人脑胶质瘤组织中RNA分离方法的改良

采用改进的异硫氰酸胍／氯化铯超离心法，从人脑恶性胶质瘤组织中分离总ＲＮＡ，ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ为２．０２。甲醛变性凝胶电泳、溴化淀染色显示，２８ｓ和１８ｓ ｒＲＮＡ条带清晰，且２８ｓ条带的荧光强度约为１８ｓ条带的２倍。再经Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ亲和层析纯化得到ｍＲＮＡ。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ转移印迹分析表明，用该方法所分离得到的ｍＲＮＡ无降解，完整性好，核酸纯度完全符合进一步实     

肾移植受者巨细胞病毒RNA检测及其临床意义

目的建立一种早期快速准确的诊断移植术后人巨细胞病毒感染的新方法。方法采用核酸基础序列扩增法(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)检测肾移植术后患者外周血标本的巨细胞病毒即刻早期(immediate-early,IE)mRNA及晚期结构抗原pp67的mRNA,同时行抗原血症(pp65)检测,并将结果相比较。结果在接受肾移植的55例患者中,IE-mRNA阳性20例;有症状的活动性巨细胞病毒感染13例。IE-mRNA的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为92.3%,83.3%,60.0%和97.1%。结论移植术后IE-mRNA序列扩增法检测能够早期、快速、客观的反映人巨细胞病毒活动性感染的状况,对临床抗病毒药物治疗具有指导意义。     

真核细胞中总RNA的制备

RNA的制备是基因表达在转录水平上的调节和cDNA的合成等研究过程中必不可少的方法之一.通常一个典型的哺乳动物细胞约含有10 pg RNA, 其中80%～85%为rRNA (主要是28 S、18 S和5 S 3种类型);10%～15%为tRNA 和核内小分子RNA;1%～5%为mRNA[1].mRNA 虽然大小和核苷酸序列各不相同,从数百至数千碱基不等,但大多数真核细胞mRNA在其3′端均有一寡聚腺苷酸(poly A)组成的尾,其长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸-纤维素[oligo(dT)],使得mRNA可以有亲和层析法分离.这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽.     

微小RNA与肿瘤研究进展

微小核糖核酸(miRNA)是一类在生物体中广泛表达的、非编码调节性小分子RNA。成熟的miRNA与RNA诱导沉默复合体结合后,通过与靶mRNA的特定序列互补或不完全互补结合,进而发挥阻遏翻译或引导酶切的功能。miRNA具有多种生物学功能,如调节细胞发育、分化、增殖、凋亡、免疫与应激反应等,并且具有肿瘤抑制因子及癌基因的作用,可能是诊断、治疗肿瘤的一种潜在手段。     

一种简便实用的RNA制备方法

一种简便实用的ＲＮＡ制备方法陈誉华宋今丹（细胞生物学卫生部重点实验室，沈阳１１０００１）关键词核糖核酸；核酸杂交；反转录—多聚酶链反应ｃＤＮＡ克隆或从ｍＲＮＡ来分析细胞内某蛋白表达的首要步骤是提纯细胞的总ＲＮＡ。迄今有关细胞总ＲＮＡ的制备方法虽已常规...     

短发夹RNA表达载体对2型单纯疱疹病毒UL54基因的干扰效应

目的研究短发夹核糖核酸（shRNA）表达载体对2型单纯疱疹病毒（HSV-2）UL54基因的干扰效应。方法针对HSV-2 UL54基因,构建5个靶向HSV-2 UL54基因的短发夹RNA重组表达载体（shRNA1081、shRNA1092、shRNA1276、shRNA1407、shRNA1508）,同时设计不针对任何基因的序列为阴性对照组（阴性对照组）及不加任何重组表达载体的空白对照（空白对照组）。重组表达载体通过脂质体转染人胚胎肾细胞（HEK293）后接种HSV-2,48 h后利用荧光定量RT-PCR检测各组细胞UL54 mRNA的表达水平,终点滴定法测定HSV-2子代病毒滴度。结果荧光定量RT-PCR结果示,与空白对照组相比,shRNA1081、shRNA1407和shRNA1508能够降低HSV-2 UL54 mRNA的表达水平（P均〈0.01）;对UL54基因的抑制率在阴性对照组（加shRNA NC）、shRNA1081组、shRNA1407组、shRNA1508组分别为7%、69%、56%及55%,以shRNA1081组为最高。终点滴定法结果示,与空白对照组比较,shRNA 1081组、shRNA 1407组、shRNA 1508组病毒滴度不同程度下降（P均〈0.01）。结论成功构建UL54 shRNA重组表达载体,shRNA1081、shRNA1407、shRNA1508能在体外细胞水平上不同程度地干扰HSV-2 UL54基因表达,从而抑制HSV-2在HEK293细胞中的复制。     

