快慢转法及不同滤膜和显色检测法在Western blotting中的应用分析

目的 探讨快、慢转法及不同滤膜和显色检测法在Western blotting中的应用及各实验环节分析.方法 采用MDA-MB-231细胞制备细胞蛋白,应用不同印迹膜[硝酸纤维素膜、聚偏乙烯二氟(PVDF)膜和阳离子尼龙膜]分别采用快转法和慢转法进行增强化学发光法(ECL)和DAB化学显色法检测,并对Western blotting的各实验环节进行了分析.结果 (1)在快、慢转法中硝纤膜的蛋白预染marker条带略强于尼龙膜,而尼龙膜又略强于PVDF膜;PVDF膜和尼龙膜的正反面易于混淆,而硝纤膜的正反面不易混淆.(2)在快、慢转法中,PVDF膜的DAB化学显色法图像略强于尼龙膜和硝纤膜,而尼龙膜和硝纤膜无明显差异;与慢转法相比,快转的硝纤膜和尼龙膜中的蛋白条带略呈波浪状.(3)在慢转法中三种膜化学发光法的图像无明显背景,但在快转法中尼龙膜的背景较明显,而硝纤膜和PVDF膜亦无明显背景.结论 应根据实验需要选用不同的印迹膜;慢转法通常优于快转法,增强化学发光法优于DAB化学显色法;增强化学发光法特异胜强、灵敏度高,是分析蛋白质表达较为理想的方法.     

可用于中医药系统研究的药物高内涵筛选分析

药物高内涵筛选分析是系统生物学时代的一项领先技术,具有活体、动态、多指标的综合特点,能够全面反映细胞组学的整体变化,非常适用于中药的复杂成分组成和多靶点作用途径的研究。因此,积极将该技术应用于中医药研究,对发现中药的有效组分和毒性成分,阐明中药的复杂作用机制,促进中医药理论的发展均有重要意义。     

集中度及圆形分布法在传染病季节分布分析中的应用

目的为传染病季节分布的研究提供科学的统计学方法。方法运用集中度法及圆形分布法对闽侯县2001～2008年6种常见传染病的季节分布特征进行分析。结果麻疹有一定季节性;而痢疾、伤寒、甲肝、肺结核、乙肝为全年散在发病。结论圆形分布法可计算出疾病的发病高峰时点和高峰期。而集中度却不能;集中度能较真实地反映疾病发病的季节性分布。     

高迁移率族蛋白1在子宫肌瘤中的表达及临床意义

目的 探讨高迁移率族蛋白I(High mobility group box1,HMGB1)在子宫肌瘤中的表达及临床意义.方法 应用实时荧光定量PCR技术、Western blotting法及免疫组织化学SP法检测子宫肌瘤和相应肌瘤旁组织HMGB1 mRNA及该蛋白的表达情况.结果 HMGB1 mRNA在子宫肌瘤组中表达量高于相应肌瘤旁肌层组,差异有统计学意义(2-△△0α=12.38＞2);子宫肌瘤组HMGB1蛋白水平及阳性表达率均比对照组高,差异有统计学意义(P＜0.05),且在肌瘤组中其阳性反应主要定位在细胞核,细胞质未见或仅见轻微的阳性表达.结论 HMGB1及HMGB1 mRNA在子宫肌瘤中表达上调,该蛋白可能与子宫肌瘤的发生、发展存在密切关系;HMGB1阳性反应主要定位在细胞核,HMGB1可能通过核内作用促进子宫肌瘤细胞增殖.     

