bE7 vaccine may enhance the immunological response to HPV6bE7 and inhibit angiogenesis. This construct may be useful in preventing HPV-associated dermatosis and may be developed as a promising strategy to control CA.     

含人类乳头瘤病毒16E7-L1的嵌合型病毒样颗粒的构建、表达和纯化鉴定

目的 研究人类乳头瘤病毒(HPV)16型的早期基因E7,构建、表达并纯化鉴定了HPV16E7与BPVL1重组的嵌合型病毒样颗粒VLPs.方法HPV16E7基因分3段经PCR扩增后分别克隆入连有BPVL1的质粒PUC形成BPVL1HPV16E7;以质粒PVL1393为载体将BPVL1HPV16E7基因转染杆状病毒并在昆虫细胞中进行表达;用超声粉碎和蔗糖超离、氯化铯梯度离心等方法纯化以及免疫印迹、ECL、透射电镜等方法鉴定表达产物.结果 和结论成功地获得表达BPVL1HPV16E7重组体,形态和结构与野生型HPV几乎一致的嵌合型病毒样颗粒VLPs.将为进一步的HPV16E7的疫苗研究等奠定基础.