重症肌无力单链抗体基因的制备

[目的 ]构建抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体 .[方法 ]应用多聚酶链反应从抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区抗原结合片段扩增重链和轻链可变区基因 ,并克隆到载体噬粒 pHEN2 .将含有单链抗体基因的重组噬粒转化大肠杆菌DH5α ,分离提纯重组噬粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认单链抗体基因的正确性 .[结果 ]电泳检查发现了大小分别为 3 78bp ,3 3 9bp和 762bp的重链可变区、轻链可变区和单链抗体基因 ,且位置正确 .[结论 ]已成功地构建了抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体基因     

抗乙酰胆碱受体单链抗体酵母表达的特性鉴定

[目的]探讨毕赤酵母GS115表达的重症肌无力单链抗体A7的一般特性及与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的结合特异性.[方法]采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹试验,检测已经转化至毕赤酵母GS115中的重症肌无力重组载体pPIC9K-ScFvA7表达的单链抗体A7蛋白的分子质量;应用间接免疫荧光技术确定表达蛋白与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的亲和性.[结果]毕赤酵母GS115培养上清液中有目的蛋白的表达,分子质量约为44ku;间接免疫荧光试验显示,在大鼠肋间肌细胞间有荧光出现.[结论]单链抗体A7可以在毕赤酵母中成功地表达,并且可与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体结合.     

重症肌无力乙酰胆碱受体抗体的研究

重症肌无力 (ｍｙｓｔｈｅｎｉａｇｒａｖｉｓ)是累及神经肌肉接头处乙酰胆碱受体抗体 (ａｃａｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｔｉｂｏｄｙ ,ＡｃｈＲａｂ)的自身免疫性疾病[1] 。近年来发现一系列的非ＡｃｈＲａｂ骨骼肌抗体[2 ] ,Ｋｙａｎｏｄｉｎｅ受体抗体及补体Ｃ9等均与重症肌无力的发病有关[3] 。其发病与患者体内异常增高的ＡｃｈＲａｂ造成骨骼肌终板上ＡｃｈＲａｂ数目减少及功能障碍有关。目前常用检测方法主要有放射免疫法 (ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙ ,ＲＩＡ )和酶联免疫吸附法 (ｅｎｚｙｍｅ…     

抗乙酰胆碱受体单链抗体在大肠杆菌中的表达

[目的 ]使构建的抗人乙酰胆碱受体单链抗体基因在大肠杆菌中表达 .[方法 ]将含有单链抗体基因的载体 pHEN2 (含有 pelB引导肽和c myc)转化大肠杆菌HB 2 15 1,在细菌外周质中表达单链抗体 .应用鼠抗c myc单链抗体的斑点杂交试验检查细菌外周质裂解物中单链抗体的表达 .[结果 ]单链抗体表达在细菌外周质中 ,培养液上清及对照大肠杆菌外周质和培养液上清均未发现单链抗体 .[结论 ]已成功地在大肠杆菌中表达了抗人乙酰胆碱受体单链抗体 .     

电鳐乙酰胆碱受体诱导转基因小鼠重症肌无力的机制

[目的]探讨电鳐乙酰胆碱受体诱导人免疫球蛋白转基因小鼠实验性自身免疫性重症肌无力的机制.[方法]将电鳐电器官分离并纯化的乙酰胆碱受体作为免疫原,免疫人免疫球蛋白转基因小鼠,以放射免疫方法测定小鼠血清中抗乙酰胆碱受体抗体滴度,以免疫荧光技术观察小鼠骨骼肌中抗乙酰胆碱受体抗体的结合性.[结果]小鼠血清中的抗乙酰胆碱受体抗体滴度为155~539 pmol,小鼠肌肉中具有人抗乙酰胆碱受体抗体.[结论]电鳐乙酰胆碱受体刺激人免疫球蛋白转基因小鼠产生的人抗乙酰胆碱受体抗体,可与肌肉组织中的乙酰胆碱受体结合,导致肌肉收缩无力,可诱导重症肌无力.     

抗乙酰胆碱受体单链抗体的纯化

[目的 ]纯化抗乙酰胆碱受体单链抗体 ,为测定其特异性准备材料 .[方法 ]将大肠杆菌表达的单链抗体 (含有 6xHis及c myc标记肽 )经Ni nitrilotriaceticacid(Ni NTA)纯化 ,以十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳和应用鼠抗c myc单克隆抗体的免疫印迹试验鉴定纯化产物 ,并根据吸光度值测定表达产物的含量 .[结果 ]在纯化产物中发现大小约为 36KD的单链抗体 ,杂质蛋白带较少 ,表达量约为30 μg/L .[结论 ]用Ni NTA纯化带有 6xHis标记肽的单链抗体的方法简单、纯度高 ,以大肠杆菌表达抗乙酰胆碱受体单链抗体时产量低 .     

