大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性

用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),体外培养传代扩增,观察细胞生长特性,对细胞进行免疫组化染色鉴定,电镜观察细胞形态。动态观察示培养细胞具有不断增殖的干细胞特性,并保持细胞活性。证实密度梯度离心结合贴壁法以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs,培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特性。本研究可为临床进行细胞移植奠定基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的生物学特性,对其表型和生长曲线进行初步鉴定.方法 采用全骨髓培养法提取培养MSCs,绘制原代及三代细胞生长曲线,利用免疫组化法检测表面标志物CD34、CD44;流式细胞分析法检测表面标志物CD90.结果 成功培养出MSCs,免疫组化CD44阳性表达,CD34阴性表达;流式细胞术CD90阳性表达.结论 该实验分离培养的细胞群与MSCs的生物学特性相吻合,说明MSCs易于体外分离、培养和扩增.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的体外分离、培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）。方法全骨髓贴壁法体外分离、培养3月龄SD大鼠MSC,利用差速贴壁原理纯化MSC,并通过形态学观察、细胞表面抗原标志物、多细胞系诱导分化对其进行鉴定。结果P3代不表达抗原CD34和CD45,表达抗原CD29和CD44,符合MSC表面标志物特征。P3代MSC定向诱导后经ALP染色、矿化结节染色、油红O染色、Ⅱ型胶原荧光染色后鉴定具有骨向分化、脂向分化及软骨分化能力。结论全骨髓贴壁法能够建立稳定的MSC体外分离培养体系。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及表型、纯度鉴定

目的探索获得高纯度MSCs简单、系统的实验方法。方法采用贴壁培养法体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,确定最佳接种密度,经数次传代后纯化,以表面抗原CD29、CD44作为标志分子,CD34作为阴性对照,免疫荧光法鉴定MSCs的生物学特性及纯度。结果以0．5—1×10^10个／L的细胞密度接种骨髓细胞原代培养时间明显缩短,免疫荧光法鉴定MSCs生物学特性好,第3代时已达较高纯度。结论本实验建立了较为理想的MSCs体外培养体系,纯化速度快,鉴定方法简单,为进一步研究MSCs生物学行为及临床应用奠定了基础。     

采用1.068 g/ml分离液对犬骨髓间充质干细胞的分离纯化与体外培养方法的探讨

目的探讨更为可靠、纯净度高的犬骨髓间充质于细胞分离、培养方法。方法将犬骨髓抽取液分别以1．068g／ml及1．073g／ml分离液进行密度梯度离心，采用贴壁培养法获得骨髓间充质干细胞（MSCs）；以LG-DMEM加15％FBS培养；应用于细胞表面标志蛋白，多向诱导分化等方法进行细胞鉴定。结果采用1．068g／ml分离液可获得纯度较高的单核细胞，接种细胞生长良好，孵育24h即可见细胞贴壁生长，平均倍增周期为1d，细胞呈纺锤状，螺旋梳状排列。连续培育8代以上，未见细胞形态、增殖特性改变。MSCs表面标志SH2阳性，CD45阴性，可定向分化为心肌细胞、成骨细胞及脂肪细胞。结论采用1．068g／m1分离液能够较好地进行犬MSCs的体外分离、培养与扩增，分离得到的细胞具备MSCs的特性。     

人胎肝间充质干细胞体外分离培养和生物学鉴定

目的建立人胎儿肝脏非实质细胞间充质干细胞(nonparenchymalmesenchymalstemcells,NPMSC)的分离、培养方法,观察NPMSC形态学、细胞生物学特性及细胞表型特征,以获得大量人源性间充质干细胞(MSC)。方法采用体外细胞培养技术分离培养人胎儿NPMSC,用显微摄像、MTT和图像分析研究其增殖及生长特征,用流式细胞仪和免疫组化法鉴定其表型。结果每个胎儿肝脏可获得10000±2000个贴壁细胞,可见5～10个高速增生的细胞集落。原代和传代培养均生长缓慢,按1∶3传代,传1代需8～10d,细胞经传代后逐渐纯化,传10代后可达109个细胞。流式细胞仪检测NPMSC不表达CD34,而表达CD166。对传代NPMSC进行人甲胎蛋白和白蛋白免疫组化分析,细胞表达微量甲胎蛋白,不表达白蛋白。结论肝非实质细胞中含有MSC,且量较大,可成为种子细胞。NPMSC在普通培养条件下不向肝细胞分化。     