狼疮性肾炎外周血单个核细胞B7-1和B7-2 mRNA表达异常及其与疾病活动的关系

目的观察活动期和静止期狼疮肾炎(LN)外周血单个核细胞(PBMC)B7-1(CD80)和B7-2(CD86)mRNA表达及其与疾病活动的关系,以探讨B7-1和B7-2mRNA表达异常在LN自身免疫发生中的作用及临床意义.方法以正常人为对照,分离15例活动期和13例静止期的LN患者PBMC,采用半定量反转录PCR的方法,检测PB-MC的B7-1和B7-2mRNA表达.B7-1和B7-2mRNA表达与SLE疾病活动评分指数(SLEDAI)的相关关系用直线相关分析.结果静止期LN组B7-1和B7-2mRNA表达与正常人对照组相比无显著性差异(P＞0.05),活动期LN组B7-1mRNA有明显的上升(P＜0.05),B7-2mRNA表达增高更加显著(P＜0.01).B7-2mRNA的增高与SLEDAI呈直线正相关关系(r＝0.8641,P＜0.05).结论活动期狼疮性肾炎存在着B7mRNA表达的异常,B7-2mRNA的增高与SLEDAI呈直线正相关关系.     

胰RNA注射液的安全性实验

将由胰脏提取分离的RNA制成注射液并注射在家兔、小鼠和狗等正常动物体内,观察了几种生理指标和病理组织学变化.结果表明,长期注射胰RNA的家兔其血清总蛋白含量和体重比对照组明显增高,而未发现任何不良反应,光镜下病理组织学检查未发现病理组织学异常变化.将1000倍的大剂量胰RNA注射在小鼠静脉内也未发现异常反应.对麻醉犬静脉注射胰RNA5mg/kg后,观察犬的血压、心率、呼吸,并未发现异常变化;犬肝动脉内注射胰RNA0.5mg/kg,对肝血流、血压、心率以及呼吸都无影响.     

外照射对体外培养的小细胞肺癌细胞系总RNA及多药耐药基因的影响

目的观察分次外照射对小细胞肺癌NCI-H446细胞系总RNA及其MDR1mRNA的影响.方法采用GWGP80型远距离60Co治疗机对进入指数生长期的NCI-H446小细胞肺癌细胞系进行分次外照射,每次2Gy,总剂量50Gy.用Trizol分别提取未照射和已完成全部外照射剂量NCI-H446细胞系的总RNA.通过RT-PCR、琼脂胶电泳、Gelbase电脑软件计算电泳条带的平均吸光度A值,用两组细胞MDR1DNA与其β-actin DNA的平均吸光度A值的比确定两组细胞MDR1mRNA表达的高低.结果在相同细胞数和相同体积的条件下,未照射组和照射组细胞总RNA的浓度分别为25.9μg/ml和16.6μg/ml;未照射组细胞其MDR1DNA/β-actin DNA为1.078,照射组为1.338.结论对小细胞肺癌细胞系NCI-H446进行外照射可抑制其总RNA的生物合成,同时可提高其MDR1mRNA的表达水平.     

