大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体mRNA表达量的影响

目的研究大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体(TLRs) m RNA表达量的影响。方法 40只雌性BALB/c小鼠随机分为感染组和未感染组,每组20只。感染组每鼠经口灌喂大片形吸虫嚢蚴20个,未感染组经口灌喂等体积PBS,分别于感染后1、 4、 7、 14和28 d,每组各取4只小鼠进行剖杀。取小鼠肝脏组织,提取总RNA,逆转录为cDNA, qRT-PCR检测TLR1～9 mRNA的相对表达量。于感染的水牛肝脏中收集大片形吸虫虫体, PBS培养6 h,收集自然活性的大片形吸虫分泌排泄产物(n Fg ESP)。18只雌性BALB/c小鼠随机分为n Fg ESP组和PBS组,每组9只。n Fg ESP组每鼠经腹腔注射1 mg/ml n Fg ESP,对照组注射等量PBS,分别于注射后1、 4、 7 d,每组各取3只小鼠进行剖杀。取小鼠肝脏组织,提取总RNA,逆转录为cDNA, qRT-PCR检测TLR1～9 m RNA的相对表达量。将n Fg ESP溶液95℃热处理15 min,制备热灭活的大片形吸虫分泌排泄产物(hi Fg ESP);分别用含25、50、 100和200μg/ml n Fg ESP或hi Fg ESP的PBS体外刺激小鼠RAW264.7细胞24 h (细胞浓度为2×106个细胞/孔),设2个重复孔, 3次重复实验,以等体积PBS为空白对照;收集各组细胞,提取细胞总RNA,逆转录为cDNA, q RTPCR检测TLR1～9 mRNA的相对表达量。结果大片形吸虫感染小鼠实验结果显示,感染组小鼠7 d后肝脏组织中TLR6和TLR7的mRNA相对表达量分别为2.9±0.3和2.5±0.5,均高于未感染组(1.0±0.2和1.3±0.5)(P 0.01); 14 d后TLR1和TLR9的mRNA相对表达量分别为3.4±0.8和2.8±0.9,均高于未感染组(1.1±0.2和1.1±0.3)(P 0.05或P 0.01); 28 d后TLR1、 TLR8和TLR9的mRNA相对表达量分别为3.8±1.3、 4.2±1.5和3.1±0.9,均高于未感染组(1.0±0.2、 1.2±0.4和1.1±0.3)(P 0.01或P 0.05)。Fg ESP体内免疫小鼠实验结果显示, n Fg ESP注射1 d后,小鼠肝脏组织中TLR1和TLR2的mRNA相对表达量分别为2.5±0.4和1.9±0.4,均高于PBS组(1.0±0.1)(P 0.05或P 0.01)。Fg ESP体外刺激RAW264.7细胞实验结果显示, 100μg/ml n Fg ESP刺激下的TLR1、 TLR3、 TLR7和TLR8的mRNA相对表达量分别为1.6±0.0、 1.4±0.0、 1.6±0.0和1.9±0.0,均高于PBS组(1.0±0.0)(P 0.05或P 0.01); 200μg/ml n Fg ESP和hi Fg ESP刺激下的TLR8 mRNA相对表达量分别为3.4±0.0和4.0±0.5,均高于PBS组(1.0±0.0)(P 0.01); 100μg/ml hi Fg ESP刺激下的TLR2和TLR8的mRNA相对表达量分别为1.5±0.1和2.0±0.0,均高于PBS组(1.0±0.0)(P 0.01); 25μg/ml hi Fg ESP刺激下的TLR3m RNA相对表达量为0.6±0.0,低于PBS组(1.0±0.0)(P 0.01)。结论大片形吸虫可能通过其分泌排泄产物影响小鼠TLR1、 TLR7和TLR8的转录,对宿主免疫应答进行调控。     

吸虫排泄分泌产物成分及其功能的研究进展

吸虫是一类重要的人兽共患寄生虫,不仅影响水产业和家畜业的生产,还严重威胁人类的健康.吸虫的排泄分泌产物(excretory-secretory products,ESP)在虫体致病机制中发挥重要的作用,研究其组成成分和相应的功能对探讨虫体和宿主的相互关系有重要的意义.目前已开展通过蛋白质组学和基因组学的相关技术对ESP的成分进行分离、提纯、重组表达,并在体内、外探讨各生物活性分子的生物活性和免疫调节功能的研究.该文就吸虫排泄分泌产物及功能的国内外研究进展作一综述.     

