肿瘤相关抗原线粒体蛋白12基因的RNA干扰对HeLa细胞的抑制作用

目的：探讨肿瘤相关抗原线粒体蛋白质12基因（tumor-associated antigen mitochondrial protein 12 gene,TAMP12）表达变化对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用。方法：利用计算机辅助设计并化学合成3对针对TAMP12的siRNA片段,通过脂质体法将siRNA转染于TAMP12高表达的HeLa细胞中,筛选有效的siRNA片段。以RT-PCR、实时定量PCR及流式细胞术（FCM）检测肿瘤细胞TAMP12 mRNA及蛋白表达的变化。以激光扫描共聚焦显微镜（confocal lyser scarning microscope,CLSM）观察双色荧光标记蛋白的亚细胞定位和定量表达。以3H-TdR掺入实验和FCM检测阻断TAMP12基因表达对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。结果：CLSM检测显示TAMP12蛋白主要表达在HeLa细胞线粒体中。转染siRNA-TAMP12的肿瘤细胞中TAMP12 mRNA及蛋白的表达显著降低,与对照组对比,抑制率分别为81%和87%（P〈0.01）;转染细胞的DNA合成受抑制,抑制率达42%（P〈0.01）;转染siRNA-TAMP12肿瘤细胞的凋亡率由对照细胞的8.14%上升到15.59%（P〈0.01）。结论：RNA干扰可阻断TAMP12基因的表达,从而对人宫颈癌Hela细胞产生抑制作用。     

膀胱癌相关基因的研究进展

膀胱癌在中国为最常见的泌尿系统肿瘤。膀胱癌的发生发展是一个多步骤的过程,异常基因型的长期积累导致恶性表型的出现。与膀胱癌相关的基因主要有癌基因（如H-ras、FGFR3、erbB2、CCND1、mdm2等）、抑癌基因（如INK4A/ARF、Rb、TP53、PTEN、TSC1、PTCH、DBCCR1等）及DNA错配修复基因等。本文就与膀胱癌相关的几类主要基因的研究进展作一综述。     

癌基因、抑癌基因与膀胱癌浸润转移研究进展

肿瘤是人类第二杀手.随着社会的发展,肿瘤的发病率日趋增高,泌尿系肿瘤也不例外.特别是膀胱肿瘤,在泌尿系的发病率占首位,其术后一年的复发率在70%以上,7～25%的肿瘤发生浸润.虽然采用分级、分期、体积等预测指标的临床价值已被确认,但到目前为止,尚未有特异性的指标来预测.因此,预测肿瘤局部浸润与转移能力是目前研究的重要焦点.本文拟从癌基因、抑癌基因等研究领域关于膀胱癌浸润转移能力预测的研究进展作一介绍.     

重组天花粉蛋白的原核表达、纯化及其对 宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

 目的克隆天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)的cDNA, 构建原核表达TCS的质粒,从表达菌中分离纯化重组天花粉蛋白（rTCS）后,分析rTCS和nTCS（天然天花粉蛋白）对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法RT-PCR技术从新鲜栝楼叶片中扩增TCS cDNA,测序鉴定后克隆入表达载体pET-28a(+) 并转化入BL21(DE3)细胞。IPTG诱导表达后,用金属镍螯合层析法纯化rTCS蛋白, MTT法分别检测rTCS 和nTCS处理24、48和72h对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。结果1. 成功克隆获得TCS的cDNA并构建 pET-28a (+)-TCS原核表达质粒;该cDNA的碱基序列与基因库中注册的序列99.4%同源;2.在BL21(DE3)菌中,IPTG可诱导重组TCS蛋白表达,且表达的TCS主要以包含体的形式存在。在一定的时间范围内（0～8h）;rTCS的表达水平与诱导时间正相关;3.用Ni-NTA树脂亲和层析法,从诱导表达菌中获得了高纯度的重组TCS蛋白;4. MTT法分析表明,rTCS和nTCS均对HeLa宫颈癌细胞的生长具有抑制作用。在0～100μg/ml的浓度范围内,随着药物浓度的增加及作用时间的延长,rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长抑制率逐渐增大,且各组之间差异有统计学意义（P﹤0.05）;rTCS的IC₅₀小于nTCS。结论本实验克隆了TCS的cDNA,构建了表达载体pET-28a (+)-TCS,并成功地在E.coli中原核表达和纯化出重组TCS蛋白,发现纯化的rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长都有明显抑制作用,并且rTCS的细胞毒性小于nTCS。     

