定向诱导骨髓间充质干细胞-藻酸盐复合物构建软骨组织

目的研究骨髓间充质干细胞(M SC s)经向软骨细胞定向诱导后,与藻酸盐复合,构建组织工程软骨的可能性。方法取大鼠股骨骨髓,经梯度离心法和贴壁法分离M SC s,经鉴定后用含转化生长因子1β10 ng/m l、地塞米松1-0 7m o l/L、转铁蛋白3 m g/m l、胰岛素2 m g/m l的诱导因子培养基对M SC s进行诱导,14 d后免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌情况,将诱导后和未经诱导的M SC s以1×106/m l细胞密度与藻酸钙复合接种于裸鼠,分别于4周、8周后行组织学检测。结果经诱导的M SC sⅡ型胶原免疫组化阳性,与藻酸盐复合4周,HE染色可见软骨样细胞、软骨陷窝形成,阿辛蓝染色和M asson染色可见新生的软骨细胞和细胞外胶原,8周后软骨细胞明显增多,软骨细胞分泌胶原丰富,而未经诱导的M SC s无明显软骨细胞生成。结论M SC s经定向诱导后,可与藻酸钙复合在体内形成软骨样组织,可能发展为临床修补软骨缺损的一条有效途径。     

人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究

目的:研究人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养过程中的增殖和成软骨分化现象和规律。方法:以密度梯度离心法分离健康成人髂骨MSCs,观察体外培养过程中细胞形态、生长和增殖现象。取第三代细胞给予地塞米松,维生素C和不同剂量转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)行成软骨细胞诱导。3周后行阿利新蓝及甲苯胺蓝染色蛋白多糖,免疫荧光检测II型胶原,阿利新蓝比色法检测葡萄糖氨基聚糖。结果:体外培养条件下MSCs生长旺盛。在TGF-β1作用下MSCs向软骨骨细胞分化,TGF-β110μg/L组软骨细胞标志物表达最强。结论:MSCs有旺盛的增殖能力。MSCs在一定诱导条件下可以向软骨细胞分化,转化生长因子β1(TGF-β1)是诱导MSCs向软骨分化的关键性因素,10μg/L是其最佳诱导剂量。     

兔骨髓间充质干细胞体外软骨向诱导的实验研究

目的:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞(MSCs),并定向诱导其向软骨细胞表型分化。方法:抽取兔股骨骨髓,经密度梯度离心与贴壁培养分离得到MSCs。用含有TGF-β、b-FGF、胰岛素、维生素C、转铁蛋白等的DMEM/Ham′s-F12培养基进行软骨向诱导。通过形态学观察,阿辛蓝-PAS特染及Ⅱ型胶原免疫组化染色,鉴定经过诱导后细胞的软骨细胞的表型。结果:兔MSCs原代细胞呈梭形,克隆样生长,经过诱导培养7d后,细胞形态由梭形、多角形变为椭圆形,胞浆丰富,细胞核和核仁清晰可见。阿辛蓝-PAS和Ⅱ型胶原染色阳性。结论:密度梯度离心与贴壁培养两种方法相结合可获得相对高纯度的MSCs,该细胞经诱导后可向软骨细胞分化。     

骨髓基质干细胞体外软骨定向诱导方法的研究进展

种子细胞来源一直是限制软骨组织工程发展的瓶颈,骨髓基质干细胞(BMSCs)具有取材创伤小、增殖能力强及具多向分化潜能等优点,已逐渐成为软骨构建种子细胞的研究热点.其关键问题是如何获得大量纯化的BMSCs并在体外定向诱导为软骨表型的细胞.该文就BMSCs体外软骨定向诱导方法的研究进展进行综述,以期为应用BMSCs构建软骨组织提供参考.     

骨髓间充质干细胞构建人工软骨的实验研究

目的以骨髓间充质干细胞作为种子细胞,探索组织工程化软骨的构建。方法分离、获取、扩增骨髓间充质干细胞,通过将扩增的骨髓间充质干细胞接种于聚羟基乙酸(PGA)上,在成软骨诱导因子作用下作体外诱导培养3周,将实验组和对照组的标本转植入自体兔腹腔内,进行体内培养6~12周后,再进行检测,评估工程化软骨的形成。结果骨髓间充质干细胞接种于PGA支架上,经过体外诱导培养和体内培养后,实验组获得的标本出现软骨组织样外观,进行组织学切片可见软骨陷窝,进行Ⅱ型胶原蛋白的免疫组化、Ⅱ型胶原mRNA原位杂交均为阳性。结论兔骨髓间充质干细胞在成软骨诱导剂作用下,经体外和体内培养,可生成组织工程化类软骨。     