吸虫排泄分泌产物成分及其功能的研究进展

吸虫是一类重要的人兽共患寄生虫,不仅影响水产业和家畜业的生产,还严重威胁人类的健康.吸虫的排泄分泌产物(excretory-secretory products,ESP)在虫体致病机制中发挥重要的作用,研究其组成成分和相应的功能对探讨虫体和宿主的相互关系有重要的意义.目前已开展通过蛋白质组学和基因组学的相关技术对ESP的成分进行分离、提纯、重组表达,并在体内、外探讨各生物活性分子的生物活性和免疫调节功能的研究.该文就吸虫排泄分泌产物及功能的国内外研究进展作一综述.     

大片形吸虫囊蚴的消灭

在日本,牛的片形吸虫病是反刍动物中最重要的寄生虫病。世界许多地方已知这种肝吸虫主要的感染途径是在污染囊蚴的沼泽牧场或泛滥地区动物食草而感染,但在日本,囊蚴常生长在水边的稻干或草上,特别是牛的片形吸虫病是食入带有囊蚴的稻草所致,     

人感染血清对肝片吸虫成虫排泄分泌抗原的识别

肝片吸虫病免疫诊断的敏感性和特异性取决于所用的是虫体粗抗原,部分纯化抗原,还是成虫的代谢分泌抗原(ESP)。作者用ELISA分析了ESP的敏感性和特异性,还应用SDS—PAGE和免疫印迹技术,观察肝片吸虫病及其他寄生虫病(血吸虫病、丝虫     

华支睾吸虫成虫抗原和排泄分泌产物对T细胞的作用研究

目的观察华支睾吸虫成虫抗原(Crude antigen,CA)、排泄/分泌产物(excretory-secretory products,ESPs)对T细胞的作用。方法体外分离小鼠骨髓细胞诱导分化为未成熟骨髓树突状细胞(immature DC,iDC);磁珠分选仪分选小鼠脾脏细胞的初始CD4+T细胞;流式细胞术检测DC、CD4+T细胞的纯度;抗原刺激DC细胞,实验分为PBS阴性对照组,LPS阳性对照组,CA和ESPs刺激组;负载抗原后的DC细胞与分选的CD4+T细胞共培养72h;Real time-PCR检测T-bet、GATA3mRNA的相对表达量;ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ、IL-4细胞因子的表达量。结果与PBS组相比,ESPs刺激组Tbet、GATA3mRNA表达水平升高(P0.05),而CA刺激组T-bet、GATA3 mRNA表达水平差异不显著;与PBS组相比,ESPs刺激组细胞因子IFN-γ、IL-4的含量均升高(P0.05),CA刺激组仅IFN-γ的分泌增高(P0.05),IL-4无明显变化。结论 CA可能诱导宿主产生Th1型免疫应答,ESPs可能诱导宿主产生Th1型、Th2型免疫应答。     

感染大片形吸虫水牛肝脏的病理变化

目的观察沼泽型水牛感染大片形吸虫(Fasciola gigantica)囊蚴后其肝脏在不同感染阶段的病理变化。方法 29头健康沼泽型水牛分为感染组(24)和对照组(5头),感染组每头一次性经口感染500个大片形吸虫囊蚴,对照组不作任何处理。感染后第3、10、28、42和70天解剖水牛(感染组第42天4头,其余时间点5头;对照组各1头),肉眼观察肝脏的病理变化;采集肝脏组织按常规方法制作组织切片,苏木素-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察组织病理结构;Masson三色染色,光学显微镜下观察肝组织中胶原蛋白。结果感染组水牛在感染囊蚴后第3天,肝表面可见散在的灰白色片状病变区域,第10天灰白色片状病变更加明显并出现瘢痕,第28天肝脏表面开始出现化脓性结节,第42和70天化脓性病灶逐渐加重;对照组水牛肝表面光滑,无其他病变。肝组织切片HE染色后结果显示,感染后第3天,肝索结构轻微紊乱和肝细胞发生颗粒变性,第10天局部肝细胞核溶解、破碎,第28天肝小叶内开始出现嗜酸粒细胞浸润和肝小叶内局部出血,第42天肝小叶内大面积出血,第70天肝窦间隙内出现纤维化,肝细胞开始修复;对照组肝组织切片的肝索结构清晰,肝细胞结构正常。肝组织切片Masson三色染色结果显示,感染组水牛第42天在汇管区和肝细胞窦状隙间开始出现少量胶原纤维,第70天胶原纤维逐渐增多;对照组肝窦间隙内有少量的胶原纤维。结论水牛感染大片形吸虫囊蚴后,肝组织出现动态病理损伤,在感染囊蚴后第3天出现早期肝损伤,随后损伤逐步加重并呈现明显的炎性反应,至感染第42天开始出现肝纤维化的典型病理变化。     