圆形分布法在流行病学时间分布分析中的应用

目的探讨疾病季节高峰时期,为制定防范措施提供科学预报。方法以兴山县1976-2000年间的流脑、乙脑、疟疾的发病情况为例,应用圆形分布法分析,探讨疾病的时间分布特点。结果兴山县1976-2000年间的流脑、乙脑、疟疾的发病存在高峰时点和高峰时期,高峰时点分别为3月17日、8月2日和8月20日,高峰时期分别是上一年的12月28日~下一年的6月5日、2月29日~9月24日和3月22日~12月14日。结论圆形分布法适用可以应用于流行病学分析中的时间分布,其结果可以为决策部门制定预防措施提供可靠的科学依据情况。     

气道高反应性疾病的病因分布及气道反应特征比较

目的比较分析气道高反应性疾病的病因分布。方法收集以咳嗽、喘息为主要症状,乙酰甲胆碱气道激发试验阳性的患者464例,根据疾病诊断,分为哮喘组、慢性阻塞性肺病（COPD）组、支气管扩张组、急性上呼吸道感染组、心力衰竭组、支气管内膜结核组和肺癌组。对其气道反应性进行比较分析。结果哮喘组吸入乙酰甲胆碱累积量为（1.62±0.57）mol,与COPD组（4.24±1.24）mol、支气管扩张组（3.46±1.42）mol、急性上呼吸道感染组（7.2±1.83）mol、心力衰竭组（5.38±1.26）mol、支气管内膜结核组（4.31±1.21）mol、支气管肺癌组（5.71±1.64）mol比较差异有统计学意义（〈0.01）。结论支气管哮喘是导致气道高反应性最常见的疾病,而气道反应性增高并不一定是哮喘,应对有气道反应性增高的患者进行相应的检查、治疗,以免误诊。     

分支定界法在计算机辅助质谱解析蛋白质序列分析中的应用

引进运筹学中的分支定界法用于解析蛋白质及多肽的质谱图,考查了碎片离子质量数、质谱仪的分辨率与可行解数的关系：质量数越小,质谱分辨率越高,可行解数越少,获得的结果也比较确定;反之,则结果的可靠性越小。在此基础上,实际解析了一多肽质谱图,获得了较为满意的结果。运用本法解析有关蛋白质及多肽的质谱图,具有快速、准确、简便的特点,它为生化分析工作者检测蛋白质及多肽的氨基酸序列提供了一条比较可行的途径。     

蛋白质芯片及其在蛋白质组研究中的应用

对在蛋白质组研究中发挥巨大作用的新技术蛋白质芯片的基本组成、特点、使用方法及应用等方面做了简要介绍,并展望了今后的发展前景。由于蛋白质芯片的超微量、全自动化的高通量筛选功能的优点,必将成为蛋白质组学研究的强有力的工具。     

圆形分布法在发旋研究中的应用

应用圆形分布法对贵州省南部地区1212名毛南族、布依族、苗族和汉族发旋角度资料进行统计分析,结果表明发旋集中分布在头顶后正中线附近(r=0.6577,P<0.001),且分布特征无民族、性别和旋向等差别(P>0.05)。     

C端谷氨酰胺富含结构域调节TIAR的细胞内定位

目的阐明核糖核酸（RNA）结合蛋白T细胞内抗原相关蛋白（TIAR）的结构域与细胞内定位之间的关系。方法细胞免疫荧光检测SMCC-7721细胞内源性TIAR的细胞内分布，亚克隆构建TIAR全长及缺失体的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达质粒，脂质体法瞬时转染SMCC-7721细胞，在荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞内的荧光分布情况，免疫印迹检测融合蛋白的表达情况。结果细胞免疫荧光结果显示在SMCC-7721细胞中TIAR主要浓集于细胞核，细胞浆也有少量弥散分布。酶切鉴定及测序结果显示TIAR全长及缺失体的pEGFP-C3重组表达质粒构建成功。EGFP-TIAR^FL（TIAR全长）主要分布于细胞核；而EGFP-TIAR^RRM123（TIAR的N端3个RNA结合结构域）弥散分布于整个细胞；EGFP-TIAR^Q-rich（TIAR的C端谷胺酰胺富含结构域）浓集于细胞核，但浓集程度要比TIAR^FL-EGFP弱。免疫印迹证实过表达的TIAR全长及缺失体的EGFP融合蛋白分子量大小符合预期。结论我们的结果提示C端谷氨酸富含结构域参与TIAR细胞内定位的调节。     