宫颈癌相关基因研究进展

宫颈癌的发生是多基因、多步骤的复杂过程,涉及抑癌基因失活、缺失和癌基因过量表达或功能异常。全文就宫颈癌相关抑癌基因和癌基因研究进展作一介绍。     

肿瘤转移相关基因1对宫颈癌HeLa细胞放疗敏感性的作用及机制

目的探讨肿瘤转移相关基因1(MTA1)对宫颈癌HeLa细胞放疗敏感性的影响及其分子机制。方法对MTA1敲降的HeLa细胞及对照HeLa细胞进行转录测序, 获得差异表达基因并对其进行基因集富集分析和GO聚类分析。采用流式细胞术检测MTA1过表达的HeLa细胞和对照HeLa细胞在10 Gy X射线照射前后的细胞凋亡情况, 克隆形成实验和实时无标记动态细胞分析(RTCA)技术检测细胞的增殖情况。选取差异表达基因编码的蛋白构建蛋白相互作用网络, 采用免疫荧光实验检测γ-H2AX的表达情况, 采用Western blot法检测γ-H2AX、β-CHK2、PARP和cleaved caspase 3的表达水平。结果转录组测序分析获得差异表达基因649个, 其中402个基因在MTA1敲降的HeLa细胞中表达上调, 247个基因表达下调。与MTA1相关的差异表达基因富集于DNA损伤修复过程, GO聚类分析提示, DNA损伤修复富集于第2位。流式细胞术检测结果显示, 10 Gy X射线照射后, MTA1过表达的HeLa细胞凋亡率[(15.67±0.81)%]低于对照HeLa细胞[(40.27±2.73)...     

子宫颈癌错配修复基因产物与p53表达

[目的]探讨子宫颈癌中错配修复基因表达产物对抑癌基因p53表达的影响.[方法]30例子宫颈炎标本及70例子宫颈鳞癌标本采用免疫组织化学S-P法检测hMLH1、hMSH2与p53的表达.[结果]子宫颈炎与子宫颈鳞癌组织hMLH1阳性表达率分别为60.0%（18/30）与55.7%（39/70）;hMSH2阳性表达率分别为23.3%（7/30）与57.1%（40/70）;p53表达率分别为33.3%（10/30）与61.4%（43/70）.p53表达阳性和阴性组的子宫颈癌hMLH1阳性表达率分别为46.5%（20/43）与40.7%（11/27）,两者无相关性（rs=0.057,P=0.645）;hMSH2阳性表达率分别为41.9%（18/43）与18.5%（5/27）,两者存在显著相关性（rs=0.242,P=0.044）.[结论]子宫颈炎向宫颈癌的发展中碱基错配逐渐增多,hMSH2蛋白的高表达与p53的低表达对宫颈癌的预后具有一定的预测作用.     

紫杉醇对宫颈癌HeLa细胞增殖和荷瘤裸小鼠肿瘤生长抑制作用

目的研究紫杉醇对人宫颈癌HeLa细胞增殖和对荷瘤裸小鼠肿瘤生长的抑制作用。方法采用噻唑蓝(MTT)法观察紫杉醇对HeLa细胞增殖的抑制作用;并在裸小鼠人宫颈癌模型上观察紫杉醇对荷瘤裸小鼠肿瘤生长的抑制作用。结果紫杉醇对HeLa细胞具有明显的抑制作用并有剂量时间依赖关系;荷瘤裸小鼠动物实验表明,紫杉醇对裸小鼠的肿瘤生长也具有明显的抑制作用,治疗组Ⅰ和治疗组Ⅱ的抑瘤率为分别26.38%和39.04%。结论紫杉醇对HeLa细胞的增殖和荷瘤裸小鼠肿瘤的生长具有明显的抑制作用。     