华支睾吸虫排泄-分泌产物对小鼠巨噬细胞一氧化氮产生和核转录因子κB活化的影响

目的研究华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)排泄-分泌产物(ESPs)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7一氧化氮(NO)产生与核转录因子κB(NF-κB)活化的影响。方法用20μg/ml华支睾吸虫ESPs水溶性浓缩物及其有机溶剂提取物(ESPs-ex)和0.1μg/ml明尼苏达沙门氏杆菌脂多糖(LPS-SM)分别刺激RAW264.7细胞,未刺激对照组加入等量Hank’s平衡盐缓冲液(HBSS)。实验同时用0.3 mmol/L诱导型一氧化氮合成酶(i NOS)抑制剂SMT作为干预。细胞培养18 h后,用Griess法检测各组细胞培养上清液NO2-浓度。将p Ni Fty2-SEAP质粒转染至4组刺激后RAW264.7细胞,培养18 h后,检测培养上清液中可溶性胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的吸光度(A620值),倒置显微镜观察细胞内SEAP催化显色情况。结果经ESPs-ex和LPS-SM刺激后,细胞培养上清液中NO2-浓度分别为(14.30±1.62)和(14.10±2.17)μmol/L,均较未刺激对照组[(7.70±0.95)μmol/L]显著增加(P0.05);加入SMT后,两组NO2-浓度显著下降,分别为(8.97±0.81)和(4.96±1.36)μmol/L(均P0.05)。经ESPs刺激后,上清液中NO2-浓度为(4.06±0.62)μmol/L,较未刺激对照组显著降低(P0.05);加入SMT后,NO2-浓度为(3.99±0.87)μmol/L,无明显变化(P0.05)。ESPs刺激后,上清液SEAP的A620值为0.836±0.005,显著高于未刺激对照组(0.097±0.009)(P0.05);镜下可见细胞内出现广泛、强烈的蓝色显色反应。ESPs-ex和LPS刺激后,上清液SEAP的A620值分别为0.112±0.004和0.116±0.009,略高于未刺激对照组(P0.05);镜下见部分细胞内出现蓝色显色反应。结论华支睾吸虫ESPs能够促进RAW264.7细胞活化NF-κB,其水溶性浓缩物可抑制NO产生,ESPs-ex和LPS-SM可促进NO产生。     

旋毛虫排泄分泌蛋白对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用

采用MTT法检测旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对人肝癌Hep G2细胞增殖的抑制作用。AO/EB荧光染色观察与300μg/ml排泄分泌蛋白共培养24 h的Hep G2细胞的细胞核形态。用75μg/ml排泄分泌蛋白作用Hep G2细胞24 h后,流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率,免疫荧光法检测细胞cleaved-caspase 9的表达。结果显示,旋毛虫排泄分泌蛋白呈剂量依赖性抑制人肝癌Hep G2细胞的增殖。300μg/ml排泄分泌蛋白作用24 h后,Hep G2细胞核固缩呈圆珠状凋亡特征。75μg/ml排泄分泌蛋白作用细胞24 h后,细胞早期和晚期凋亡率分别为17.9%和7.3%,细胞坏死占6.6%;Hep G2细胞中cleaved-caspase 9荧光强度明显高于阴性对照。     

不同间隔时间人绒毛膜促性腺激素刺激对体外培养的人睾丸组织睾酮分泌的影响

体外培养的人睾丸组织分为对照组、单剂人绒毛膜促性腺激素（hCG）组、隔3日双剂hCG组及连续多剂hCG组。在加入hCG（20kIU/L）后温育24小时,收集培养液,测定睾酮。结果表明3个hCG处理组给予第1剂hCG后48～72小时出现分泌高峰;间隔3日再次刺激仍可诱发睾酮合成增加,但峰值减低;而连续刺激则睾酮水平未增加。     

