人硫氧还蛋白基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人硫氧还蛋白(hTRX)cDNA序列,进行真核表达载体的构建.方法 应用RT-PCR技术,以胎肝组织细胞总RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并克隆至pUCm-T载体中,经PCR和测序鉴定正确后,再构建重组真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,采用PCR、双酶切和基因测序鉴定;利用阳性脂质体Lipofectamine将其转入COS-7细胞(瞬时表达细胞),RT-PCR检测其表达情况.结果 将所得序列与GenBank(J04026)提供的序列比较,其酶活性中心(Trp-Cys-Gly-Pro-Cya)和基序与已知序列一致;PCR、酶切及测序鉴定表明真核表达载体构建正确;COS-7细胞中有hTRX的表达.结论 成功克隆编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,构建其真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,并在COS-7细胞中得到了表达,为进一步探讨hTRX的生物活性和应用奠定了基础.     

构建不同筛选特性的HBV X基因真核表达载体

目的:构建不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体.方法:从质粒pEcob6中PCR扩增HBV X全基因,利用pCEP4和pcDNA3.1( )两者多克隆位点的特点,选用pGEM(R)-T Easy Vector构建中间载体pEasy-X,分别酶切后连接特异性片段构建载体pCEP4-X和pcDNA3.1( )-X.结果:从质粒pEcob6成功PCR扩增出HBV X全基因并克隆至质粒pEasy-X,酶切、PCR及测序均证实真核表达载体质粒pCEP4-X和pcDNA3.1( )-X构建成功.结论:具有不同筛选特性的两个HBVX基因真核表达载体业已成功构建.     

反义DNA甲基化酶3b基因片断真核表达载体的构建及鉴定

目的构建反义DNA甲基化酶3b（DNMT3b）基因片断真核表达载体,为研究DNMT3b基因功能提供工具。方法根据DNMT3b基因cDNA序列中编码序列设计PCR引物,在上下游引物5′端分别添加XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点,RT—PCR从胆管癌细胞QBC-939中获得485bp的DNA片断;将该片断反向插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）的多克隆位点,构建反义DNMT3b基因片断真核表达载体,并用PCR、酶切法和DNA测序鉴定。结果PCR鉴定得到467bp特异条带,双酶切鉴定得到471bp片断和5．4kb载体片断,DNA测序说明插入片断序列正确。结论本研究构建的反义DNMT3b基因片断真核表达载体可为进一步研究DNMT3b基因功能提供实验工具。     

人硫氧还蛋白基因分子克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人硫氧还蛋白（hTRX）cDNA序列并进行真核表达载体的构建。方法应用RT-PCR技术,以胎肝组织细胞总RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并克隆至pUCm-T载体中;经PCR和测序鉴定正确后,再构建重组真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,采用PCR、双酶切和基因测序鉴定。结果将所得序列与GenBank（J04026）提供的序列比较,其酶活性中心（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys）和基序与已知序列一致;PCR、酶切及测序鉴定表明真核表达载体构建正确。结论成功克隆编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并构建其真核表达载体pcDNA3.0-hTRX。     

Ⅱ型胶原蛋白基因cDNA序列分析及其真核表达载体的构建

目的构建人Ⅱ型胶原蛋白(hCⅡ)基因真核表达载体PcDNA3.1(+)/hCⅡ。方法提取患者关节软骨组织总RNA,应用RT-PCR方法扩增出CⅡ基因片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体PcDNA3.1(+)中构建hCⅡ基因真核表达载体PcDNA3.1(+)/hCⅡ,并进行PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果 PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析表明CⅡ成功插入表达载体PcDNA3.1(+)。结论本研究成功构建了hCⅡ基因真核表达载体PcDNA3.1(+)/hCⅡ。     

大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表达质粒的构建及表达

目的构建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞COS-7中的有效表达。方法以含有p55全长基因的质粒为模板,通过PCR扩增p55基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经酶切后再将p55基因重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入COS-7细胞,RT-PCR检测其基因转录情况,SDS-PAGE鉴定其表达相应的目的蛋白质情况。结果成功扩增了p55基因片段,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDS-PAGE方法证实该片段能在COS-7细胞中有效表达目的蛋白质。结论成功构建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究奠定了基础。     

家兔C型利钠肽基因的克隆及鉴定

目的克隆家兔C型利钠肽基因,为其真核表达载体的构建奠定基础。方法通过RT-PCR从家兔腹主动脉组织中克隆C型利钠肽基因全长编码区,将该DNA片段亚克隆至克隆载体pMD18-T中,用Pst Ⅰ单酶切筛选出负向插入片段,对重组质粒进行鉴定。结果PCR、酶切及测序鉴定证实,家兔C型利钠肽基因全长编码区被准确插入到载体pMD18-T的TA克隆位点中。结论成功克隆家兔c型利钠肽基因,为其真核表达载体的构建及开展糖尿病足C型利钠肽基因治疗奠定了基础。     