自噬基因Beclin1对宫颈癌HeLa细胞生长影响的体内外研究

目的 研究自噬基因Beclin1在宫颈癌细胞株HeLa中过表达对HeLa细胞体内外生长的影响.方法 构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Beclin1,转染HeLa细胞[pcDNA3.1(+)-Beclin1组],同时设空载体转染组[pcDNA3.1(+)组]和空白对照组.采用荧光定量PCR和Western blot法检测3组HeLa细胞中Beclin1 mRNA和蛋白的表达变化,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测3组HeLa细胞生长的变化,采用流式细胞术检测3组HeLa细胞的凋亡情况,采用单丹磺酰尸胺染色检测3组HeLa细胞的自噬情况.将3组HeLa细胞分别接种于裸鼠皮下,观察体内成瘤性和生长情况.结果 pcDNA3.1(+)-Beclin1组、pcDNA3.1(+)组和空白对照组HeLa细胞中Beclin1 mRNA的表达水平分别为994.718 ±468.764、0.570±0.121和0.736±0.251.pcDNA3.1 (+ )-Beclin1组HeLa细胞中Beclin1 mRNA的表达水平较pcDNA3.1(+)组和空白对照组明显增高(P＜0.05),而pcDNA3.1(+)组与空白对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05);3组HeLa细胞中Beclin1蛋白的表达情况与mRNA相似.pcDNA3.1(+)-Beclin1组的自噬细胞率为10.9％,明显高于空白对照组和pcDNA3.1(+)组(分别为2.5％和3.1％,P＜0.05).pcDNA3.1(+)-Beclin1组HeLa细胞的凋亡率为(28.2±2.3)％,明显高于pcDNA3.1(+)组和空白对照组[分别为(14.6±4.6)％和(11.2±3.0)％,P＜0.05].Beclin1在HeLa细胞中过表达可抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.7％;并可使HeLa细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积和重量明显小于pcDNA3.1 (+)组和HeLa组(P＜0.05),抑瘤率为52.2％.结论 自噬基因Beclin1过表达可抑制HeLa细胞在体内外的增殖,促进细胞的自噬与凋亡,为宫颈癌基因治疗提供了新的选择途径.     

抑癌基因PTEN对肝癌细胞增殖的抑制及作用机制

目的探讨抑癌基因PTEN对肝癌细胞增殖和细胞周期的调控作用。方法构建野生型PTEN基因和突变型PTEN基因的真核表达载体pEGFP—WT—PTEN和pEGFP—PTEN;G129R。采用脂质体介导的基因转染法,分别将上述载体转染不表达PTEN蛋白的人肝细胞肝癌细胞系HHCC,经G418筛选,获得稳定表达PTEN蛋白的细胞克隆。以流式细胞仪测定细胞周期,以Western blot法分析稳定表达PTEN蛋白的肝癌细胞内源性的磷酸化AKT表达水平,同时与未进行基因转染和转染空载体pEGFP-C1的HHCC细胞进行对照。结果稳定表达野生型PTEN蛋白的肝癌细胞,细胞生长受到明显抑制,与转染空载体的HHCC细胞比较,G1期细胞比例显著增高,G2期和S期细胞比例显著降低,且差异有统计学意义（P〈0．05）;而转染突变型PTEN基因的HHCC细胞,与转染空载体的HHCC细胞比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。与转染空载体的HHCC细胞比较,稳定表达野生型PTEN蛋白的HHCC细胞,其内源性磷酸化AKT水平明显减低;而转染突变型PTEN基因的HHCC细胞,其AKT水平无明显变化。结论野生型PTEN基因对肝癌细胞周期具有调控作用,而突变型PTEN基因丧失对肝癌细胞周期的调控作用;野生型PTEN基因可能通过降低AKT的活化而实现对肝癌细胞周期的调控。     

斑点型POZ蛋白对膀胱癌T24细胞增殖和迁移能力的影响

目的 探讨RNA干扰斑点型POZ蛋白（SPOP）基因表达对人膀胱癌T24细胞生物学行为的影响。 方法 采用阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将靶向沉默SPOP基因的小干扰RNA（siRNA）序列siRNA1和siRNA2分别转染至T24细胞株（siRNA1组和siRNA2组）,设转染随机序列的T24细胞为对照组,采用实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blotting分别检测各组转染48 h后的SPOP mRNA及蛋白水平,细胞增殖活性检测试剂盒（CCK-8）检测细胞体外增殖活力,Transwell迁移试验及划痕试验观察各组的迁移能力。 结果 对照组、siRNA1组和siRNA2组的SPOP mRNA相对表达量为1.012±0.025、0.281±0.023和0.274±0.053,蛋白相对表达量为0.712±0.153、0.358±0.073和0.317±0.084,siRNA1组和siRNA2组的SPOP mRNA和蛋白水平均低于对照组（P＜0.05）,siRNA1组和siRNA2组SPOP mRNA和蛋白水平的差异无统计学差异（P＞0.05）;与对照组比较,siRNA1组和siRNA2组的增殖活性升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,且siRNA1组和siRNA2组的增殖率随转染时间的延长而增加（P＜0.05）;Transwell迁移试验结果显示siRNA1组和siRNA2组的穿膜细胞数分别为（128.6±9.3）个和（134.5±8.6）个,均高于对照组的（92.5±8.4）个,差异有统计学意义（P＜0.05）;划痕试验结果显示siRNA1组和siRNA2组的划痕愈合率为（89.1±4.5）%和（93.7±5.1）%,均高于对照组的（32.6±2.8）%,差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论SPOP与膀胱癌的恶性行为有关,可能发挥抑癌基因的作用,如抑制增殖及迁移。     