γ射线照射对大片吸虫感染仓鼠的影响

以往报告了用不同剂量钴~(60)照射大片吸虫后囊蚴可使其对仓鼠的感染力受到一定的影响。本试验采用钴~(60)的剂量在0～8千拉德之间。共分为7个剂量组,每组分别用0、2、3、4、5、6、8千拉德剂量照射的后囊蚴感染5只仓鼠,每鼠经口感染20条后囊蚴。10周后解剖仓鼠,仔细检查肝脏内的虫体。结果     

大理地区大片形吸虫的最适中间宿主研究

明确大理地区大片形吸虫的最适中间宿主,为制定防治措施提供依据。收集大片形吸虫虫卵,28℃孵育。每日定时吸取虫卵,观察其发育情况,直至孵出毛蚴。将3种实验用螺随机分为感染组和未感染组。感染组螺数量依次为:尖膀胱螺141只、椭圆萝卜螺240只和小土蜗251只;未感染组螺数量依次为:尖膀胱螺124只、椭圆萝卜螺136只和小土蜗87只。感染实验于24孔细胞培养板上进行,每孔加入数量比为1∶3的螺与毛蚴。感染4 h后将螺放入养螺盆,每盆放置48～60只螺,室温下饲养。未感染组螺直接放入养螺盆,与感染组螺同法饲养。每日挑拣死螺,显微镜下观察大片形吸虫幼虫发育情况,同时记录室温和水温。待螺体内的幼虫发育为子雷蚴(含尾蚴雏形),收集囊蚴。结果显示,毛蚴于第11天孵出。感染组螺中,尖膀胱螺、椭圆萝卜螺的最长存活时间为72 d,小土蜗的最长存活时间为53 d。期间测定的饲养室温为21℃～27℃(平均24℃),水温为21℃～25℃(平均23℃)。141只尖膀胱螺均为阴性,至感染后第72天,仍有12只存活;仅1只椭圆萝卜螺为阳性,于感染后第28天死亡,其余239只均为阴性,至感染后第72天,仍有36只存活。共检出112只阳性小土蜗,感染率为44.6%(112/251),至感染后第53天,全部死亡。未感染组螺中,尖膀胱螺、椭圆萝卜螺的最长存活时间为77 d,小土蜗的最长存活时间为57 d。124只尖膀胱螺均为阴性,至饲养第77天,有8只存活; 136只椭圆萝卜螺均为阴性,至饲养第77天,有30只存活; 87只小土蜗均为阴性,至饲养第57天全部死亡。所有阳性螺均未观察到胞蚴;仅有的1只阳性椭圆萝卜螺体内可观察到母雷蚴; 112只阳性小土蜗体内可观察到雷蚴、母雷蚴、子雷蚴和尾蚴。阳性小土蜗于感染后第11天可见雷蚴,第23天可见母雷蚴,第26天可见含不成熟尾蚴的子雷蚴,第30天可见含成熟尾蚴的子雷蚴,感染40天后死亡的阳性小土蜗软体中发现尾蚴。感染后第40天开始捡获囊蚴,持续11 d,共收获511个囊蚴,其中499个囊蚴(占97.7%)均于次日清晨8:00检获,剩余12个囊蚴(占2.3%)于其中4天下午(14:30～16:30)捡获,期间存活的小土蜗有29只,其中24只为阳性,占阳性螺总数的21.4%(24/112),每只阳性螺逸出尾蚴且形成囊蚴的平均数为21个(511/24)。大理地区大片形吸虫的最适中间宿主为小土蜗。     

硒对T—2毒素所致体外培养大鼠肝细胞损伤的影响

通过测定大鼠肝细胞培养液中乳酸脱氢酶、白蛋白及细胞内ＤＮＡ总量，我们对Ｔ—２毒素所致的肝细胞损伤作用及硒对其影响进行了探索。结果表明：Ｔ—２毒素可引起ＬＤＨ升高、白蛋白及ＤＮＡ合成下降；加硒０．１～０．５μｇ／ｍｌ１２小时后上述指标部分恢复。揭示Ｔ—２毒素可造成大鼠肝细胞膜系统的破坏，并由此导致细胞合成能力下降；适量补硒可部分拮抗Ｔ—２毒素的细胞毒作用，其机理可能与硒保护细胞膜的作用有关。     

