重组人甲状旁腺激素1-34的纯化研究

重组人甲状旁腺激素(rhPTH(1-34))在工程菌pET(32a+)-PTH(1-34)/BL21(DE3)中以胞内可溶性融合蛋白形式高效表达。经过高压匀浆破菌处理,取上清经过亲和层析、酶切、阴离子交换层析、反相层析和阳离子交换层析进行分离纯化,得到rhPTH(1-34)原液样品纯度在98%以上,比活性达到1.05×104U/mg。     

注射用重组人甲状旁腺素代谢产物PTH(1-34)的测定及其药动学

目的:注射用重组人甲状旁腺素PTH(1-84)在体内的代谢产物PTH(1-34)对骨质疏松症具有较好的疗效,本试验通过测定人血浆中PTH(1-34)浓度的变化,了解PTH(1-34)在体内的分布,对注射用重组人甲状旁腺素PTH(1-84)的药效及作用机制具有重要意义。方法:采用固相萃取法结合放射免疫分析(RIA)测定人血浆中注射用重组人甲状旁腺素代谢产物PTH(1-34)的浓度,采用DAS2.0数据处理系统进行药动学分析。结果:PTH(1-34)的线性范围为10～1 280 pg.mL-1,最低检测限为10 pg.mL-1(RSD为3.51%),采用固相萃取柱Styre Screen H2P在血浆样本萃取效率大于85%。结论:本法测定注射用重组人甲状旁腺素在血浆中的代谢产物PTH(1-34)的方法是可行的,特异性、灵敏度、精密度和准确度较高,可应用于临床样本的检测。     

重组人甲状旁腺激素1-34的氨基酸组成分析

分析重组人甲状旁腺激素 1-3 4的氨基酸组成 ,为该品种的结构鉴定提供依据。水解条件含 1%苯酚的6mol L盐酸 ,10 5℃水解 2 4h ;衍生方法异硫氰酸苯酯 (PITC)柱前衍生法 ;氨基酸测定色谱条件色谱柱为PhenomenexprodigyODS 10 0A。 (4 .6mm× 2 5cm ,5 μm) ;流动相A为 0 .1mol L醋酸钠 (pH6.5 ) -乙腈 (93 :7) ,B为水 -乙腈 (1:4) ;二元梯度洗脱 ;检测波长为 2 5 4nm ;流速为 1ml min ;柱温为 40℃。结果 :实验值与理论值一致 ,偏差小于 10 %。本法准确、可靠、重现性好 ,可用于该产品的质量控制。     

注射用重组人甲状旁腺素(1-34)在健康人体的药代动力学

目的研究注射用重组人甲状旁腺素(1-34)[rhPTH(1-34)](激素)在中国健康人体内的药代动力学特征。方法30名健康受试者随机分为10,20,40μg3个剂量组,每组10人,用免疫放射测定法(IRMA)测定人血浆中甲状旁腺激素(PTH)浓度。结果药代动力学参数:tmax分别为(32.5±9.5),(24.0±9.7)和(35.0±13.5)min;Cmax分别为(0.14±0.04),(0.20±0.05)和(0.30±0.04)ng.mL-1;t1/2分别为(47.7±12.1),(50.1±16.4)和(53.6±14.4)min;AUC(0-240)分别为(9.79±1.46),(15.42±1.66)和(32.72±3.16)ng.min.mL-1。结论单次皮下注射重组人甲状旁腺素(1-34)在低、中、高3个剂量内,Cmax和AUC呈线性增长,与剂量呈正相关;体内代谢呈线性代谢特征,与国外报道基本一致。     