HBx基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建重组HBx蛋白的真核表达载体pIRES2-AcGFP-HBx.方法 设计合成HBx基因的特异性PCR引物.PCR扩增获得HBx基因序列;将HBx基因序列克隆人T载体(pGEM-T-HBx);再用限制性内切酶BglⅡ和EcoR Ⅰ双酶切下目的片段,将其亚克隆人真核表达载体pIRES2-AcGFP;双酶切(Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ)和序列测定鉴定重组子;脂质体包裹pIRES2-AcGFP-HBx转染入HepG2细胞,G418筛选得到稳定表达HBx的细胞克隆,Western blot检测HBx蛋白在转染细胞中的表达情况.结果 PCR扩增获得全长HBx基因序列;双酶切筛选得到阳性重组子,测序分析证实插入序列正确;转染plRES2-AcGFP-HBx的HepG2细胞,荧光显微镜可观察到GFP的表达,Western blot 证实表达HBx蛋白.结论 成功构建重组HBx基因真核表达载体,获得稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞株,为深入研究HBx蛋白的生物学功能提供实验条件.     

弓形虫二氢叶酸还原酶一胸背酸合成酶ROP17真核表达载体的构建及ROP17参与自噬的研究北大核心CSCD

目的构建刚地弓形虫二氢叶酸还原酶一胸苷酸合成酶(dihydrofolate reductase-thymidylate synthase,DHFR-TS)-棒状体蛋白17真核表达载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17,将其转染人胚肾细胞(HEK 293T)后观察ROP17对细胞自噬的作用。方法以弓形虫速殖子总RNA为模板.逆转录PCR(RT-PCR)扩增DHFR-TS基因片段,克隆至真核表达载体pIRES的多克隆位点B,构建重组质粒pIRES/TgDHFR-TS.经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后.用脂质体法转染人胚肾细胞(HEK 293T),RT-PCR法和Western blot检测DHFR-TS的表达。以弓形虫速殖子ecDNA为模板,PCR获得ROP17.将其引人重组质粒pIRES/TgDHFR TS的多克隆位点A.构建重组载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17。重组载体经菌液PCR、双酶切和测序鉴定后转染人胚肾细胞(HEK 293T),对转染细胞血清饥饿诱导,通过.Western blot检测自噬标志蛋白LC3-II、Beclin-1和P62的表达。结果RT-PCR检测显示,从RH株弓形虫速殖子中扩增出约1809 bp的片段。菌落PCR、双酶切及测序显示工具载体pIRES/TgDHFR-TS构建成功;转染293T细胞后RT-PCR和Western blot转染pIRES/TgDHFR TS的细胞中有TgDHFR TS的表达,基因大小为1809 bp.蛋白相对分子质量约为68X103。菌液PCR、双酶切和测序显示重组载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17构建成功,转染293T细胞后RT-PCR和Western blot检测转染pIRES/TgDHFR TS TgROP17的细胞中有TgROP17的表达.基因大小及蛋白分子质量与预期相符,而转染pIRES/TgDHFR-TS质粒组未见相应基因及蛋白表达。经血清饥饿诱导后,Western blot.检测显示随着去血清时间的延长,LC3-I向LC3-II的转化、Beelin-1蛋白逐渐增加、P62蛋白逐渐减少。结论成功构建了工具载体pIRES/TgDHFR-TS和重组载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17,且能在真核细胞中表达,表达的弓形虫棒状体蛋白17(ROP17)能促进血清饥饿诱导的细胞自噬。     

IL-37b基因克隆及其真核的表达载体构建

目的 克隆IL-37b编码区基因,并构建其真核表达载体.方法 通过RT-PCR扩增IL-37b编码区基因,DNA测序鉴定后,将阳性克隆提取质粒,通过酶切连接将目的片段定向克隆至真核表达载体pcDNA 3.1,通过菌落PCR和DNA测序等进行鉴定.结果 凝胶电泳显示RT-PCR扩增出1条大小约650 bp特异条带,DNA测序结果显示获取了大小为654 bp的IL-37b编码区基因.PCR和DNA测序对所构建的真核表达载体鉴定结果表明IL-37b编码区基因正确插入真核表达载体pcDNA3.1.结论 成功克隆了IL-37b编码区基因,并成功构建其真核表达载体,为下一步IL-37b生物学作用的深入研究奠定了基础.