BARD1剪切变异体在卵巢癌组织中的表达及临床意义

目的探讨卵巢癌肿瘤抗原新基因OCY-142即BARD1的剪切变异体在卵巢癌中的表达及临床意义。方法用RT—PCR的方法检测OCY-142在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达。结果在28例卵巢癌组织中,有10例（35．7％）明显表达OCY-142抗原基因,而30例正常卵巢组织中均没有OCY-142抗原基因的表达,两者之间有显著性差异（P〈0．05）。OCY-142的表达与卵巢癌的病理类型有关,在浆液性乳头状囊腺癌患者中有较高的特异性（P〈0．05）,但OCY-142的表达与卵巢癌的临床分期和组织分化程度没有相关性（P〉0．05）。结论卵巢癌肿瘤抗原基因OCY-142是BARD1基因的1个剪切变异体,其有可能成为卵巢恶性肿瘤免疫治疗的新靶点。OCY-142在卵巢浆液性囊腺癌中有较高的表达,其临床意义值得进行更深入的研究。     

卵巢癌自身抗体谱研究及应用

目的 肿瘤自身抗原可以诱导机体免疫反应,产生与肿瘤相关的自身抗体.因此,在肿瘤患者血清中存在肿瘤自身抗体谱.本研究拟寻找鉴定卵巢癌自身抗体谱,研究这些自身抗体作为卵巢癌诊断候选血清标志物的可能性;同时鉴定这些自身抗体的抗原,为卵巢癌的免疫治疗提供候选靶抗原.方法 用卵巢癌组织建立了库容量达1.82×106pfu的cDNA表达文库,用卵巢癌患者血清进行了文库血清学分析(SEREX),筛选获了阳性抗原克隆,进一步分析了其中5个克隆与48例卵巢癌48例正常人血清的反应情况.结果 获得的67个阳性克隆中,5个克隆与已知EST序列明显无同源性,另外49个克隆与已知基因高度同源.BHLHB2等5个抗原克隆与卵巢癌患者和正常人血清反应阳性率分别为41.6%(14.6%)、29.2%(6.25%)、29.2%(12.5%)、31%(18.7%)、31%(6.2%).联合5个克隆诊断卵巢癌的敏感性为81%,特异性75%.结论 本研究发现的45个卵巢癌抗原可能作为卵巢癌诊断新的候选血清学标志物和免疫治疗潜在分子靶点.BHLHB2等5个克隆与卵巢癌患者血清的反应阳性率明显高于正常人的血清,5个克隆联合诊断卵巢癌有较好的敏感性和特异性,其相关自身抗体可作为卵巢癌诊断的血清标志物.     

SEREX肿瘤抗原基因表达蛋白的研制和血清学初步筛选

目的 :利用基因工程方法获得SEREX肿瘤抗原基因原核表达蛋白 ,为进一步血清学分析奠定基础。方法 :采用SEREX方法 ,筛选中国人卵巢癌cDNA表达文库。对获得的 3个阳性克隆基因MY OVA 2、MY OVA 7和MY OVA 13,利用基因工程的方法克隆其全长基因 ,原核表达和亲和层析获得目的蛋白 ,并采用Dot blot的方法初步检测了目的蛋白抗原在正常人和肿瘤患者中的血清学反应格局。结果 :获得了纯化的目的蛋白 ,采用点杂交对 13例正常人和 74例肿瘤患者血清的测定结果显示 ,MY OVA 13的抗体只在肿瘤组中检测到 ,在正常组中为阴性 ;MY OVA 2和MY OVA 7在两组人群的血清中自身抗体检出率均呈现阳性 ,不同的肿瘤类型的阳性率各不相同。结论 :基因工程获得的蛋白质抗原可望成为肿瘤的血清学诊断工具     

SEREX在肿瘤抗原分析中的研究进展

重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)为一种新的寻找抗原的方法,即利用患者自体血清对重组表达的cDNA克隆进行筛选,以获得相关抗原基因.这类抗原在荷瘤患者体内能诱导出多重免疫反应,且其核苷酸序列和蛋白质结构较易在分子水平确定,这一方法的运用,为发现新的肿瘤抗原开辟了一个崭新的领域,为肿瘤的免疫治疗的发展提供了一个现实的基础.     