放射免疫分析法测定重组人甲状旁腺素(1-84)的血药浓度及其药动学研究

目的:建立测定注射用重组人甲状旁腺素(rhPTH)(1-84)血药浓度的方法并对其药动学进行研究,为rhPTH(1-84)Ⅰ期临床试验提供准确的测定方法。方法:采用放射免疫分析(RIA)法,以甲状腺素放射免疫试剂盒(ELISA-rhPTH)测定rhPTH(1-84)血药浓度。结果:rhPTH(1-84)血药浓度在24～520pg/ml范围内线性关系良好(r=0.9989),最低定量限为10pg/ml;血浆提取回收率为86.7%～92.8%;日内RSD<7%,日间RSD<9%;血浆样本-80℃贮存80d稳定性良好。患者皮下注射2.0μg/kgrhPTH(1-84)后的主要药动学参数分别为:tmax(0.63±0.28)h、cmax(146.55±46.35)pg/ml,AUC0-10h(532.36±132.54)pg/ml。结论:本法特异性好、灵敏度高、操作简便。     

重组人甲状旁腺素类似物PTH（1-34）在大鼠体内药动学研究

目的：研究大鼠scPTH（1-34）的药动学特征。方法：用125I标记PTH（1-34）示踪法对大鼠scPTH（1-34）后的血清药物浓度进行了测定,并用3P97程序拟和分析并计算药动学参数,采用超滤离心的方法进行药物与血浆蛋白结合率的研究。结果：大鼠scPTH（1-34）10、20和40μg/kg后,药物消除符合一房室模型。平均t1/2ke为（0.92±0.04）h;平均CL为（0.56±0.05）L/（kg.h）;Cmax和AUC0-8h均与剂量呈线性正相关,不同剂量药物与血浆蛋白平均结合率为13.4%。结论：大鼠scPTH（1-34）后,药物消除符合线性动力学特征。     

注射用重组人甲状旁腺激素人体耐受性和单剂量药动学研究

目的观察注射用重组人甲状旁腺激素(1-34)[rhPTH(1-34)]在中国健康受试者中的安全性及单剂量药动学特征。方法采用随机、开放的试验设计,耐受性试验将符合入选标准的30名健康男性和女性受试者随机分为5组,每组6名,分别给予rhPTH(1-34)5、10、20、40、60μg,观察临床生命体征及实验室检查指标的变化。单剂量药动学试验将入选的9名健康男性和女性受试者随机分为3组,分别给予rhPTH(1-34)10、20和40μg,3次给药期间有3 d的清洗期。结果rhPTH(1-34)在剂量5～60μg范围内仅有轻度的不良反应发生,给药前后生命体征和实验室检查均无有临床意义的变化,说明在中国健康受试者中的安全性和耐受性良好。3组的剂量、c_(max)、AUC之比分别是0.5:1:2,0.97:1:0.95,1.01:1:0.89,呈良好的线性关系。结论注射用rhPTH(1-34)在剂量5～60μg范围内安全,且呈线性动力学特征。     

猕猴皮下注射重组人甲状旁腺激素的药代动力学研究

研究猕猴皮下注射重组人甲状旁腺激素[rhPTH（1-34）]后的药代动力学及生物利用度。猕猴皮下注射rhPTH（1-34）10，20和40ug/kg，静脉注射rhPTH（1-34）20ug/kg以及连续皮下注射rhPTH（1-34）40ug／kg（每天一次，连续14天），应用放免方法（IRMA）检测血浆样本中药物浓度，然后采用非房室模型计算药代动力学参数。IRMA方法检测血浆中rhPTH（1-34）的线性范围为0．027—2．22ng／mL。日内和日间精密度都小于15％，并且平均回收率约为93．0％±8．6％～116．5％±14．0％。猕猴皮下注射rhPTH（1—34）10，20和40ug／kg后，平均达峰时间Tmax分别为0．67，0．5和0．83h，峰浓度Cmax分别为1．85±0．05，3．23±0．25和7．15±1．19ng/mL,曲线下面积AUC（0-∞）分别为3．4±0．6，10．7±1．3和12．6±1．5ng／h／mL,末端相消除半衰期T1/2分别为0．72±0．10，1．15±0．10和1.03±0．06h。猕猴皮下注射mPTH（1-34）20ug／kg的绝对生物利用度为46．96％。连续注射猕猴rhPTH（1-34）后无药物蓄积。IRMA方法具有高灵敏度及专属性，适用于猕猴皮下注射mPTH（1-34）后的药物药代动力学研究。在给予剂量范围内，猕猴体内的rhPTH（1-34）药物代谢符合线性动力学特征。     

