甲氨蝶呤对妊娠小鼠滋养细胞bcl-2/bax表达的影响

目的探讨甲氨蝶呤（MTX）促进滋养细胞凋亡、抑制滋养细胞增生的机制。方法建立正常妊娠小鼠模型、MTX妊娠小鼠模型,运用免疫组化方法检测两组小鼠孕13 d滋养细胞bax、bcl-2的蛋白表达;同时运用原位细胞凋亡（TUNEL）检测两组小鼠孕13 d的滋养细胞凋亡情况。结果与正常妊娠模型小鼠相比,MTX妊娠模型小鼠滋养细胞bax蛋白表达较强（P〈0.01）,bcl-2蛋白表达减弱（P〈0.01）;MTX妊娠模型小鼠滋养细胞凋亡指数明显高于正常妊娠模型小鼠（P〈0.01）。结论 MTX抑制滋养细胞增生、促进滋养细胞凋亡,可能是通过调节bax、bcl-2蛋白的表达实现的。     

微小核糖核酸- 29b通过靶向髓样细胞白血病- 1影响脑缺血/再灌注损伤时神经细胞凋亡

【摘要】 目的 确定微小核糖核酸（microRNA,miRNA,miR）在脑缺血/再灌注（I/R）损伤中对神经细胞凋亡的影响,并探讨其潜在机制。方法 培养小鼠成神经细胞瘤（N2a）细胞,构建氧糖剥夺（OGD）/复氧（R）模型,模拟体外脑I/R状态。N2a细胞随机分为空白对照组（control）、OGD/R组（OGD/R）、OGD/R＋转染miR-29b模拟物组（mimics）、OGD/R＋转染miR-29b抑制剂组（inhibitor）、OGD/R＋转染miR-29b模拟物阴性对照组（mimics NC）、OGD/R＋转染miR-29b抑制剂阴性对照组（inhibitor NC）。实时定量聚合酶链反应（PCR）检测各组miR-29表达变化。细胞计数试剂盒（CCK）-8和流式细胞术分别检测miR-29b和miR-29b抑制剂对N2a细胞活力和凋亡的影响。免疫印迹法检测抗凋亡蛋白髓样细胞白血病（MCL）-1、B淋巴细胞瘤（BCL）-2及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase）-3表达。双荧光素酶分析验证miR-29b与MCL-1间相互作用。结果 与control组相比,OGD/R组miR-29b表达明显升高。与OGD/R组相比,mimics组N2a细胞凋亡增加,存活率降低,MCL-1、BCL-2表达下调,caspase-3表达上调,而这种效应在inhibitor组受到逆转。双荧光素酶分析显示miR-29b可通过与MCL-1的3’非翻译区（UTR）端结合下调MCL-1表达。结论 miR-29b在脑I/R损伤过程中通过靶向MCL-1促进神经细胞凋亡。这为缺血性脑卒中治疗提供了一潜在的新靶点。     

Caspases在消炎痛所致胃黏膜细胞凋亡中的作用

目的　研究大鼠在体情况下消炎痛(IND) 所致胃黏膜细胞凋亡过程中caspase 3、8基因及蛋白表达的变化,以探讨其黏膜损伤机制。方法　SD大鼠以不同剂量IND(30、60、90、120mg/kg)灌胃后3h处死,另设对照组。采用TUNEL标记技术检测黏膜细胞凋亡;分别采用原位分子杂交和RT PCR检测caspase 3基因表达的变化,应用免疫组化方法同步检测caspase 3、8蛋白表达的变化。结果　TUNEL标记显示对照组大鼠胃黏膜仅见少量凋亡细胞,IND组凋亡细胞数明显增加,计算机图像分析显示阳性细胞平均像素点在IND 30、60、90、120mg/kg组分别为对照组的6 3、8 0、12 6和17 1倍(P<0 01);原位分子杂交显示,caspase 3 mRNA在对照组胃黏膜呈弱阳性表达,IND 30~90mg/kg组呈中等至强阳性,120mg/kg组呈强阳性表达,与对照组相比均有显著差异(P<0 01), caspase 3 mRNA表达变化同细胞凋亡之间呈明显正相关(r=0 9642,P<0 01);RT PCR显示对照组胃黏膜中caspase 3 mR NA表达量极少,IND各剂量组的caspase 3/βactin吸光度比值较对照组明显升高(P<0 01);免疫组化染色显示对照组胃黏膜caspase 3、8蛋白均呈弱阳性表达,caspase 3表达水平强于caspase 8(P<0 05),IND使caspase 3、8蛋白表达呈中等至强阳性,明显高于对照组(P<0 05),IND各剂量组caspase 3     