从卵巢癌cDNA表达文库筛选肿瘤抗原基因的研究

目的：利用肿瘤患者自体血清筛选患者肿瘤cDNA表达文库（SEREX）,寻找肿瘤特异性抗原是肿瘤免疫学研究的新策略,由此方法所获B细胞抗原肽可为进一步寻找T细胞抗原肽,开展肿瘤免疫治疗和诊断提供线索。方法采用SEREX方法,筛选中国人卵巢癌cDNA表达文库,对获得的阳性克隆片段测序鉴定和进行BLAST同源性比较。采用RT－PCR,分析政党组织和肿瘤组织及肿瘤细胞株中6个新的EST片段的表达。结果,所获基因片段大多数为已知抗原基因（20／27）。根据其来源又可归类为结构基因。线粒体基因和调控基因。另外,获6个未知的EST片段。RT－PCR的结果表明,4个EST（EST87888、1750、1754和3533）片 肿瘤和正常组织中均有表达,2个EST在正常组织中未见表达,而在肿瘤组织中有表达,可能是与肿瘤相关或特异的EST片段。结论SEREX方法不失为一种有效筛选卵巢癌肿瘤抗原的新方法。所获肿瘤抗原候选基因,可进一步进行结构和功能的研究。     

从卵巢癌cDNA文库中筛选新的肿瘤标志物

采用SEREX法筛选了自行构建的中国人卵巢癌cDNA表达文库 ,得到 2 7个阳性克隆 ,其中 3个为全长cDNA。序列分析和同源性比对结果表明所获得的 2 7个克隆分属于分化抗原、细胞结构蛋白及功能未知三类。选择其中一个全长cDNAMY OVA 13(该基因编码的蛋白是MAD2 ) ,利用基因工程方法克隆、表达和纯化得到目的蛋白 ,采用点杂交方法检测了MY OVA 13目的蛋白与正常人和肿瘤患者中的血清学反应。MY OVA 13抗体只在肿瘤组中检测到 (5 / 74 ) ,在正常组中均为阴性 ;间接ELISA测定结果显示 ,MY OVA 13抗体的水平在肿瘤组中均高于正常组 ,其中肝癌和前列腺癌组与正常组相比 ,在统计学上有显著差异 ,P值分别 <0 0 1和 <0 0 5。我们的初步结果表明MY OVA 13及其抗体具有一定的肿瘤特异性 ,有可能作为肿瘤诊断的标志物     

抗人CD154单抗轻重链可变区基因克隆与序列分析

目的:克隆抗人CD154抗体轻重链可变区基因,并分析其核苷酸序列,为基因工程抗体的构建奠定基础。方法:从分泌能抑制免疫反应的抗人CD154单克隆抗体杂交瘤细胞株 7E8中提取总RNA,合成cDNA第一链后,经PCR扩增获得抗人CD154单抗轻链可变区 (VL)和重链可变区 (VH)基因,分别克隆入pUC18载体,并进行序列分析。结果:①抗体的轻链可变区基因全长为 341bp,编码113个氨基酸,归属于Ig的Vκ2基因,氨基酸序列分析结果显示轻链可变区含有明确的 4个骨架区和 3个抗原决定簇互补区,在第 2 3位和第 93位氨基酸为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两个特征性氨基酸;②抗体的重链可变区基因全长为 354bp,编码118个氨基酸,归属于小鼠IgVH基因,D、J区基因分别属于DSP2.9和JH2,氨基酸序列分析结果显示,重链可变区含有明确的 4个骨架区和 3个抗原决定簇互补区,在第 2 3和第 97位氨基酸为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两个特征性氨基酸。结论:经核苷酸序列分析证明所克隆的基因分别为抗体的轻、重链可变区基因.     

一种基于免疫印迹的高通量肿瘤相关抗原筛选和鉴定方法

目的:为了分析SEREX抗原克隆在异体食管癌患者血清中和健康对照人血清中的反应情况, 我们发展了一种基于免疫印迹的高通量肿瘤相关抗原筛选和鉴定方法.方法:采用新发展的基于免疫印迹原理的抗原克隆微阵列检测方法与传统的噬菌斑检测法对食管癌患者血清中IgG的反应情况进行了比较, 并采用两种方法分析了两个SEREX阳性克隆与40例食管癌患者血清和40例健康人血清中的IgG的阳性反应率.通过ELISA对两种方法得到的结果进行了验证.结果:两个阳性克隆在两种检测方法中均与同一例食管癌病人血清起反应, 采用抗原克隆微阵列检测方法检测p53和rps3两个克隆阳性率分别为25%和37.5%, 采用噬菌斑检测法检测p53和rps3两个克隆阳性率分别为27.5%和 37.5%;ELISA方法检测p53和rps3两个克隆阳性率分别为25.0%和31.25%.结论:本研究采用两种方法检测患者血清IgG反应的结果是一致的, 抗原克隆微阵列检测方法可以代替传统的噬菌斑筛选法.     