骨髓基质干细胞体外软骨定向诱导方法的研究进展

种子细胞来源一直是限制软骨组织工程发展的瓶颈,骨髓基质干细胞(BMSCs)具有取材创伤小、增殖能力强及具多向分化潜能等优点,已逐渐成为软骨构建种子细胞的研究热点。其关键问题是如何获得大量纯化的BMSCs并在体外定向诱导为软骨表型的细胞。该文就BMSCs体外软骨定向诱导方法的研究进展进行综述,以期为应用BMSCs构建软骨组织提供参考。     

诱导的人骨髓间充质干细胞在裸鼠体内生成软骨的实验研究

目的 探讨利用组织工程方法，将人骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外诱导、培养后，再造软骨组织的可能性。方法 从胸外科手术所获得的肋骨骨髓腔中分离得到人MSCs，经无血清培养基诱导培养为软骨细胞，接种于支架材料上，埋植于裸鼠体内。6周后取材进行大体及组织学观察。结果 大体观察见裸鼠皮下形成包块，触之有韧性；组织学观察可见有大量软骨细胞成堆形成。但尚有部分未降解的支架材料残留。结论 人MSCs在体外经定向诱导后成为软骨细胞，与支架材料复合物可在裸鼠体内形成软骨组织；人MSCs可能成为组织工程软骨的“种子细胞”。     

生长因子诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的 建立一种体外分离兔骨髓间充质干细胞（MSCs)的方法，诱导其表达软骨细胞表型。方法 抽取兔骨髓，经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs。用生长因子诱导，观察细胞的增殖情况和软骨特异性基质的表达水平。结果 ①纤维粘连蛋白促进MSCs贴壁，可提高细胞分离率；②TGF－β1，IGF－I和维生素C结合可促进MSCs增殖，表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA和基质蛋白多糖成分。结论 ①密度梯度离心结合粘附分离可提高MSCs的分离效率。②TGF－β，IGF－I和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖，表达软骨细胞表型。     

骨髓间充质干细胞研究进展及在软骨组织工程中的应用

130年前．德国病理学家Cohnhein在研究创口愈合过程中首次提出骨髓中存在充质干细胞（BMSCs）的观点。近年发现，BMSCs具有向多种细胞系转化的潜能，自体获取的骨髓MSCs回输后不会发生免疫排斥反应．体外基因转染率高，因此BM—SCs已成为组织工程、细胞治疗、基因治疗等方面的研究热点。随着组织干细胞研究的兴起．特别是对组织干细胞可甥性的深入研究使得间充质干细胞的发育潜能。体外诱导分化、分离、筛选方法等的研究有了突破性进展。同时由于间充质干细胞在体内分布广泛，易于获得。并能在体外大量扩增。因此成为一种特别的组织细胞越来越引起人们的关注。     

骨髓间充质干细胞生物特性及其构造组织工程软骨研究进展

干细胞是一种具有多分化潜能和自我复制功能的早期未分化细胞，它能在人体内分化成任何细胞类型。具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，已成为组织工程中首选的种子细胞。早在1867年，德国病理学家Cohnheim通过实验推测骨髓内存在有非造血功能的干细胞，但直到20世纪60年代末才有了直接的证据。Friedenstein等将整个骨髓标本放于塑料培养瓶上，4h后倒掉非贴壁细胞，剩下少量贴壁的细胞外观多呈纺锤形。     

Biocompatibility studies on fibrin glue cultured with bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Summary By culturing bone marrow mesenchymal stem cells of rabbits with fibrin gluein vitro, the biocompatibility of fibrin glue was investigated to study whether this material can be used as scaffolds in bone tissue engineering. After 2-months old New Zealand rabbits had been anesthetized, about 4–6 ml of bone marrow were aspirated from rabbit femoral trochanter. The monocytes suspension was aspirated after bone marrow was centrifuged with lymphocyte separating medium and cultured primarily. Then the cells were divided into two groups: one was cultured with complete medium and the other with induced medium. The cells of the two groups were collected and inoculated to the culture plate containing fibrin glue. In the control group, cells were inoculated without fibrin glue. The implanted cells and materials were observed at different stages under a phase-contrast microscope and scanning electron microscope. MTT and alkaline phosphatase (ALP) were measured. Bone marrow mesenchymal stem cells grew on the surface of fibrin glue and adhered to it gradually. Cells light absorption value (A value) and the ALP content showed no significant difference. Fibrin glue had no inhibitory effect on cell morphology, growth, proliferation and differentiation. It has good biocompatibility and can be used as scaffold materials for bone marrow mesenchymal stem cells in bone tissue engineering. FANG Huang, male, born in 1962, Associate Professor     

骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质修复兔膝关节全层软骨缺损的实验

目的:研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)复合脱钙骨基质(deminerized bone matrix, DBM)修复兔膝关节全层软骨缺损的疗效. 方法:MSCs取自4～6 mo龄2.5～3.5 kg的青紫兰兔,体外分离培养后种植于DBM支架上体外培养,再移植于兔膝关节全层软骨缺损模型处. 实验动物选用健康的青紫兰兔36只,随机分成A, B, C 3个处理组各12只,A处理组(MSCs/DBM)双侧股骨髁间窝软骨缺损处植入DBM吸附体外分离培养的自体MSCs复合物;B处理组(DBM)单纯植入DBM;C处理组(对照)不作任何植入. 分别于术后4, 8和12 wk各处死4只兔子,取材进行大体、组织学及免疫组化染色观察,根据关节软骨组织学计分标准进行评分,数据输入SPSS 10.0软件统计分析,比较各组的评分差异是否具有统计学意义. 结果:MSCs复合DBM所修复组织为透明软骨样修复;而单纯DBM移植组和对照组为纤维性修复. 对术后12 wk大体及组织学形态进行评分. 按完全随机设计进行方差分析和SNK-q检验,结果显示,SMCs/DBM组明显优于DBM植入组和对照组(P<0.05);DBM组优于对照组(P<0.05). 结论:运用软骨组织工程的原理,以DBM为支架材料的自体MSCs移植是一种修复软骨缺损的行之有效的方法.     

利用软骨细胞外基质来源的多孔支架与骨髓基质干细胞体外长期培养组织工程化软骨的试验研究

研究背景 关节软骨损伤临床常见,但损伤后自我修复能力极差,目前的修复方法均有其局限性。在先前的研究中,我们研制了关节软骨细胞外基质来源的多孔支架（Cartilage ECM-derived porous scaffold, CEDPS）并观察了并在裸鼠体内异位构建软骨。但在进一步可能的临床应用之前,应进一步评估其体外培养组织工程软骨的特点及可行性。 方法 本研究利用关节软骨细胞外基质来源的支架及骨髓基质干细胞体外长时间培养构建软骨组织。粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架。扫描电镜及Micro-CT观察其微观结构,并进行细胞毒性试验,组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖（GAG）、DNA含量,生物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;骨髓基质干细胞经含TGF-β1, bFGF的条件培养基成软骨诱导后鉴定,种植到支架上,荧光显微镜及扫描电镜观察细胞黏附情况,Dead/Live免疫荧光染色观察支架内部细胞活性,体外培养1,3周后观察大体形态和组织学形态变化,同时行II型胶原免疫组织化学分析。 结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测：总胶原含量为708.2?44.7μg/mg,GAG含量为254.7?25.9μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E = 1.226?0.288MPa,覆水后压缩弹性模量E = 0.052?0.007MPa。体外培养的BMSCs-CEDPS复合体形成了类软骨样组织,Dead/Live染色表明支架内部均为活细胞,电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显。组织学结果表明蕃红花“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞外有大量基质分泌。 结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好的生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织。     

In vitro cartilage production using an extracellular matrix-derived scaffold and bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Background Cartilage repair is a challenging research area because of the limited healing capacity of adult articular cartilage.We had previously developed a natural,human cartilage extracellular matrix （ECM）-derived scaffold for in vivo cartilage tissue engineering in nude mice.However,before these scaffolds can be used in clinical applications in vivo,the in vitro effects should be further explored.Methods We produced cartilage in vitro using a natural cartilage ECM-derived scaffold.The scaffolds were fabricated by combining a decellularization procedure with a freeze-drying technique and were characterized by scanning electron microscopy （SEM）,micro-computed tomography （micro-CT）,histological staining,cytotoxicity assay,biochemical and biomechanical analysis.After being chondrogenically induced,the induction results of BMSCs were analyzed by histology and Immunohisto-chemistry.The attachment and viability assessment of the cells on scaffolds were analyzed using SEM and LIVE/DEAD staining.Cell-scaffold constructs cultured in vitro for 1 week and 3 weeks were analyzed using histological and immunohistochemical methods.Results SEM and micro-CT revealed a 3-D interconnected porous structure.The majority of the cartilage ECM was found in the scaffold following the removal of cellular debris,and stained positive for safranin O and collagen Ⅱ.Viability staining indicated no cytotoxic effects of the scaffold.Biochemical analysis showed that collagen content was （708.2±44.7）μg/mg,with GAG （254.7±25.9） μg/mg.Mechanical testing showed the compression moduli （E） were （1.226±0.288） and （0.052±0.007） MPa in dry and wet conditions,respectively.Isolated canine bone marrow-derived stem cells （BMSCs） were induced down a chondrogenic pathway,labeled with PKH26,and seeded onto the scaffold.Immunofluorescent staining of the cell-scaffold constructs indicated that chondrocyte-like cells were derived from seeded BMSCs and excreted ECM.The cell-scaffold constructs contained pink,smooth and translucent cartilage-like tissue after 3 weeks of culture.We observed evenly distributed cartilage ECM proteoglycans and collagen type Ⅱ around seeded BMSCs on the surface and inside the pores throughout the scaffold.Conclusion This study stuggests that a cartilage ECM scaffold holds much promise for in vitro cartilage tissue engineering.     