生物可降解镁对人胆管癌细胞和小鼠H22肿瘤抑制作用研究

【摘要】 目的 评价可降解金属镁对人胆管癌细胞（RBE）和小鼠H22肿瘤的抑制作用。 方法 RBE细胞分别与纯镁和钛合金第1、3、5天浸提液共培养，细胞计数试剂盒（CCK）-8检测细胞毒性，流式细胞仪分析细胞凋亡。采用H22荷瘤小鼠模型，分别植入纯镁、钛合金后，于第3、6、9、12、15天测量肿瘤重量和体积变化，并通过钼靶X线摄影观察金属在体内降解情况。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）染色和免疫组化染色检测细胞凋亡和相关蛋白表达水平。结果 第1、3、5天，纯镁浸提液和钛合金浸提液对RBE细胞抑制率分别为24.7%、60.2%、70.7%和-3.1%、1.3%、1.0%，差异均有统计学意义（P＜0.05）；细胞凋亡率分别为13.8%、33.8%、46.7%和6.1%、7.1%、5.6%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。随着时间推移，纯镁在小鼠H22肿瘤中可部分降解。纯镁组肿瘤生长受到抑制，第9、12、15天平均体积（5.6 cm3、8.2 cm3、11.2 cm3）均显著低于钛合金组（11.4 cm3、18.0 cm3、21.7 cm3）（P＜0.05）。纯镁组、钛合金组凋亡细胞比率分别为9.7%、5.3%（P＜0.05），纯镁组小鼠肿瘤组织碳酸酐酶（CA）Ⅸ蛋白表达与钛合金组相比显著降低（P＜0.05），其上游蛋白低氧诱导因子（HIF）-1α虽有下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 可降解金属镁可抑制RBE细胞和小鼠H22肿瘤生长。     

长链非编码RNA CAF调节阿霉素诱导的心肌细胞毒性机制的研究

目的阿霉素（doxorubicin,DOX）作为化疗药物广泛用于治疗各种肿瘤。然而,限制其临床应用的主要因素是心脏毒性,调节DOX诱导的心脏毒性的分子组分和详细机制仍然在很大程度上不明。本研究旨在探索长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)调节DOX诱导的心肌细胞毒性机制。方法采用高通量lncRNAs基因芯片研究与对照组样品相比较,2 μmol/L DOX诱导的细胞样品中的lncRNA的差异性表达谱。同时采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）方法对差异表达的lncRNA分子进行验证。6只健康纯种雄性8周龄小鼠,通过DOX注射制作心脏毒性模型小鼠（模型组）;6只健康C57BL/6J小鼠饲以基础饲料为对照组;小鼠原代心肌细胞根据转染情况分为阴性对照组,心肌细胞凋亡因子（cardiac apoptosis factor,CAF）组和CAF siRNA组。通过荧光定量PCR测定模型组与对照组小鼠MIEF1基因的表达。通过合成lncRNA的小干扰RNA作为反向对照抑制MIEF1在小鼠原代心肌细胞中的表达,应用实时荧光定量PCR验证MIEF1表达情况。结果①对lncRNA基因芯片结果进行差异性分析,实时定量PCR检测结果显示,与正常组相比较,DOX处理组中被命名为CAF的lncRNA表达显著上调（n=4;t=7.79,P<0.01）。②DOX诱导的小鼠心肌细胞毒性模型造模成功。荧光定量PCR显示,与空白对照组相比,模型组MIEF1 mRNA的表达量明显降低（n=3;t=14.978,P<0.01）;不同浓度DOX处理细胞24 h 后,DOX浓度越高,MIEF1 mRNA的表达量显著降低（n=4;t2 μmol/L=33.423,P<0.01;t4 μmol/L=36.120,P<0.01;t6 μmol/L=40.205,P<0.01）。CAF siRNA组MIEF1下调（n=4;t=12.909,P<0.01）,CAF组上调（n=4;t=33.634,P<0.01）。③蛋白印迹法显示CAF组MIEF1蛋白表达水平明显低于阴性对照组（n=4;P<0.01）,然而CAF siRNA组MIEF1蛋白表达水平高于阴性对照组（n=4;t=4.892,P<0.01）。结论LncRNA CAF在心脏细胞和小鼠的心脏响应DOX的治疗下调。用DOX治疗后MIEF1的表达水平显著降低。LncRNA CAF直接靶向 51 kDa的MIEF1,并抑制其在转录水平的表达。本研究确定了一种由lncRNA CAF和MIEF1组成的新途径,其介导DOX心脏毒性,为治疗心脏保护提供了有希望的治疗策略。     