UGRP1蛋白的表达、纯化、抗体制备及亚细胞定位

目的子宫球蛋白相关蛋白1(UGRP1)是一种功能未知的分泌蛋白。通过表达、纯化蛋白、制备抗体及其在组织中表达的研究,为进一步研究其功能奠定基础。方法从人胎肺组织中克隆得到UGRP1基因,构建重组表达质粒pGEX-5X-1/UGRP1。将此质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,表达含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的GST-UGRP1融合蛋白。此融合蛋白经纯化分离后,免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体。用Western印迹的方法检测多抗血清。通过构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的EGFP-N2-UGRP1载体,转染非洲绿猴肾细胞(COS细胞)表达重组蛋白,对UGRP1的表达进行亚细胞定位。结果成功构建了pGEX-5X-1/UGRP1载体,获得了高纯度的重组蛋白和多克隆抗体。免疫组化分析表明UGRP1表达于肺支气管上皮细胞,亚细胞定位分析证实UGRP1主要表达于细胞浆。结论研究发现UGRP1表达于肺支气管上皮细胞和在COS细胞的胞浆中表达。经纯化获得蛋白并制备抗体,为进一步研究UGRP1的功能奠定了基础。     

Mu2蛋白亚细胞结构定位及其相互作用蛋白的筛选

目的：采用果蝇S2细胞表达FLAG-Mu2蛋白,观察其亚细胞结构定位并纯化鉴定FLAG-Mu2质粒蛋白复合物,为Mu2蛋白的研究提供依据。方法：FLAG-Mu2转染果蝇S2细胞后表达FLAG-Mu2融合蛋白,共聚焦激光扫描显微镜下观察FLAG-Mu2蛋白的亚细胞定位,并通过核浆分离蛋白提取实验观察细胞核提取物中FLAG-Mu2蛋白的表达情况;采用免疫沉淀技术沉淀FLAG-Mu2复合物,并对其进行纯化及质谱测序以确定蛋白复合物的组分。结果：共聚焦激光显微镜下观察,FLAG-Mu2蛋白主要表达于细胞核中。核浆分离蛋白提取检测,融合蛋白相对分子质量约为140 000,主要存在于细胞核提取物中。纯化FLAG-Mu2蛋白复合物并进行蛋白质质谱分析,FLAG-Mu2复合物中可能含有pif1A、CG31782、mip120、CG31690和G protein-sa60A。结论：FLAG-Mu2蛋白在果蝇S2细胞中主要定位于细胞核,FLAG-Mu2蛋白复合物中有5种可能的蛋白组分。     

Nectin-3序列初步分析及其表达定位

目的　初步分析人的细胞黏附蛋白Nectin-3（nectin cell adhesion molecule 3）的序列并研究其亚细胞定位,观察小鼠Nectin-3眼部表达情况。方法　分析Nectin-3核苷酸序列并对其编码的3个同源异构体进行氨基酸序列比对分析。构建带eGFP荧光标签的Nectin-3 3个同源异构体的重组质粒,转染到HEK293T细胞内,Western印迹法实验检测其蛋白表达。分别转染至HeLa细胞内,细胞免疫荧光检测其亚细胞定位。免疫组织化学实验检测Nectin-3在新生小鼠眼球组织的表达情况。结果　Nectin-3在目前数据库中共有的转录本有3个,分别编码3个同源异构体iso1（isoform1）、iso2（isoform2）和iso3（isoform3）。序列分析显示它们的N端和/或C端氨基酸序列不同,编码iso3的基因的启动子与iso1和iso2的启动子不同。成功构建Nectin-3的3个同源异构体的荧光融合蛋白表达质粒,Western印迹法显示iso1和iso2的融合蛋白均出现比预测的分子量更小的条带,iso3的融合蛋白与预测的分子量大小基本一致。免疫荧光实验显示iso3表达主要在细胞质中,iso1与iso2表达在细胞核和细胞质均可见;免疫组织化学显示Nectin-3在晶状体上皮细胞和纤维细胞、视网膜上皮细胞和睫状体色素和非色素上皮细胞之间区域均有表达。结论　Nectin-3在新生小鼠眼球组织表达,iso1与iso2可能被酶切割,3个同源异构体的亚细胞定位存在差异,这些实验数据将为后续研究Nectin-3的功能奠定实验基础。     

Effect of subcellular localization of P21 on proliferation and apoptosis of HepG2 cells

This study examined the effect of subcellular localization of P21 on the proliferation and apoptosis of HepG2 cells.The coding genes of the wild and the mutant P21 were amplified by mega primer PCR fro...     