斑点金免疫渗滤法检测肿瘤患者血清弓形虫IgG抗体的应用研究

为建立简便、快速的斑点金免疫渗滤法 (DIGFA)检测肿瘤患者血清弓形虫IgG抗体。本文将弓形虫抗原包被于硝酸纤维素薄膜上 ,用来检测肿瘤患者血清中的弓形虫IgG抗体 ,通过胶体金———SPA直接显色 ,阳性者出现红色斑点。用该法对 2 32名肿瘤患者血清和 2 6 0名正常体检者血清进行检测 ,阳性率分别为 11. 2 1%和 1. 92 %。与IHA法对比检测 ,其结果具有良好的一致性 ,总符合率为 99. 39%。结果显示 ,斑点金免疫渗滤法检测肿瘤患者血清中弓形虫抗体简便、快速 ,适于向基层推广。     

肝癌相关抗原SMP-30羧基端基因的构建、表达及血清学分析

目的：用基因工程的方法构建、表达和纯化肝癌肿瘤相关抗原衰老标记蛋白-30(SMFL30)，检测肝癌、肝硬化及其它肿瘤病人血清中相应抗体的阳性率。方法：PCR方法扩增经SEREX技术筛选出的人肝细胞癌相关抗原SMP-30羧基末端165个氨基酸的DNA序列，构建其表达质粒，经原核表达和亲和层析纯化获得目的蛋白，经N-末端氨基酸序列测序证实为SMP-30蛋白。采用ELISA方法检测肝癌、肝硬化与其他肿瘤患者血清中抗SMP-30抗体的阳性率。结果：以63例正常人血清为对照，肝癌、慢性肝炎、肝硬化和鼻咽癌血清中SMP-30抗体阳性率分别为39．7％(23／58)、21．9％(7／32)、64．7％(11/17)和21．6％(5／23)。7例肺癌和25例胃肠疾病中无一例阳性。Western blot亦显示部分肝癌患者血清存在有SMP-30蛋白抗体。结论：SMP-30蛋白抗体检测可望作为肝癌和肝硬化等疾病的血清学诊断指标之一。     

卵巢癌相关基因的克隆

目的：筛选和克隆卵巢上皮癌相关基因。方法：用3种锚定引种和8种随机引物,共24种组合进行PCR扩增,通过DD－RTPCR分析正常卵巢上皮和卵巢上皮癌mRNA的基因表达差异,将差异片段分离出来,并回收,克隆和进行斑点杂交鉴定、DNA序列测定,并通过国际互联网张检索GenBank进行同源性分析。结果：获得30个差异表达的片段,经斑点杂交初步筛选,克隆11个差显示的阳性片段。选取其中的5个进行序列分析。结论计算机同源性分析表明,5个均为新基因片段,已收录GenBank。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白基因的筛选

目的筛选并克隆人肝细胞中与乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)相互作用的蛋白质基因。方法将重组诱饵质粒pGBKT7eAg转化酵母细胞AH109后与预转了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,提取质粒后转化大肠埃希菌并进行序列测定,进行生物信息学分析。结果配合后筛选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xα半乳糖(Xαgal)的4缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落245株。完成了101株克隆的测定,经过序列分析排除了重复同源序列后,最终确定其中有41株不同的基因,其中人类同源基因35条,其余6株为未知基因。结论成功克隆出肝细胞中的HBeAg结合蛋白基因,为进一步研究HBeAg的功能提供了新线索。     

鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因的筛选及其对转移性前列腺癌细胞生物学行为的影响

目的 筛选肿瘤转移相关新基因,探讨鞘精脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因(PAG1)转染对人前列腺癌细胞系PC-3M的高转移亚系PC-3M-1E8体外生物学行为的影响.方法 利用PC-3M高转移亚系PC-3M-1E8、低转移亚系PC-3M-284,人肺巨细胞痛细胞系(PG)高转移亚系PG-BE1和低转移亚系PG-LH7 cDNA制作4张基因芯片,筛选出PC-3M和PG高、低转移亚系共同差异表达基因.对在两个转移亚系共同表达下调的PAG1基因做进一步研究,采用即时定量PCR及Western blot验证PAG1在PC-3M细胞系中的表达.构建pcDNA3.0-PAG1真核表达载体,稳定转染PC-3M-1E8细胞.MTT比色实验及软琼脂集落形成实验检测肿瘤细胞体外增殖能力;流式细胞术检测肿瘤细胞周期及凋亡;Matrigel穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力.结果 基因芯片初步筛选出PC-3M高、低转移亚系差异表达基因共327个,上调基因123个,下调基因204个.PG高、低转移亚系差异表达基因共281个,上调基因167个,下调基因114个.PC-3M与PG高转移亚系共同表达下调基因9个、上调基因8个.即时定量PCR及Western blot证实PAG1在PC-3M高转移亚系中表达低于低转移亚系.MTT比色及软琼脂集落形成实验显示转染pcDNA3.0-PAG1组细胞增殖速度明显低于转染空载体组和未转染组(均P<0.05).细胞周期检测转染pcDNA3.0-PAG1组比转染空载体组和未转染组处于G_0～G_1期的细胞百分数明显增加(P<0.05).转染pcDNA3.0-PAG1组与转染空载体组和未转染组相比凋亡细胞百分率无显著差异(P>0.05).体外穿膜侵袭实验结果表明转染pcDNA3.0-PAG1组比转染空载体组和未转染组穿膜细胞数目明显减少,分别为(35.1±4.9)、(127.6±6.6)和(135.0±5.0)个(P<0.05).结论 利用同一母系来源的高、低转移亚系制作基因芯片可以摒除转移无关基因的干扰,筛选出差异表达的肿瘤转移相关基因.PAG1基因稳定转染能抑制人前列腺癌高转移亚系PC-3M-1E8细胞的体外增殖能力和侵袭能力,PAG1基因可能是一个潜在的肿瘤增殖、侵袭和转移的抑制基因.     

A novel gene encoding a B-box protein within the BRCA1 region at 17q21.1

A novel cDNA clone was Isolated using a polyclonal serum directedagainst partially purified ovarian carcinoma antigen CA125.The deduced peptide sequence lacked membrane protein characteristicsexpected for CA125 but encompassed a B-box/coiled coll motifpresent in many genes with transformation potential. The genewas mapped by fluorescence In situ hybridization within theminimum region known to contain the familial breast/ovariancarcinoma gene, BRCA1. YAC and cosmid clones were isolated andused to refine the location of this gene adjacent and proximalto the RNU2 locus. The exon structure of the gene was determined.Extensive SSCP and sequence analysis of over 100 tumour andnormal DNAs from familial and sporadic breast cancers and sporadicovarian cancers failed to detect mutations In the coding regionof this gene.     

从噬菌体抗体库筛选人源性抗白细胞介素8抗体

目的: 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗IL- 8单链抗体(scFV)。方法: 采用原核表达载体pRSET- IL- 8在大肠杆菌BL21(DE3)中表达IL- 8 His融合蛋白, 并通过亲和层析纯化。以该融合蛋白为固相抗原, 对噬菌体抗体库进行 3轮淘筛, 并对所获阳性克隆进行抗原结合活性测定和DNA序列测定。结果: 获得 2株特异性抗IL- 8噬菌体抗体。对其DNA序列测定结果表明, 其VH基因均属于人IgGVH3亚群, Vλ基因分别属于人VλDPL5和VλDPL2亚群。结论: 利用噬菌体抗体库技术可不经免疫制备人源性抗IL- 8抗体, 为银屑病及相关疾病的临床应用提供了条件。     

Differential gene expression in ovarian carcinoma: identification of potential biomarkers

Ovarian cancer remains the fifth leading cause of cancer death for women in the United States. In this study, the gene expression of 20 ovarian carcinomas, 17 ovarian carcinomas metastatic to the omentum, and 50 normal ovaries was determined by Gene Logic Inc. using Affymetrix GeneChip HU_95 arrays containing approximately 12,000 known genes. Differences in gene expression were quantified as fold changes in gene expression in ovarian carcinomas compared to normal ovaries and ovarian carcinoma metastases. Genes up-regulated in ovarian carcinoma tissue samples compared to more than 300 other normal and diseased tissue samples were identified. Seven genes were selected for further screening by immunohistochemistry to determine the presence and localization of the proteins. These seven genes were: the beta8 integrin subunit, bone morphogenetic protein-7, claudin-4, collagen type IX alpha2, cellular retinoic acid binding protein-1, forkhead box J1, and S100 calcium-binding protein A1. Statistical analyses showed that the beta8 integrin subunit, claudin-4, and S100A1 provided the best distinction between ovarian carcinoma and normal ovary tissues, and may serve as the best candidate tumor markers among the seven genes studied. These results suggest that further exploration into other up-regulated genes may identify novel diagnostic, therapeutic, and/or prognostic biomarkers in ovarian carcinoma.     

人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。