重组乙酰胆碱受体α亚单位-BirA识别多肽序列基因的构建与表达

[目的]构建重组乙酰胆碱受体亚单位-BirA识别多肽序列基因(pcDNA 3.1-AChR-αBirA),并对其进行真核基因表达.[方法]设计引物生物素蛋白连接酶(BirA)识别多肽序列基因,将载体pcDNA3.1-AChR-αBirA识别多肽序列基因连接,并用EcoRⅤ单酶切检查BirA识别多肽序列基因插入的正确性,并测定序列进行验证.将构建成功的载体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上进行表达,经激光扫描共聚焦显微镜验证其产物.[结果]电泳检查可见大小为63 bp的条带,经测定序列验证了插入的基因序列为BirA识别多肽序列基因;转染后经激光扫描共聚焦显微镜观察到CHO细胞膜上的绿色荧光.[结论]成功构建了AChR-αBirA识别多肽序列基因重组载体,并可在CHO细胞中较好地表达.     

抗人乙酰胆碱受体单链抗体融合人血清白蛋白基因的构建

[目的]提高抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体(ScFv)的稳定性，构建单链抗体-人血清白蛋白(HSA)融合基因。[方法]应用聚合酶链反应扩增人血清白蛋白基因，并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体单链抗体(ScFv637)的载体pHEN2(pHEN2-ScFv637)上。将重组质粒pHEN2-ScFv637-HSA转化至大肠杆菌(E．coli DH5a)中，分离提纯重组质粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认融合基因的正确性。[结果]电泳检查发现了大小分别为1770bp和7054bp的人血清白蛋白基因和融合基因。且发现位置正确。[结论]成功地构建了单链抗体scFv637与人血清白蛋白融合基因。     

重症肌无力单链抗体A7基因在毕赤酵母中的表达

[目的]将抗乙酰胆碱受体单链抗体(ScFv)A 7基因转化至毕赤酵母GS 115,筛选阳性转化子并诱导蛋白表达,制备单链抗体A 7蛋白.[方法]将构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组真核表达载体pPIC 9 K-ScFv A 7经SalⅠ酶切线性化后,利用电转化方法转化受体毕赤酵母菌GS 115,以甲醇诱导蛋白表达,应用鼠抗c-myc单克隆抗体进行斑点杂交试验,检查所表达的单链抗体A 7蛋白.[结果]在酵母菌的培养上清液中发现单链抗体A 7蛋白的表达,而阴性对照菌中未见表达产物.[结论]抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7蛋白已成功地在真核表达系统中表达.     

单链抗体A7基因的原核细胞表达

[目的]制备抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因,为基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]构建含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组原核表达载体pHEN 2-单链抗体A 7,将其转化至大肠杆菌HB 2151中,以异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂,在外周质中进行表达,以硼酸钠裂解细菌细胞壁,制备含有单链抗体的裂解液,应用鼠抗c-myc单克隆抗体的斑点杂交试验检测表达的单链抗体A 7基因.[结果]在大肠杆菌的外周质中可见单链抗体A 7基因表达,培养上清液中未见单链抗体A 7基因表达.[结论]抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因在原核细胞成功表达.     

重症肌无力乙酰胆碱受体抗体与猴神经烟碱型乙酰胆碱受体之间的免疫结合反应

目的：探讨重症肌力（myasthenia gravis,MG)患的乙酰胆碱受体抗体（AChRab)与猴中枢神经烟碱型乙酰胆碱受体（神经-nAChR)之间的免疫结合反应。方法：从AChRab阳性的MG患血中提取纯化AChRab,再用免疫组化法探讨AChRab与猴CNS神经－nAChR之间的免疫结合反应。结果：首次表明AChRab可与猴CNS神经－nAChR之间免疫交叉结合,其阳性免疫结合反应广泛分布于猴CNS许多部位,如大脑皮层（Ⅱ,Ⅲ,Ⅴ层）,海马皮层,基底节,下丘脑,脑干运动核团,脑干网状结构,脊髓前角运动神经元,小脑深部核团和皮层哺齿野细胞等呈强或较强阳性反应。结论：MG患AChRab可与猴CNS神经－nAChR交叉结合。     

抗乙酰胆碱受体单链抗体与人血清白蛋白融合基因真核表达载体的构建

[目的]构建真核表达体系,提高抗人乙酰胆碱受体单链抗体(ScFv 637)与人血清白蛋白(HSA)融合基因(ScFv 637-HSA)的蛋白表达质量.[方法]扩增ScFv 637-HSA融合基因,经酶切处理后,克隆至真核载体pPIC9 K,线性化处理后,电穿孔入毕赤酵母GS 115.[结果]经电泳观察可见相对分子质量为2.6 kbp的融合蛋白ScFv 637-HSA基因和真核表达载体pPIC9 K基因片段.[结论]ScFv637-HSA基因已准确地整合到毕赤酵母染色体基因组中.     

单链抗体A7基因真核表达载体的构建

[目的]构建抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的真核表达载体,为单链抗体A 7基因的真核表达及基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]应用PCR技术,从已构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组原核表达载体pHEN 2单链抗体A 7上扩增单链抗体A 7基因并纯化,将纯化后的PCR产物经EcoRⅠ和AvrⅡ双酶切后,用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化,再与经同样酶切并纯化的真核表达载体pPIC 9 K连接,将其产物转化至大肠杆菌DH 5α后扩增,再用AvrⅡ和EcoRⅠ酶切和测定序列检查ScFv A 7基因插入的准确性.[结果]构建pPIC 9 K-ScFv A 7重组载体,经序列测定检查核苷酸序列正确,且ScFv A 7基因准确地克隆至载体开放读码框架内.[结论]成功地构建了抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的真核表达载体.