RNA干扰YAP基因对人膀胱癌T24细胞株增殖和迁移能力的影响

背景与目的：膀胱尿路上皮癌是泌尿统系最常见的肿瘤,术后易复发及转移,Yes相关蛋白(Yes associated protein,YAP)基因与膀胱癌关系密切,本研究探讨通过RNA干扰技术沉默膀胱癌T24细胞中YAP基因的表达,观察YAP基因沉默后对人膀胱癌T24细胞增殖、迁移能力的影响。方法：用阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将靶向沉默YAP基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列转染至膀胱癌T24细胞株中,采用实时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real time-polymerase chain reaction,qRT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)检测转染后T24细胞中YAP基因及蛋白的表达水平,细胞增殖活性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)、Transwell迁移试验以及划痕实验观察siRNA在体外对人膀胱癌T24细胞增殖、迁移能力的影响。结果：转染siRNA后,YAP RNA和蛋白表达量同空白对照以及阴性对照组相比被显著抑制(RNA：F=93.91,P<0.000 1;蛋白：F=4.62,P<0.05),CCK-8增殖活性实验结果显示,RNAi干扰YAP表达可以显著抑制膀胱癌T24细胞的增殖活性(12 h：F=6.00,P=0.037;24 h：F=41.72,P=0.000 3;36 h：F=462.8,P<0.000 1;48 h：F=236.6,P<0.000 1;72 h：F=140.5,P<0.000 1),通过Transwell实验和划痕试验发现,RNAi干扰YAP表达显著抑制膀胱癌T24细胞的迁移能力(Transwell：F=43.55,P<0.05;划痕：F=43.55,P<0.05)。结论：YAP基因是膀胱肿瘤增殖及迁移的重要调控因子。     

Chmp1A acts as a tumor suppressor gene that inhibits proliferation of renal cell carcinoma

Renal cell carcinoma (RCC) is a highly malignant and often fatal disease of the kidney. Chmp1A is a member of the Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT-III) family, and plays a role in the cytoplasm in sorting proteins to the multivesicular body (MVB). Chmp1A functions as a tumor suppressor gene and has been reported in pancreatic tumor cells. Here, we examined the expression level of Chmp1A in human RCC tissues and renal tumor cells by real-time quantitative RT-PCR and western blot. We found that the expression level of Chmp1A is significantly lower in RCC tissues and renal tumor cells compared with adjacent non-tumorous tissues and normal renal cells. Additionally, inhibition of Chmp1A expression by shRNA induced tumor formation in normal renal cells. However, inhibition of Chmp1A did not significantly affect tumor cell proliferation in vitro and tumor progression in vivo. Interestingly, overexpression of Chmp1A using a eukaryotic plasmid inhibited the proliferation of renal tumor cells in vitro and the growth of renal tumor in vivo. Thus, our results demonstrate that Chmp1A functions as a tumor suppressor gene in renal cells and may be a useful target for treatment of RCC.     

CHARACTER OF TUMOR ASSOCIATED PROTEIN RECOGNIZED BY MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST YUNNAN GEJIU LUNG CANCER

The detection and characterization of the cancer antigens by the monoclonal antibodies as the immunoprobes has recently been carried out well [1,2,3]. In this study, A novel protein molecule ( named protein N35 temporarily ) of lung cancer cells had been identified and characterized by immumnohistochemistry, immunoprecipitation, immunoblotting, differential centrifugation and subcellular assay, N-glycanase digestion and mitotic cell immunoflourescence with the monoclonal antibody N-35 which w…     

siRNA沉默YAP1对宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭的影响

目的:用小干扰RNA(siRNA)沉默宫颈癌Hela细胞中YAP1基因的表达,观察YAP1表达降低对细胞增殖和侵袭能力的影响,初步探讨YAP1在宫颈癌中的作用。方法:qRT-PCR和Western blot方法检测宫颈癌Hela细胞及正常宫颈上皮细胞H8中YAP1的表达,siRNA YAP1转染Hela细胞沉默YAP1表达,并以转染control siRNA的细胞作为对照,转染48h后,分别用qRT-PCR和Western blot方法检测沉默效果。用MTT法检测沉默后细胞增殖情况。Transwell 检测细胞侵袭能力。结果:YAP1在宫颈癌细胞中高表达。siRNA能够有效沉默Hela细胞中YAP1的mRNA 及蛋白的表达。沉默YAP1表达能够明显抑制Hela细胞的增殖及侵袭能力。结论:YAP1蛋白在宫颈癌细胞中高表达并具有促进细胞增殖及侵袭的能力。     