软骨细胞纤维蛋白胶混合物修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的：研究关节软骨细胞与纤维蛋白胶的混合物修复关节软骨全层缺损的效果。方法：（１）用自制消化瓶消化分离原代兔关节软骨细胞并培养;（２）通过硫酸铵沉淀法从兔血液中提取纤维蛋白原并制备纤维蛋白胶;（３）分别用自体或异体关节软骨细胞和纤维蛋白胶的混合物修复兔股骨滑车关节软骨全层缺损。术后１、２、３个月从大体观察,组织学等方面了解关节软骨缺损的修复情况。结果：自体软骨细胞组在术后３个月时修复组织已非常类似     

神经干细胞纤维蛋白凝胶支架移植治疗阿尔茨海默病的实验研究

目的:观察神经干细胞纤维蛋白凝胶支架移植治疗阿尔茨海默病(AD)模型的效果以及神经元分化的情况。方法:体外分离培养大鼠胚脑神经干细胞,用纤维蛋白凝胶为支架移植入穹隆海马伞切断AD模型鼠海马,行为学测试后用免疫组织化学方法检测神经干细胞存活和分化情况。结果:支架组动物行为学的改善明显好于单纯干细胞移植组,支架组神经干细胞的存活和分化为神经元的情况均明显好于单纯干细胞移植组。结论:将纤维蛋白凝胶支架应用于神经干细胞的移植能促进干细胞的存活和分化。     

兔关节软骨细胞在纤维蛋白胶中体外培养

目的：研究关节软骨细胞在纤维蛋白胶中三维培养时的表现。方法：（１）通过硫酸铵沉淀法从兔血液中提取纤维蛋白原并制备纤维蛋白胶;（２）在纤维蛋白胶凝成的纤维蛋白中立体培养关节软骨细胞,观察其表现并测定生长曲线、倍增时间;（３）通过透射电镜、ＡＢ－ＰＡＳ染色、Ⅱ型胶原免疫组化检查等,了解细胞生长及软骨基质的分泌情况。结果：（１）关节软骨细胞在纤维蛋白中大部分保持卵圆形、小部分如贴壁细胞状;（２）细胞倍增     

不同方法诱导的兔骨髓间质干细胞对关节软骨缺损修复效果及退化的影响

目的：以兔骨髓间质干细胞为种子细胞, 探讨不同诱导方法对组织工程移植物修复关节软骨缺损的效果及退化的影响。方法：将兔骨髓间质干细胞分为地塞米松诱导组和TGF-β₁加地塞米松联合诱导组进行体外诱导,采用自体组织工程移植物修复关节软骨缺损;对照组缺损填充无细胞单纯载体。于术后6和12周对修复组织进行组织学观察、评分及TUNEL原 位凋亡检测。结果：联合诱导组,修复组织形成理想的柱状结构,术后12周组织学评分(20.26±1.35)优于对照组(4.12±1.13)及地塞米松组(14.521.46),但修复组织未形成潮线。在骨软骨交界处软骨细胞TUNEL染色阳性,地塞米松组术后6周修复组织TUNEL染色阳性细胞记数为21.4±4.5,术后12周为7.3±2.2;联合诱导组术后6周为19.8±4.7,术后12 周为6.9±2.0,术后12周与术后6周比较差异有显著性(P<0.05)。结论：组织工程移植物的修复效果 以联合诱导组为佳,且退化发生较晚;组织工程移植物的退化与移植前诱导条件、细胞凋亡及软骨下骨板内血管系统有关。     

骨髓基质干细胞的成软骨能力

目的 综述近年骨髓基质干细胞成软骨分化的研究进展。方法 广泛查阅近期有关骨髓基质干细胞成软骨分化的研究文献。着重阐述与成软骨分化有关的生长因子及分化后的组织成分。结果 骨髓基质干细胞取材方便，体外扩增迅速，在特定的软骨培养液和生长因子作用下，可形成软骨样组织。作为自体来源的细胞可修复动物关节软骨缺损，避免了免疫反应。结论 骨髓基质干细胞扩增后数量多，具有明确的成软骨能力，作自体移植无免疫反应，用于软骨组织工程有广阔的前景。成软骨分化的调控机制和应用值得进一步研究。