人端粒酶RNA的cDNA探针制备及其对胃粘膜细胞端粒酶RNA表达的检测

目的 建立人端粒酶RNA表达的检测方法。方法 制备人端粒酶RNA，(human telomeraseRNA，hTR)的cDNA探针，分别应用RNA斑点杂交与端粒重复序列扩增法(TRAP)分析检测不同胃粘膜的端粒酶RNA的表达与端粒酶活性。结果 人端粒酶RNA的cDNA探针制备成功。18例活检胃癌组织及45例手术胃癌组织RNA斑点杂交检测的阳性率均为l00％，相应TRAP分析的阳性率分别为88．89％、86．67％，低于RNA斑点杂交(P＜0．05)。同时RNA斑点杂交结果提示在非癌胃组织中随着肠化程度增高人端粒酶RNA表达也增强。结论 RNA斑点杂交检测人端粒酶RNA，具有高度的敏感性和特异性，弥补了TRAP分析敏感性不足的缺点。     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.     

大鼠心肌总RNA的提取

目的 建立一种高效快速提取大鼠心肌总RNA的方法，为心肌组织mRNA的检测提供条件。方法 利用高浓度强烈变性剂(异硫氰酸胍)使细胞结构迅速破坏，并直接通过酚等有机溶剂处理、离心，使RNA与细胞DNA、蛋白质、细胞残片等分离，迅速得到总RNA。结果 得到高纯度、未被降解的总RNA。结论 此法简洁高效，耗时短，完全可用于临床分析工作。     

氟中毒大鼠睾丸细胞DNA和RNA变化的荧光组织化学研究

目的：探讨氟中毒对睾丸结构和功能损害的分子机制,研究其睾丸DNA和RNA的影响。方法：选用2月龄Wistar雄性大鼠16只,均分为实验组和对照组,实验组饮用含200mg/L氟化钠的去离子水,对照组单纯饮用去离子水。12周后,采用吖啶橙荧光染色法显示睾丸细胞DNA和RNA。结果：与对照组相比,实验组大鼠睾丸细胞DNA和RNA荧光显色反应强度明显减弱。结论：氟中毒大鼠睾丸细胞DNA和RNA活性明显减少,这些变化可能是氟损害睾丸结构和功能的重要原因之一。     

毛细管电泳测定micro RNA346基因多态性的方法研究

目的建立micro RNA346基因多态性的毛细管电泳（CE）测定方法。方法采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取血清样品基因组DNA，PCR扩增micro RNA346目的基因，BciT130Ⅰ限制性内切酶酶切，产物用CE测定。对CE筛分介质质量浓度、分离电压等参数进行了优化。在优化的条件下（筛分介质质量浓度为10 g/L分离电压为12 kV)，分别测定类风湿性关节炎患者和正常人血清样品micro RNA346酶切产物，并对其进行基因分型。结果在优化的CE实验条件下（筛分介质质量浓度为10 g/L，分离电压为12 kV，25 min内可完成micro RNA346基因酶切产物检测。方法日内相对标准偏差（RSD）为0.43%～0.63%，日间RSD为1.49%～1.56%。用该法测定了96份类风湿性关节炎患者样品和43份正常人样品，结果均为micro RNA346 Ⅰ型，未发现micro RNA346 Ⅱ型。结论本研究建立的方法操作简单，具有高效、快速、样品用量少、自动化程度高等优点，适用于micro RNA类小分子RNA基因多态性的测定。     

RNA interference and its current application in mammals

Objective The aim of this review was to assess RNA interference (RNAi) and its possibility as a potential and powerful tool to develop highly specific double-stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) based gene-silencing therapeutics. Data sources The data used in this review were obtained from the current RNAi-related research reports. Study selection dsRNA-mediated RNAi has recently emerged as a powerful reverse genetic tool to silence gene expression in multiple organisms. The discovery that synthetic duplexes of 21 nucleotides siRNAs trigger gene-specific silencing in mammalian cells has further expanded the utility of RNAi in to the mammalian system. Data extraction The currently published papers reporting the discovery and mechanism of RNAi phenomena and application of RNAi on gene function in mammalian cells were included. Data synthesis Since the recent development of RNAi technology in the mammalian system, investigators have used RNAi to elucidate gene function, and to develop gene-based therapeutics by delivery exogenous siRNA or siRNA expressing vector. The general and sequence-specific inhibitory effects of RNAi that will be selective, long-term, and systemic to modulate gene targets mentioned in similar reports have caused much concern about its effectiveness in mammals and its eventual use as a therapeutic mordality. Conclusions It is certain that the ability of RNAi in mammals to silence specific genes, either when transfected directly as siRNAs or when generated from DNA vectors, will undoubtedly accelerate the study of gene function and might also be used as a potentially useful method to develop highly genespecific therapeutic methods. It is also expected that RNAi might one day be used to treat human diseases.     