牛颈静脉经不同方法交联改性后的免疫原性

目的:研究牛颈静脉带瓣管道经不同方法交联后免疫原性的变化。方法：将牛颈静脉随机分为4组(n=10)：多聚环氧化合物(PC)交联组、染料介导光氧化(DMP)交联组、戊二醛(GA)交联组及新鲜牛颈静脉对照组。制备牛颈静脉匀浆，与完全福氏佐剂混合制成复合乳剂抗原，免疫新西兰大白兔。采用双向免疫扩散法测定兔血清抗体滴度。取新鲜牛颈静脉免疫的兔血清,采用免疫印迹法(Western blotting )体外检测交联后的牛颈静脉组织匀浆的抗原组分。结果：免疫印迹显示新鲜牛颈静脉组织有特异性重复出现的阳性条带，经PC，DMP交联处理的牛颈静脉均未出现明显阳性条带，经GA交联处理的牛颈静脉中1例出现阳性条带，但无特异性重复出现的条带 ，各交联处理组间免疫原性无明显差异。 结论： PC，DMP及GA交联处理的牛颈静脉可有效地灭活其免疫原性,适合临床应用要求。     

蛋白质酪氨酸磷酸化-免疫沉淀及Western印迹两种方法的比较

为了深入了解在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法，采用免疫沉淀法及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析。免疫沉淀结果表明，照射后１７５００、２２０００、２８０００、３２０００、４００００、４３０００及５３０００蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果表明，照射后２８０００、３２０００蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。提示在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中，免疫沉淀法优于Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法。     

使用不同组织裂解液提取人心房组织膜蛋白的研究

目的:寻找一种适用于Western boltting实验的提取人心房组织膜蛋白的组织裂解液的配制方法。方法:配制两种不同的组织裂解液A、B。应用组织裂解液A、B及Bio-Rad公司提取膜蛋白的试剂盒,分别对人右心耳组织进行膜蛋白提取,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白进行分离,免疫印迹法检测SK2膜蛋白的表达,比较三种裂解方法的裂解效果。结果:三种不同的裂解方法提取的膜蛋白,其中用组织裂解液A和组织裂解液B提取的膜蛋白能满足Western blotting的实验要求,比用试剂盒提取的方法实验效果好。结论:组织裂解液A和组织裂解液B可作为人心房组织提取SK2膜蛋白的组织裂解液。     

不同切肝量对大鼠肝脏HSP 70表达的影响

目的探讨大鼠肝脏HSP70在评价手术创伤程度中的意义。方法建立不同肝切量的大鼠创伤模型,160只健康雄性SD大鼠随机分成正常对照组及轻度、中度、重度创伤组,采用western blotting方法,动态观察各创伤组术后2、8、12、24、48 h肝组织中HSP70的表达情况。结果各创伤组伤后HSP70的表达迅速增加,8 h达到峰值后逐渐下降,48 h降至正常水平,随着肝切量的增多这种变化更加明显。结论手术创伤后肝组织HSP70表达升高,于8 h达到峰值,提示HSP70可能是创伤后早期参与肝细胞损伤机制启动的一个重要因素。随着肝切量的增加,HSP70的表达增高,提示HSP70的表达可作为判断肝脏手术创伤程度的一个指标。     

Treponema pallidum-specific antibody expression for the diagnosis of different stages of syphilis

Background Tp15,Tp17,Tp45,and Tp47 are outer-membrane proteins found in Treponema pallidum,the etiologic agent of syphilis.These proteins are potent antigens and are potential markers for the serologic...