肌细胞增强因子2D通过负向调控有丝分裂诱导基因6的表达促进肝癌细胞PLC/PRF5和SMMC7721的增殖和迁移

目的观察肌细胞增强因子2D（myocyte enhancer factor 2D,MEF2D）对肝癌细胞PLC/PRF5和SMMC7721增殖和迁移的影响,并探究其是否通过负调控有丝分裂诱导基因6（mitogen induced gene 6,MIG6）的表达发挥作用。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应技术分别检测肝癌细胞中MEF2D和MIG6转录水平的表达,以MEF2D mRNA表达量作为横坐标,以MIG6 mRNA表达量作为纵坐标,制作线性相关图;用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）在PLC/PRF5细胞中下调MEF2D和MIG6后,通过细胞增殖与毒性测定试剂盒（7Sea-Cell Counting Kit,7Sea-CCK）和细胞划痕法检测肝癌细胞增殖和迁移能力;用siRNA在PCL/PRF5细胞中下调MEF2D、用MEF2D过表达质粒在SMMC7721细胞系中上调MEF2D后,通过蛋白印迹检测法分别检测MEF2D和MIG6的蛋白质表达水平。根据实验,共分为阴性对照（negative control,NC）组、siMIG6组、siMEF2D组、si2M（同时下调MIG6和MEF2D）组、空白对照组、空载对照组、MEF2D组7组。结果肝癌细胞hcclm3、SMMC7721、PLC/PRF5、HepG2、7703、Huh7、Bel-7402中MEF2D mRNA、MIG6 mRNA表达水平呈现负相关关系（r=-0.78）。细胞增殖实验,24 h和48 h时,下调MIG6或MEF2D后,与NC组比较,siMIG6组或siMEF2D组中PLC/PRF5细胞增殖能力无显著变化;同时下调MIG6和MEF2D后,与siMEF2D组比较,si2M组中PLC/PRF5细胞增殖能力无显著变化。72 h时,各组间方差分析差异有统计学意义（F=20.68、P<0.01）;下调MIG6后,与NC组比较,siMIG6组中PLC/PRF5细胞增殖能力显著增强[光密度（optical density,OD）值为3.73±0.18,t=3.84、P=0.02];下调MEF2D后,与NC组比较,siMEF2D组中PLC/PRF5细胞增殖能力显著下降（OD=1.79±0.22,t=3.95、P=0.02）;同时下调MIG6和MEF2D后,与siMEF2D组比较,si2M组中PLC/PRF5细胞增殖能力增强（OD=2.99±0.03,t=4.83、P<0.01）。细胞划痕实验,各组间方差分析差异有统计学意义（F=42.27、P<0.01）;48 h时,下调MIG6后,与NC组比较,siMIG6组中PLC/PRF5细胞迁移能力显著增强[细胞迁移率为（51±4）%,t=3.22、P<0.05）];下调MEF2D后,与NC组比较,siMEF2D组中PLC/PRF5细胞迁移能力显著下降[细胞迁移率为（19±3）%,t=7.70、P<0.01];同时下调MIG6和MEF2D后,与siMEF2D组比较,si2M组中PLC/PRF5细胞迁移能力增强[细胞迁移率为（46±3）%,t=6.99、P<0.01]。蛋白质印迹检测,下调MEF2D后,与NC组比较,siMEF2D组中PLC/PRF5细胞MIG6蛋白表达水平显著上升（t=7.86、P<0.001）;上调MEF2D后,与空载对照组比较,MEF2D组中SMMC7721细胞MIG6蛋白表达水平显著下降（t=4.61、P=0.004）。结论肝癌细胞PLC/PRF5和SMMC7721中MEF2D和MIG6表达量呈负相关关系,MEF2D很可能通过负向调控MIG6的表达从而促进肝癌细胞PLC/PRF5和SMMC7721增殖和迁移。     