Wistar大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定和标记

目的 建立Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离、培养的方法,并进行鉴定、标记.方法 采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠的MSCs.采用相差显微镜观察MSCs的形态学特征;流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表达率;电镜检查第3代MSCs超微结构.DAPI标记MSCs为下一步进行体内细胞移植示踪.结果 原代培养的MSCs于6～8 h后贴壁,6 d左右形成集落,14 d 左右可达到80%～90%融合.第3代细胞表面标记物CD29,CD44,CD34和CD45的阳性率分别为98.6 %,78.2%,0.0%,0.3%.超微结构清晰,可见细胞器,如线粒体、粗面内质网和高尔基复合体,细胞核呈圆形或不规则,可见较多微绒毛.DAPI可良好标记MSCs细胞核,呈蓝色荧光.结论 采用全骨髓贴壁培养的方法能够成功分离和培养大鼠的MSCs,在第3代可获得高纯度MSCs.DAPI可以作为一种示踪剂标记MSCs.     

猪骨髓间充质干细胞的分离培养及体外转化为心肌样细胞的实验研究

目的 探讨体外培养猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法及MSCs的一些生物学特性，为细胞心肌成形术提供新材料。方法 按照Nancer方法培养MSCs，用5-氮胞苷(5-aza)诱导，流式细胞仪检测细胞周期，并行结蛋白(desmin)、肌球蛋白重链(MHC)、心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)、连接蛋白-43(Cx-43)免疫组化鉴定。结果体外培养的原代MSCs10～14天达到融合，细胞周期显示80％的细胞处于G0／G1期；经5-aza刺激后，部分MSCs呈梭形，结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ、连接蛋白-43免疫组化染色阳性。结论 猪MSCs在体外条件下生长稳定，传代后仍保持未分化状态，有分化成心肌的潜能，可作为细胞心肌成形术的材料。     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析

目的对人骨髓间充质干细胞（HMSCs）的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法抽取4例健康人髋骨内骨髓5～20ml,密度梯度离心法分离HMSCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HMSCs表面标记物;MMT法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果HMSCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HLA-ABC、UEA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HMSCs的染色体数目未发生改变。结论密度梯度离心法可得到纯度较高的HMSCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HMSCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。     

骨髓间充质干细胞心肌样分化的微环境因素

目的:探讨促使骨髓间充质干细胞(MSCs)心肌样分化的微环境因素。方法:分离大鼠MSCs并传至第6代,随机分为混合培养组、条件组及对照组,分别将MSCs与大鼠心肌细胞共同培养(混合培养组),或将心肌细胞培养上清液加入MSCs培养体系(条件组)。1周后,检测MSCs的心肌特异性蛋白titin、Cx43及MHC表达情况。结果:MSCs能在心肌细胞培养上清液及与心肌细胞共同培养中正常生长;条件组MSCs表达titin、Cx43显著增加,但未观察到肌小节样结构;混合培养组MSCs可表达上述蛋白,且部分细胞中可观察到肌小节样结构,与心肌细胞交界面上有Cx43的聚集。3组MSCs均未检测到MHC表达。结论:心肌细胞自身、源于心肌的体液因素及MSCs分化过程中形成的感应器是MSCs心肌样分化的必要条件。     

罗曼鹤鸡骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的建立鸡骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养和鉴定体系。方法从1～14天龄罗曼鹤鸡骨髓中分离骨髓细胞,差速贴壁法纯化、扩增BMSCs。倒置显微镜下观察细胞形态特征,MTY法绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞标志物,并分别进行成骨、成脂诱导分化能力检测。结果分离培养的细胞呈成纤维细胞样或长梭形,生长状态良好;CD29阳性表达率为92．10％,CD34阳性表达率仅为0．80％;经成骨诱导分化,出现明显的钙化结节,茜素红染色阳性;经成脂诱导分化,油红O染色阳性,细胞内出现明显的脂质小滴。结论建立了操作简单、高效的鸡BMSCs分离培养和鉴定体系,为鸡BMSCs的进一步研究和应用提供了良好的基础。     

人脂肪源性间充质干细胞的分离培养与鉴定

目的探索人脂肪间充质干细胞(ADMSCs)分离、培养的方法,以证明人脂肪组织中含有多向分化潜能的ADMSCs,为临床应用提供实验基础。方法采用Ⅰ型胶原酶消化法及贴壁法分离培养腹部手术患者皮下脂肪组织,取第3代细胞,以磷酸盐缓冲生理盐水为空白对照,进行CD13、CD34、CD44、CD45、CD105、HLA-DR、Ⅷ因子表面抗原的免疫细胞化学鉴定。结果人脂肪中含有大量长梭形细胞,免疫化学鉴定显示与空白对照相比较CD44、CD13、CD105抗原呈阳性反应,其余标志物CD45、CD34、HLA-DR、Ⅷ因子抗原均为阴性反应。结论初步证明了人脂肪组织中含有间充质干细胞,为今后ADMSCs的分离培养提供了更简单有效的方法。     