野生型PTEN基因高表达对膀胱移行细胞癌EJ细胞的抑癌作用

目的 探讨外源性野生型人酪氨酸磷酸酶（PTEN）基因的高表达对膀胱移行细胞癌EJ细胞的抑癌作用。方法 利用携带人PTEN基因的野生型、磷酸酶域突变型质粒体外分别转染人膀胱移行细胞癌EJ细胞。Western blot检测目的基因PTEN的表达,观察细胞形态变化及超微结构变化;MTIO法检测细胞增殖率及转染细胞对吡柔比星（THP）和丝裂霉素（MMC）的敏感性;Western blot法检测bcl-2蛋白的表达。以空载质粒作为对照。结果 质粒转染后,EJ细胞的PTEN蛋白表达上升75．0％。转染野生型质粒后,EJ细胞异型性低,出现典型凋亡小体,细胞增殖率下降40．1％,bcl-2蛋白表达被下调,并提高了对THP和MMC的敏感性。而转染突变型质粒的EJ细胞则无此作用。结论 野生型PTEN基因在体外对膀胱移行细胞癌EJ细胞增殖有明显抑制作用,诱导细胞凋亡,磷酸酶域突变型PTEN基因无此作用。野生型PTEN的抑癌作用可能与其对bcl-2蛋白表达的下调有关。     

槲皮素抑制X线照射后宫颈癌Hela细胞侵袭性的作用

目的:研究放射线及槲皮素对人宫颈癌Hela细胞侵袭性变化的影响,并初步探讨VEGF、MMP-9表达对其影响。方法:MTT法检测不同浓度的槲皮素对宫颈癌Hela细胞增殖的影响;Transwell体外侵袭实验分别观察放射线及不同浓度槲皮素作用后24h细胞的侵袭能力的改变。Western blot法检测不同浓度槲皮素、放射线单独及联合应用后Hela细胞中VEGF、MMP-9蛋白的表达。结果:槲皮素对Hela细胞具有增殖抑制作用,并呈浓度和时间依赖性（P<0.05）,24小时的IC50值约为120μmol/L。与空白组比较,X线照射24h后细胞侵袭能力增加（P<0.01）,槲皮素对HeLa细胞的侵袭能力具有抑制作用（P<0.01）,槲皮素与X线共同处理细胞后,仍具有明显的抑制侵袭能力（P<0.01）,组间差异具有统计学意义。X线单独作用后VEGF、MMP-9蛋白表达在一定时间内有增加的趋势（P>0.05）,槲皮素、以及联合X线组VEGF、MMP-9蛋白表达降低（P<0.05）。结论:X线照射后宫颈癌Hela癌细胞侵袭潜能短暂增强;槲皮素能抑制X线照射后宫颈癌细胞的侵袭能力。机制可能与槲皮素能下调VEGF、MMP-9的表达有关。     

棕榈酸在体外通过促进凋亡作用抑制宫颈癌Hela细胞增殖的研究

目的 探讨体外棕榈酸(Palmitic acid,PA)抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移、侵袭和诱导凋亡作用及其部分机制。方法 体外培养的宫颈癌HeLa细胞分为对照组(不加药)、PA处理组(分别加入PA 25、50、100μg/mL处理),CCK-8法检测各组HeLa细胞增殖情况,Transwell试验检测细胞的迁移和侵袭能力,qRT-PCR检测不同浓度PA处理后细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax及Cleaved-caspase-3的表达,PA处理后的HaLa细胞用膜联蛋白V/碘化丙啶双标,随后用流式细胞仪检测其凋亡情况。结果 与对照组比较,PA处理HeLa细胞后增殖抑制率逐渐增高(P＜0.05);PA处理后,HaLa细胞的迁移与侵袭能力显著下降(P＜0.05);同时,PA处理HeLa细胞后,随着PA浓度增高,Bcl-2基因表达逐渐降低,而Bax和Cleaved-caspase-3基因表达逐渐增强与流式细胞仪检测结果相符合,HeLa细胞的凋亡率随着PA浓度增高逐渐增高(P＜0.05)。结论 PA体外可抑制HeLa细胞增殖,减少其迁移与侵袭水平,并诱导其凋亡,其机制可能与调节HeLa细胞Bcl-2家族有关。