重组人白介素-11在人体内的药动学

目的研究皮下注射重组人白介素-11(rhIL-11)在人体内的药动学过程。方法24名健康志愿者,男女各半,随机分成2组。rhIL-11皮下注射剂量分别为5和7.5μg·kg~(-1),定时采血,用ELISA法测定不同时间血浆中rhIL-11的浓度。浓度-时间数据经3P97软件进行房室模型拟合,计算药动学参数。结果rhIL-112种剂量(5、7.5μg·kg~(-1))的主要药动学参数分别为:t_(max)(2.25±0.53)、(3.32±0.85)h;c_(max)(6.42±2.57)、(9.75±3.75)μg·L~(-1);T_(1/2)(4.03±1.24)、(4.42±1.32)h;AUC(52.68±14.06)、(102.73±36.26)μg·h·L~(-1)。体内过程符合一室模型。结论rhIL-11的药动学特征和参数可作为临床合理用药和制定给药方案的依据。     

重组人甲状旁腺激素（1—34）在体外对UMR106细胞增殖、分化功能的影响

目的:观察重组人甲状旁腺激素(1-34)[recombinant human parathyroid hormone(1-34),rhPTH(1-34)]对成骨样细胞 UMR106细胞增殖、分化功能的影响,初步探讨其作用机理。方法:采用体外培养的 UMR106细胞,在连续或间歇2种给药方式下,以1×10~(-12)～1×10~(-7)mol·L~(-1)rhPTH(1-34)作用于细胞,选择 MTT 法考察 rhPTH(1-34)对成骨细胞分裂和增殖的影响,同时测定细胞裂解液中代表成骨细胞分化功能的碱性磷酸酶活性。结果:rhPTH(1-34)连续作用于 UMR106细胞时,能抑制增殖和分化,且浓度越高,抑制作用越强;间歇作用于 UMR106细胞时,能够促进细胞的增殖和碱性磷酸酶活性的升高,并且浓度为1×10~(-10)mol·L~(-1)时,促进作用最强,而高于或低于该浓度,作用减弱。结论:rhPTH(1-34)对 UMR106细胞增殖和分化功能的影响与给药方式和药物浓度有关。连续给药时,抑制 UMR106成骨样细胞的增殖和分化,浓度越高,抑制作用越强;而间歇给药时,促进成骨样细胞的增殖和分化,其剂量反应曲线呈类似钟形曲线。     

重组人甲状旁腺素1-34联合钙尔奇D治疗绝经后女性骨质疏松疗效观察

目的 研究重组人甲状旁腺素1-34(recombinant human parathyroid hormone 1-34,rhPTH1-34)联合钙尔奇D治疗绝经后妇女骨质疏松的治疗效果.方法 84例绝经后骨质疏松妇女被随机分为实验组和对照组,每组均有患者42例.实验组采用rhPTH1 34)联合钙尔奇D治疗,对照组仅采用钙尔奇D治疗,疗程均为6个月.观察两组患者治疗前后骨密度变化、血清钙、磷和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)、骨痛症状变化和治疗期间的骨折发生率.结果实验组治疗后的骨密度(T值)较治疗前增加,差异具有统计学意义(P<0.05);并且实验组治疗后的骨密度(T值)较对照组治疗后的骨密度(T值)增加,差异具有统计学意义(P<0.05).实验组和对照组治疗后ALP的浓度均高于治疗前,差异具有统计学意义(P<0.05),并且实验组治疗后ALP的浓度高于对照组治疗后,差异具有统计学意义(P<0.05).实验组的骨痛治疗有效率为66.67%;对照组为50%,实验组的有效率高于对照组,差异具有统计学意义(χ2=4.04,P<0.05).结论 rhPTH1 34联合钙尔奇D能够有效的提高绝经后女性的骨密度,减少骨质疏松的症状.     