人胎儿骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性鉴定

目的 建立人胎儿骨髓间充质干细胞(MMSCs)的分离、培养方法,观察MMSCs形态学、细胞生物学及细胞表型,以获得大量人源性MMSCs。 方法 收集12个人胎儿的骨髓,采用细胞培养技术,分离培养人胎儿MMSCs,用显微摄像、四甲基偶氮唑盐(MTT)和图像分析研究其增殖及生长特征,用流式细胞仪和免疫细胞化学鉴定其表型。 结果 0.5~2 h内尽快分离骨髓细胞,24 h换液后可获得约(300±8.0)个贴壁细胞,5个细胞以上的集落为(15±6)个;培养细胞在种植后1~3d为生长滞留期,第4天达到对数生长期,以后进入平台期;细胞分裂指数曲线的趋势与生长曲线基本类似,在达到对数生长期后,分裂相细胞明显减少。原代及传代培养显示,细胞分裂旺盛,可观察到干细胞特有的不均等分裂,5~7 d可传1代,连续传10代后,每个人胎儿来源MMSCs可扩增达1011-1012个细胞。MMSCs表型为CD166阳性,CD34阴性。对传代MMSCs进行人甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18免疫细胞化学分析,细胞除表达微量甲胎蛋白外,不表达白蛋白和细胞角蛋白18。 结论 人胎儿MMSCs分离成分单纯,容易成功,增殖旺盛,在普通培养条件下不向肝细胞分化。MMSCs作为组织工程重建的种子细胞具有较强的可行性。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化与鉴定

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外获取及培养增殖的方法并鉴定。方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离、纯化培养大鼠BMSCs,测定生长曲线,流式细胞仪鉴定,免疫细胞化学检测。结果:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMSCs,P2、4、6代细胞生长曲线基本一致,增值能力强,呈均一成纤维样细胞,P3代以后细胞均一地表达细胞表面抗原CD44、CD90,不表达CD34,弱表达CD11b/c,细胞表达Connexin43。结论:本实验建立了一种体外稳定培养扩增大鼠BMSCs的方法,培养的细胞成分单一,适用于对BMSCs进一步的应用研究。     

小鼠内皮祖细胞的分离、培养与定向诱导分化

目的 建立一种稳定、高效,从小鼠骨髓中分离培养与定向诱导分化内皮祖细胞(EPCs)的方法。方法 从小鼠骨髓中密度梯度离心法分离单个核细胞,经差速贴壁结合特殊培养基扩增并向内皮细胞定向诱导分化EPCs。应用免疫荧光和流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133。并通过检测其对FITC标记的UEA-1的吸附和内吞DiI-ac-LDL来进行细胞功能学的鉴定。对分化细胞行vWF、CD31 免疫组化染色鉴定,并与血管内皮细胞合成前列腺素能力进行比较。结果 经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、Flk-1,部分表达CD133。分离所得细胞经EBM-2专用培养基培养后,第4天可见集落形成,培养第9天流式细胞仪检测其CD34、CD133、CD31、Flk-1阳性率分别为(44±4)%、(18±3)%、(49±4)%和(79±6)%,细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-ac-LDL,约3周左右可融合近80%,形成铺路石样内皮细胞特有形态。传代后vWF、CD31免疫组化染色阳性率分别为(66±5)%和(56±5)%。诱导后的内皮祖细胞的合成前列腺素能力与血管内皮细胞之间无显著差异。结论 从小鼠骨髓中分离培养与定向诱导分化EPCs的方法,效率高,稳定性和重复性好。     

大鼠肝窦内皮细胞的分离、培养及鉴定

肝脏是由实质细胞和非实质细胞组成的具有复杂功能的器官，其中肝窦内皮细胞(sinusoidal endothelial cells，SEC)占肝非实质细胞的40％，在肝窦内形成一连续的带窗孔结构的衬垫细胞层，是肝内物质交换的屏障。与普通血管内皮细胞相比，SEC具有特殊的表面标志、结构和功能，在肝脏的生理、病理及器官移植过程中具有重要作用。但由于SEC的原代分离培养十分困难，因此阻碍了对其功能的深入研究。本研究旨在建立大鼠SEC的分离、培养及鉴定方法，为其生物学特性及功能的研究奠定基础。