MMP-14与EMMPRIN在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的：探讨基质金属蛋白酶-14(matrix metalloproteinase 14,MMP-14)和细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）中的临床意义,并分析二者的相关性。方法选取2012年1月—2014年6月于我院口腔颌面外科诊治的69例OSCC患者作为OSCC组,同时选取43例口腔正常新鲜组织标本作为对照组。采用逆转录-聚合酶链反应技术检测组织中的MMP-14及EMMPRIN mRNA的表达含量。结果MMP-14 mRNA、EMMPRIN mRNA在OSCC组中的相对表达量明显高于对照组,差异具有统计学意义（t=8.198、9.624,P＜0.01）;OSCC组患者在年龄、性别因素中的MMP-14、EMMPRIN mRNA的表达差异不明显（P＞0.05）,在伴有淋巴结转移的患者中均明显升高（t=2.909、2.156,P＜0.05）;且MMP-14、EMMPRIN mRNA在Ⅲ～Ⅳ期、中低分化的OSCC中表达均明显升高,差异具有统计学意义（t=3.376、2.667、3.027、2.399,P＜0.05）;MMP-14与EMMPRIN mRNA表达含量间相关系数为r=0.821,二者呈正相关性（P＜0.01）。结论OSCC组织中MMP-14和EMMPRIN mRNA的高表达状态均与肿瘤的病理分期、分化程度及淋巴结转移因素关系密切,二者的表达具有正相关性,提示MMP-14和EMMPRIN均参与了OSCC的浸润及转移过程,通过检测EMMPRIN及MMP-14 mRNA表达含量可能有助于OSCC的病变程度及预后转归判断。     

二肽基肽酶-Ⅳ抑制剂通过激活ERK1/2和NF-κB信号通路促进2型糖尿病小鼠主动脉血管钙化

目的 探讨2型糖尿病小鼠发生主动脉血管钙化后,机体内二肽基肽酶-Ⅳ（dipeptidyl peptidase-4,DPP-4）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK1/2）与kappa基因相结合的核因子(nuclear factor-kappa gene binding,NF-κB)等变化及相关机制的研究。方法 对正常小鼠（对照组）与糖尿病小鼠均进行高糖高脂饲料喂养,按照不同的给药方式进行分组治疗后,通过血液检测各组小鼠血糖及ELISA试剂盒检测各组小鼠DPP-4浓度变化,通过钙离子试剂盒测定主动脉中钙离子含量,通过Von Kossa钙化染色测定各组小鼠腹主动脉钙化情况,通过免疫组化与Western blot实验测定血管组织各蛋白的表达情况。结果与对照组比较,糖尿病组小鼠血糖含量、主动脉钙离子含量、DPP-4浓度及血管钙化程度均升高（P＜0.05）;与糖尿病组比较,西格列汀及各抑制剂组小鼠血糖含量、主动脉钙离子含量、DPP-4浓度及血管钙化程度均降低（P＜0.05）。与对照组比较,糖尿病组p-ERK与NF-кB蛋白表达量显著增加（P＜0.05）;与糖尿病组比较,西格列汀及各抑制剂组p-ERK与NF-κB蛋白表达量显著减少（P＜0.05）。结论 糖尿病小鼠体内DPP-4含量明显增多,从而激活ERK1/2与NF-κB信号通路,促进其主动脉血管发生钙化。     