人甲状旁腺素(1-34)的合成与聚乙二醇化修饰

目的合成人甲状旁腺素(1 34) [hPTH(1-34) ]并进行聚乙二醇化修饰。方法应用固相多肽合成方法合成并经高效液相色谱纯化得hPTH(1-34) ,Cys-hPTH(1- 34)和hPTH(1-34)-Cys-NH2 。Cys hPTH(1-34)和hPTH(1-34)-Cys-NH2 在水溶液(pH 7～8)中分别与平均相对分子质量为5 0 0 0的单甲氧基马来酰亚胺基聚乙二醇(mPEG50 0 0 MAL)反应,经高效液相色谱纯化得Cys(mPEG50 0 0 MAL)- hPTH(1-34)和hPTH(1-34)-Cys(mPEG50 0 0- MAL) -NH2 。结果hPTH(1-34) ,Cys(mPEG50 0 0 MAL) hPTH(1 34)和hPTH(1 34) Cys(mPEG50 0 0 MAL) NH2 的质谱和氨基酸组成分析结果均与理论值一致。hPTH(1-34) -Cys(mPEG50 0 0-MAL) NH2 保持了较好的体外活性,Cys(mPEG50 0 0- MAL) hPTH(1-34)保持了较好的体内活性。结论采用一种简便的方法成功实现了对hPTH(1-34)的N端或C端的聚乙二醇化修饰     

Safety, tolerability and pharmacokinetic study of recombinant human parathyroid hormone in healthy male Chinese subjects

AIM： To determine the safety, tolerability and pharmacokinetic parameters of a new drug recombinant human parathyroid hormone [ rhPTH （1-84）] in healthy male Chinese subjects. METHODS： domly divided Thirty-six healthy male volunteers were rangroups received into 3 groups. The volunteers in these single subcutaneous injection of rhPTH （ 1-84） in a dosage of 1, 2 and 4 μg/kg respectively. Blood samples were obtained before and after administration within 24 hours. The rhPTH concentrations in sennn were determined by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The pharmacokinetic parameters determined with use of standard noncompartmental analysis were the maximum serum concentration （ Cmax ）, the time to attain that concentration （ tmax ）, and the area under the serum concentration-time curve up to 24 hours（ AUC0-24 ） and up to infinity （AUC0-∞）. Dose proportionality of pharmacokinetic parameters （AUC, Cmax of every volunteer of each dosage and A UC was computed from log transformed data） and was examined by mean of analysis of variance （ANOVA） using SPSS software package. In the study, subjects＇ symptoms, objective signs, and vital signs, including blood pressure, heart rate, respiratory rate and body temperature, were checked and 12-lead electrocardiography was recorded before and after drug administration within 24 hours. Routine laboratory tests, including hematology, blood biochemistry, serum electrolyte, and urinalysis, were performed before and after drug administration within at 24 hours.[第一段]     

人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白的设计与活性验证

通过对NCBI数据库中不同物种同源序列进行比对protein-protein BLAST,并利用计算机软件DiscoveryStudio3.1进行分子对接和分子动力学模拟,对天然人甲状旁腺激素(1 34)的3个氨基酸R25K26K27进行Q25E26L27置换,并对突变体的生物活性进行了评价。结果显示:突变后PTH(1 34)-(RKK-QEL)和突变前PTH(1 34)多肽主链叠合后均方根偏差RMSD值为2.509 3,说明两者主链结构构象差异不大;PTH(1 34)-(RKK-QEL)与受体蛋白PTH1R的相互作用能为599.253 kcal.mol 1,较天然PTH(1 34)的554.083 kcal.mol 1增强7.5%;氢键数目由32对增加至38对;PTH(1 34)-(RKK-QEL)能显著刺激UAMS-32P细胞RANKL基因的表达(P<0.01),并抑制OPG基因的表达(P<0.01);PTH(1 34)-(RKK-QEL)作用于UAMS-32P和小鼠原代股骨骨髓细胞共培养体系时,能显著刺激破骨细胞的形成(P<0.01),并且活性高于PTH(1 34)标准品。     