利用RNA捕获法在全基因组进行egfr启动子片段的富集

目的以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,egfr)启动子片段为目标靶序列,用RNA捕获法在全基因组进行靶序列的富集,结合第二代测序技术,实现候选基因区段的深度测序。方法本研究以宫颈癌细胞系HeLa S3 egfr启动子为模型,提取基因组后用MboⅠ酶切,补平加PE接头,回收400 bp～1000 bp的DNA片段作为模板,并用egfr启动子RNA与制备的基因组模板杂交将egfr启动子片段富集,富集的DNA片段PCR扩增15轮后用Solexa高通量测序。结果通过生物信息学技术分析,从实验组中随机取总条数为106 reads,比对到egfr启动子片段reads条数为1 889条,而比对到随机挑选的notch 1、pdgf-B、src基因reads条数分别为2、3、3条。从人类全基因组随机取总条数为106的等长reads作为对照组,比对到notch 1、pdgf-B、src、egfr基因reads条数分别为3,2,3,2条。在本实验中egfr启动子片段通过RNA捕获法被富集了630倍。结论用本研究建立的RNA捕获法进行基因组靶序列捕获、富集、测序文库建立的技术路线可行,所建DNA文库可直接用于Solexa测序仪的测序。RNA捕获技术与第二代高通量测序技术结合能应用于靶区域的重测序,研究可变剪切、核小体分布,发现和分析新的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphisms,SNPs)位点,寻找许多复杂疾病相关基因及位点,针对性强,简便易行,节约成本。     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 探讨表达乙型肝炎病毒（HBV）双靶区反义RNA的逆转录病毒载体对HBV复制和表达的影响。方法 用分子克隆法构建表达HBVX、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒,转染PA317细胞,用NIH3T3细胞扩增法检测假病毒颗粒滴度,以假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用酶标法检测其上清HBsAg和HBeAg,并以荧光聚合酶链反应定量方法检测2.2.15细胞内DNA和RNA含量。结果 HBVX、P双靶区反义RNA抗HBV的作用较单靶区反义RNA更明显,且对HBVS、C、P三个开放读码区的DNA和RNA抑制作用大,正义RNA无明显抑制作用。结论 细胞内表达HBV反义RNA具有明显抗HBV复制和表达的作用。双靶区反义RNA作用更明显。     

葡萄胎DNA和RNA含量与恶变的关系

①目的　探讨葡萄胎DNA和RNA含量与恶变的关系 ,寻求一种预测葡萄胎恶变的方法。②方法采用图像分析技术测定 10 0例葡萄胎标本的DNA ,RNA含量 ,同时选择恶性葡萄胎及绒毛膜癌标本 2 0例作对照。③结果　恶性对照组DNA ,RNA含量明显高于葡萄胎组 (t’ =4.6 8,t=8.39,P <0 .0 1) ,完全性与部分性葡萄胎之间DNA ,RNA含量差异有极显著性 (t’ =3.0 8,4.48,P <0 .0 1) ,完全性葡萄胎中恶变组DNA ,RNA含量明显高于非恶变组 (t’ =4.77,5 .0 6 ,P <0 .0 1)。④结论　应用图像分析技术检测葡萄胎组织的DNA ,RNA含量 ,可以预测葡萄胎是否发生恶变。     

慢性氟中毒对大鼠大脑DNA和RNA含量的影响

研究了31只长期饲以含氟50ppm自来水而造成慢性氟中毒的Wistar大鼠大脑DNA、RNA含量的变化,以24只饲以正常饮食的大鼠作正常对照。结果显示:慢性氟中毒大鼠尿氟含量升高,出现氟斑牙,大脑组织氟含量增多,大脑重量减轻,大脑RNA含量降低、而DNA含量无明显改变。说明大脑氟量过多可抑制RNA合成,使其含量降低,并影响蛋白质合成,致大脑重量减轻。