碘对体外培养人甲状腺细胞合成DNA蛋白质和甲状腺激素分泌的影响

目的研究不同浓度的碘对体外培养人甲状腺细胞合成ＤＮＡ、蛋白质和甲状腺激素分泌的影响。方法采用原代人甲状腺细胞在含有不同浓度碘的培养基中培养４８小时后,取２００μｌ培养液,放免法测定甲状腺激素的含量。在实验结束前６小时加入３Ｈ－ＴｄＲ或３Ｈ－ｌｅｕ。实验结束后采用液闪测量细胞中的３Ｈ－ＴｄＲ或３Ｈ－ｌｅｕ的含量。结果ＤＮＡ和蛋白质合成的最佳碘浓度分别为４×１０－６ｍｏｌ／Ｌ和１×１０－５ｍｏｌ／Ｌ。Ｔ３、Ｔｇ、Ｔ４分泌的最适碘浓度分别为７×１０－６、７×１０－６、９×１０－６ｍｏｌ／Ｌ。结论体外培养人甲状腺细胞生长、增殖和分泌有一最佳的碘浓度,超过或低于这个浓度都会影响甲状腺细胞的生长、增殖和分泌。     

体外培养人胎肝细胞色氨酸吸收试验——测定培养肝细胞功能的新方法

为了提高和确保培养人胎肝细胞对治疗重症肝病的疗效,我们用体外人胎肝细胞色氨酸吸收试验,来检测胎肝细胞的生物功能,取得了满意的结果。     

体外培养肝细胞合成微量人清蛋白测定方法

1 材料和方法 1.1 材料 人清蛋白放免试剂盒由北方原子能研究所提供。人清蛋白放射免疫检测,采用抗原竞争法。原试剂盒灵敏度为0.25μg/mL,不能满足实验需要,经反复摸索,调整抗体、~(125)I-标记抗原浓度及实验条件,最终得出如下结果:~(125)I-人清蛋白放射性比活度为25μCi/μg,每一样品测定用量2.5μCi,抗体1:8稀释,并将温育方式改为4℃ 24h,可提高灵敏度至3ng/mL左右。 1.2 方法 1.2.1 清蛋白标准曲线、线性关系及灵敏度 取洁净试管分别标上记号,非特异性结合管(NSB),标准;管S0～S7(n=5),然后用微量加样器加样,缓冲液:NSB管加300μL,S0管200μL;标准品S1～S7管加200μL;~(125)I-人清蛋白:各管均加100μL;抗体:S0管、S1～S7管各100/μL。4℃ 24h温育后分别加免疫分离试剂1000μL,混匀后室温放置15min,任取5管测放射性计数(cpm)取平均值为总T.3000r/min离心15min,测     

在人肝细胞中体外培养间日疟获得成功

本文报道了人体间日疟原虫在人肝细胞体外培养中能完成裂体增殖,并见到释放的小裂殖子有钻进红细胞的能力。作者用套管灌注肝脏小血管取得肝细胞。制备肝细胞层和培养的条件与以往用鼠肝细胞的条件相同,将肝细胞铺在盛有1.5ml的少量培养基内,细胞浓度为5×10~5/     

人肝脏再生增强因子对体外肝细胞生长的影响

目的基因工程方法纯化人肝脏再生增强因子（hALR）,研究hALR对体外培养肝细胞生长的影响。方法构建hALR原核表达载体PGEX-3X-hALR,诱导表达、纯化收集GST-hALR,用X因子切去GST,凝胶过滤得到高纯度hALR蛋白;分别用正常肝细胞（L-02细胞）和肝癌细胞（HepG2细胞）分析hALR对其生长的影响。结果hALR原核表达载体pGEX-3X-hALR构建成功,经诱导表达,可纯化得到高纯度的hALR蛋白。hALR蛋白能促进正常肝细胞的生长,并与浓度成正相关;而肝癌细胞的生长却起抑制作用。结论成功表达和纯化重组hALR蛋白,hALR促进正常肝细胞的生长而抑制肝癌细胞生长。