乳糖诱导表达重组人甲状旁腺激素rhPTH(1-34)

目的研究以乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组人甲状旁腺激素的可行性。方法对乳糖浓度、诱导时间及发酵培养方式进行研究,确定了乳糖诱导的最佳条件。结果 0.6%的乳糖诱导4 h,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白的56.8%,采取分批补料培养方式,5 L发酵罐中蛋白表达量达到42.6%。结论乳糖能作为诱导剂诱导rhPTH(1-34)在大肠杆菌中的表达。     

ELISA法研究聚乙二醇重组人生长激素注射液单次给药人体药代动力学

目的 建立ELISA方法研究聚乙二醇重组人生长激素(PEG-rhGH)注射液单次给药人体药代动力学.方法 将30名健康受试者随机分成4组(其中两组为自身对照),分别单次皮下注射PEG-rhGH注射液(0.1 mg·kg-1、0.2 mg·kg-1、0.4 mg·kg-1)、注射用重组人生长激素(rhGH)(0.067mg· kg-1).ELISA法测定不同时间点PEG-rhGH、rhGH的血药浓度,并计算药代动力学参数.结果 PEG-rhGH、rhGH血药浓度分别在0.312 5～40.0000 ng·ml-1、0.312 5～10.0000 ng· ml-1范围内线性关系良好,最低检测性均为0.312 5ng· ml-1,批间、批内RSD均＜15％. PEG-rhGH(0.1、0.2、0.4 mg·kg-1)、rhGH(0.067mg· kg-1)的t1/2分别为:(31.70±4.70)h、(32.19±4.58)h、(30.39±5.93)h、(1.95±0.44)h,Tmax为:(22.20±9.82)h、(29.40±10.75)h、(40.80±8.39)h、(3.20±1.10)h,Cmax:(105.24±45.37)ng·ml-1、(379.09±109.61)ng·m1-1、(920.69±293.21)ng·ml-1、(30.17±3.20)ng·m1-1,CL/F:(26.97±13.86) ml· kg-1· h-1、(9.21±4.05) ml· kg-1· h-1、(6.29±2.87) ml· kg-1· h-1、(284.26±43.47)ml· kg-1· h-1,AUC0→∞:(4657.70±2337.30) ng· m1-1·h、(25279.58±9407.63) ng· ml-1·h、(74438.89±29 007.81) ng·ml-1·h、(240.97±39.40) ng·ml-1·h.结论 PEG-rhGH体内过程符合线性动力学特征,与rhGH相比,明显推迟达峰时间、延长半衰期、减慢清除率,具有长效特征.     

半乳糖化重组人生长激素和重组人生长激素在小鼠体内的药物动力学

目的：比较半乳糖化重组人生长激素和重组人生长激素在小鼠体内的药物动力学特征。方法：用＾１２５Ｉ标记Ｇａｌ－ｒｈＧＨ和ｒｈＧＨ、通过小鼠尾静脉ｉｖ，测定血和肝中相对放射性随时间的变化，以３Ｐ８７药物动力学程序进行模型拟合和参数求算。结果：＾１２５Ｉ－ｒｈＧＨ－Ｇａｌ在血中的相对放射性呈现双峰，其体内药行动力学特征与＾１２５Ｉ－ｒｈＣＨ明显不同，进一步证实了Ｇａｌ－ｒｈＧＨ的肝靶向性。