碱裂解法提取质粒DNA的研究

目的对碱裂解法提取质粒DNA中主要试剂的作用进行研究.方法采用不同的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ分别进行质粒DNA的提取.结果方法3得到质粒DNA的量明显偏少,方法4得到的质粒DNA含蛋白质较多.结论溶液Ⅰ对实验结果影响不大,溶液Ⅱ中的NaOH关系到所提取质粒DNA量的多少,溶液Ⅲ中的醋酸钾是蛋白质能否去除的一个重要因素.     

一种高效的质粒DNA少量提取的新方法

目的：介绍一种质粒DNA少量提取的新方法。方法：使用替代试剂,建立改良的碱裂解法进行质粒DNA提取,并用琼脂糖电泳验证所得的质粒的质量和产量。结果：琼脂糖电泳显示质粒DNA条带明亮,主要以超螺旋方式为主。结论：新方法操作简单、实用,达到分子生物学常规实验的要求。     

改良的碱裂解法提取动物细胞附加体DNA

目的 利用一种快速、简便的方法 提取动物细胞附加体DNA.方法 通过电转移的方法介导pEGFP-N1转染小鼠成纤维细胞NIH3T3和中国仓鼠卵巢癌细胞CHO等细胞系.转染后48 h,收集转染细胞.用STET缓冲液重悬细胞,加入碱裂解液裂解细胞,再用7.5 mol/L醋酸胺中和.离心收集上清,用1∶1酚/氯仿抽提2次,氯仿抽提1次,乙醇沉淀附加体DNA.TE溶解DNA.提取的DNA通过PCR和southern blot方法进行分析.结果 PCR和Southem blot结果证实利用改良的碱裂解法可以从动物细胞提取附加体DNA.结论 利用简便快速的碱裂解法可以提取哺乳动物细胞附加体DNA.     

一种简捷的质粒DNA提取及纯化方法

介绍一种快速获取高纯度质粒ＤＮＡ方法,在碱裂解法快速获取质粒ＤＮＡ粗制品的基础上,利用一种不溶解蛋白质而溶解ＤＮＡ的溶液ＴＥＳ纯化质粒ＤＮＡ,同时对本法所提取的质粒的ＤＮＡ的回收率、纯度及可能的用途进行验证。此法简易,所得样品纯度高,可以直接用于转化、酶切和基因克隆。     

几种快速细菌质粒DNA制备法

应用改进的Kado、Takahashi、Clewell和Elwell法可以制备大肠杆菌V157和pBR322的质粒。改进后的方法简单、快速、重复性好,可同时提取多株菌质粒,适用于作质粒图谱的流行病学调查分析。     

一种适合序列分析的快速重组质粒DNA制备法

应用阳离子去垢剂十六烷基三甲基溴化铵沉淀重组质粒ＤＮＡ，得到的ＤＮＡ制剂纯度高，可直接用于双股ＤＮＡ序列分析，本法省时，ＤＮＡ序列分析重复性好。     

一种改良的质粒DNA的快速提取方法

目的：建立一种确实有效的更实用的小量质粒ＤＮＡ的提取方法。方法：将一含有目的质粒的大肠杆菌扩增后采用改良后的方法提取质粒ＤＮＡ，然后采用紫外分光光度计测定含量，并且进行酶切。结果：每毫升原细菌培养物质粒ＤＮＡ的产量明显增高，且酶切效果极好。结论：改良后的质粒ＤＮＡ提取法具有速度快、收获量多、纯度高、经济又方便等优点，适合于应用与推广。     

用层析和改良的酸酚法提取和纯化质粒

本文用过Sepharose 4B除去质粒粗提物中RNA,然后用改良的酸酚法除去开环型质粒。用0.8％琼脂糖凝胶电泳、紫外荧光薄层扫描和pst Ⅰ限制性内切酶消化质粒法鉴定。此方法可制备出足够的高纯度质粒。     

碱裂解法快速提取口腔拭子DNA对CHRNA3基因多态性的研究

目的 建立一种快速的从口腔拭子中提取DNA的方法,研究其在尼古丁乙酰胆碱受体α3(CHRNA3)基因多态性分析中的应用.方法 以NaOH和乙二胺四乙酸(EDTA)配制碱裂解液,以三羟甲基氨基甲烷-EDTA(TE)为中和液,经加热裂解和中和两步提取口腔拭子DNA.以提取的DNA为模板,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析对CHRNA3基因的rs6495309进行分型.对不同基因型的样本测序验证.结果 PCR扩增和酶切的靶带清晰,无非特异性条带.酶切结果与测序结果吻合.结论 碱裂解法提取口腔拭子DNA具有快速、简便、经济、可靠的特点,可以用于CHRNA3基因多态性的分析.     

质粒构象对转染后蛋白表达时间曲线的影响

目的探讨质粒的不同构象下磷酸钙转染后对蛋白表达量时间曲线的影响。方法经过处理的pcDNA3-MADCAM-1-Fc,pcDNA3.1/Hygro（＋）-Alpha4,pcDNA3.1/Hygro（＋）-Beta7三种质粒磷酸钙转染293T细胞,第一种表达分泌到胞外的蛋白通过收集上清,ProteinA纯化,另外两种表达于细胞外膜,通过流式细胞仪检测荧光强度。结果 pcDNA3-MADCAM-1-Fc磷酸钙转染后处理组（缺口开环）比对照组表达蛋白量多（t=5.009,p=0.0376）。pcDNA3.1/Hygro（＋）-Alpha4,pcDNA3.1/Hygro（＋）-Beta7两种质粒共转后处理组荧光强度36h后略高于对照组,48h后对照组明显升高。结论质粒的不同构象下磷酸钙转染后蛋白表达量有时间依赖性。     