不同照射方式对结直肠癌CL187细胞的抑制作用和分子机制初探

目的 研究单次、分次和125Ⅰ粒子持续低剂量率照射对结直肠癌CL187细胞生物学效应的影响.方法 实验分高剂量率单次照射组(400 cGy/min,单次组)、分次照射组(2 Gy/次/d,400 cGy/min,分次组)和125Ⅰ粒子持续低剂量率照射组(2.77 cGy/h,125Ⅰ组).3组细胞照射0、2、4和8 Gy后,24和48 h进行细胞计数和锥虫蓝染色,比较细胞总数和细胞存活率的差异.利用克隆形成实验比较3组细胞增殖能力的差异.通过流式细胞仪检测细胞凋亡.蛋白免疫印迹法分析PHLPP2、PTEN和Bax蛋白表达的变化.结果 与单次组和分次组相比,125Ⅰ组细胞总数减少(t=34.28和29.48,P＜0.05)、存活细胞比例减少(t=-12.38和-14.61,P＜0.05),细胞克隆形成能力下降,相对生物学效应是1.41.照射后48 h细胞凋亡检测发现125Ⅰ组细胞凋亡比例增加(t=-15.08和-11.99,P＜0.05).蛋白免疫印迹法检测发现125Ⅰ组Bax表达量升高,PHLPP2和PTEN的表达量3组间差异无统计学意义.结论 单次、分次和持续低剂量率照射后细胞PHLPP2蛋白表达水平均升高,但剂量率的高低并不影响其表达水平.不同方式照射后,凋亡相关蛋白Bax的表达水平上升,125Ⅰ组升高更加明显,125Ⅰ持续低剂量粒子照射可能通过影响凋亡相关蛋白Bax的表达水平实现对结直肠癌CL187细胞的杀伤作用.     

N6-甲基腺苷甲基化对小鼠脑缺血-再灌注损伤中微小核糖核酸-155表达和脑损伤的调控作用

【摘要】 目的 研究N6-甲基腺苷（m6A）甲基化对小鼠脑缺血-再灌注损伤（CIRI）模型中微小核糖核酸（microRNA,miRNA,miR）-155表达和脑损伤的调控作用。方法 栓线法构建小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型,实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析MCAO小鼠脑细胞中pri-miR-155、pre-miR-155及miR-155表达水平,检测建模24 h小鼠脑组织细胞中甲基转移酶样蛋白（METTL）3、miR-155 mRNA表达水平及蛋白表达水平。用慢病毒转染构建METTL3高表达和低表达小鼠模型,再构建MCAO模型,检测右脑组织中pri-miR-155、pre-miR-155和miR-155表达水平。 结果 MCAO小鼠脑组织细胞中pri-miR-155表达水平显著降低（P=0.009）,pre-miR-155、miR-155表达水平显著升高（P=0.007、0.000 8）;MCAO建模24 h小鼠右脑中METTL3、miR-155表达水平均升高（P＜0.05）,METTL3蛋白表达水平也随miR-155剂量增加而升高,但METTL14、肾母细胞瘤1相关蛋白（WTAP） mRNA表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05）;小鼠右脑组织中METTL3过表达显著降低pri-miR-155表达水平（P=0.008）,同时升高pre-miR-155、miR-155表达水平（P=0.04、0.009）; METTL3在细胞中沉默表达显著升高pri-miR-155表达水平（P=0.006）,同时降低pre-miR-155、miR-155表达水平（P=0.03、0.009）。结论 CIRI中METTL3异常表达可增强m6A修饰作用,促进pre-miR-155成熟,进而升高miR-155表达水平。这可能为未来缺血性脑卒中患者提供一新治疗策略。