新型抗体偶联胶原包被质粒DNA血管支架的研制

目的研制一种以支架为基础的高效、局部定位的新型基因投递体系。方法利用双官能偶联剂N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)将支架表面涂布的胶原与抗DNA抗体化学键合,该抗体再与质粒DNA(pEGFP-C1)免疫结合,并加入阳离子脂质体提高细胞转染效率。用125I标记抗DNA抗体,检测支架表面偶联的抗体量。用32P标记pEGFP-C1检测通过上述方法结合在支架上的DNA量,同时以物理吸附组作为对照,通过细胞培养和兔体内实验验证其效果。结果实验组胶原基质携带抗体量约为对照组的15倍(P<0.005)。实验组胶原基质携带质粒DNA量显著高于对照组(P<0.01),释放时间达13d以上。细胞转染实验结果表明,抗DNA抗体连结pEGFP-C1质粒组支架胶原涂层表面有较多GFP转染阳性细胞生长,而未与支架接触的周边细胞几乎无转染。动物实验结果显示约有(2.8±0.7)%血管壁细胞被转染,新生内膜转染率最高,达7%,远隔器官未见载体扩散。结论抗体偶联胶原包被质粒DNA血管支架是一种新型高效、局部定位的基因转染体系。该体系适用于多种基因转染,且基因释放在一定条件下可控,为开发心血管内靶向基因投递体系提供了新思路。     

煮沸裂解法快速提取大鲵DNA

目的建立大鲵基因组DNA快速简便高效的提取方法。方法借鉴煮沸裂解法制备质粒DNA方法,改进后用于提取大鲵基因组DNA。结果本方法提取DNA纯度高（A260/A28介于1.7~2.1之间）,耗时短（2h）,毒性小,分子大小约为23kb,适用于PCR扩增及后续分析。结论本方法提取基因组DNA纯度高、耗时短、提取所用试剂毒性小、成本低,值得在大鲵基因组DNA提取中使用,也可为其他动物的相关研究提供参考。     

氨基甘露聚糖对质粒DNA构象的影响因素及机制研究

目的研究氨基甘露聚糖（aminoglucomannan,AGM）对质粒DNA构象影响的机制和影响因素。方法根据琼脂糖电泳条带的改变来检测阳离子化的聚糖与DNA质粒聚合后的情况并与多种糖类进行比较,改变聚糖浓度、pH、离子强度（NaCl浓度）、温度条件及质粒DNA种类,分析其对该聚合过程的影响。结果AGM和质粒DNA聚合后,电泳条带发生明显的向大分子量方向的移动变化,与AGM浓度呈剂量依赖趋势,且该作用与酶切作用不完全相同,氨基半乳糖和中药木芙蓉提取物有相似作用。pH、离子强度（NaCl浓度）、温度可影响其聚合作用。结论该AGM在适当的条件下有与DNA聚合并对质粒DNA构象产生影响的作用,该作用可能与其分子结构中的氨基有关。     

流感病毒裂解方法优化研究

目的研究流感病毒的裂解剂及裂解灭活条件。方法使用两种裂解剂TritonX100和TritonN101以不同浓度对流感病毒单价纯化液作用,通过电镜进行裂解效果观察,确定最佳裂解时间,用单向免疫扩散法检测HA含量作为评价指标。同时,观察先灭活再裂解和先裂解再灭活对病毒裂解效果的影响。结果TritonX100的裂解效果较优越,0.5%~1%TritonX100作用90min可使流感病毒裂解完全;TritonX100与甲醛作用的先后顺序对病毒的裂解灭活效果影响不大。结论0.5%~1%TritonX100可得到流感病毒的最佳效果。     

几种miniprep提取质粒DNA方法的比较与改良

目的 比较并建立一种简单的、稳定的质粒DNA提取改良方法,探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值.方法 采用琼脂糖凝胶电泳对质粒DNA提取的试剂盒法、煮沸法、碱裂解法、碱裂解结合酚氯仿法四种方法进行比较.结果 试剂盒法的电泳谱带亮度最高且无RNA条带,煮沸法、碱裂解法、碱裂解结合酚氯仿法的电泳谱带亮度依次增高.结论 试剂盒法制备DNA纯度最高,且操作简便省时.     

重组质粒DNA中插入子的核苷酸序列分析

探讨由乙酰胆碱受体抗体可变区基因与载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ构建的重组质粒中插入子进行核苷酸序列分析的条件及对结果的影响．     

肌内注射质粒DNA对蟾蜍骨骼肌收缩能力的影响

目的：应用蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本，观察肌内注射质粒DNA后不同时间对肌肉收缩功能的影响。方法：重组DNA制备pcDNA3/ANP。分别将任氏液、pcDNA3／ANP及载体pcDNA3注入对照组、pcDNA3／ANP及组pcDNA3组蟾蜍腓肠肌，间隔1h,2h,4h,8h,24h及48h后，处死动物，制备坐骨神经腓肠肌样本，利用BL－410计算机生物机能实验系统测肌肉的单收缩力和强直收缩力。结果：质粒pcDNA3及pcDNA3／ANP肌内注射后，肌肉的单收缩力及强直收缩力与对照组相比均呈现先降氏后升高的趋势（P均＜0．01）；而pcDNA3和pcDNA3／ANP2者对肌肉的作用差异无统计学意义（P＞0．05）。结论：质粒DNA注射入骨骼肌细胞之后除目的基因的表达之外，还可以影响肌肉的收缩功能。