人胎脑星形胶质细胞原代分离培养及鉴定

目的探索并建立人胎脑星形胶质细胞的原代培养方法.方法分别以组织块法和消化法分离、培养和纯化人胎脑星形胶质细胞,并用形态学观察和免疫细胞化学方法进行鉴定.结果组织块法的培养效果优于消化细胞培养法;原代培养、纯化的细胞生长稳定,经鉴定为星形胶质细胞.结论采用组织块法原代培养人胎脑星形胶质细胞,简单易行、所获细胞纯度高,可用于体外星形胶质细胞的进一步研究.     

小鼠脑内星形胶质细胞体外培养方法的优化

目的： 优化小鼠脑内星形胶质细胞的体外培养方法,为星形胶质细胞的功能研究奠定实验基础。 方法： 取新生0～1 d的C57BL/6乳鼠大脑皮质,胰酶消化结合机械吹打方法,分离皮质细胞,制成细胞悬液并差速贴壁处理,待细胞接种24 h轻柔换液,以后每隔2～3 d换液,且每次换液前手动振荡洗涤2次,传代3次后,行胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）免疫细胞化学染色及免疫荧光染色鉴定。 结果： 经过原代及传代培养,获得形态典型、纯度在95%以上的星形胶质细胞。结论： 优化后的体外培养星形胶质细胞方法,稳定有效,操作简便易行,并可获得高纯度的星形胶质细胞。     

视神经星形胶质细胞原代培养技术研究

目的　介绍一种快速原代培养、分离、纯化视神经星形胶质细胞的方法。方法　对P2期小鼠的视神经进行组织块原代培养,振荡法分离纯化,形态学观察,免疫组织化学染色。结果　培养的星形细胞纯度高,GFAP染色显示98%阳性。结论　组织块原代培养,振荡法分离纯化视神经的星形胶质细胞,对细胞的损伤小、纯度高,是快速得到该细胞的理想途径。     

视神经星形胶质细胞原代培养技术研究

目的 介绍一种快速原代培养、分离、纯化视神经星形胶质细胞的方法。方法 对P2期小鼠的视神经进行组织块原代培养,振荡法分离纯化,形态学观察,免疫组织化学染色。结果 培养的星形细胞纯度高,GFAP染色显示98%阳性。结论 组织块原代培养,振荡法分离纯化视神经的星形胶质细胞,对细胞的损伤小、纯度高,是快速得到该细胞的理想途径。     

大鼠星形胶质细胞的体外培养与鉴定

目的探讨大鼠星形胶质细胞的最优体外培养方法与培养条件。方法采用差异贴壁等手段进行组织原代培养,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和即用型SP-9001免疫组化试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果镜下培养细胞生长多呈多彤性、扁平状,胞体较大,胞突较多较长,细胞核呈圆形或卵圆形,常偏于胞体的一侧,免疫组化染色显示细胞浆为掠褐色,细胞核为蓝色,呈阳性表达,星形胶质细胞的纯度在95％以上。结论本法可获纯度高、结构和功能良好的大鼠星形胶质细胞,可作为体外的细胞模型为研究细胞因子对其功能的调控作用奠定实验基础。     

大鼠星形胶质细胞培养方法的改进

目的 改进星形胶质细胞的体外纯化培养方法,为研究星形胶质细胞的生物学功能提供实验模型.方法 采用新生 SD大鼠,无菌操作取其大脑皮质,用0.025%的胰酶吹打消化成单个细胞,替代传统的0.25%的胰酶水浴消化15 min,单个细胞悬液接种于预先包被好PDL的24孔板或25 cm2的细胞培养瓶中,体外培养9~14天至细胞完全融合并铺满瓶底后进行传代.第2代细胞应用抗GFAP的抗体进行免疫荧光染色来鉴定星形胶质细胞的纯度.结果 免疫荧光染色结果显示这种培养方法分离培养出的星形胶质细胞纯度达到90%以上.结论 采用本实验改进的方法,培养的大鼠星形胶质细胞纯度高、生长状态良好,符合体外研究要求.     

大鼠脑组织神经元培养、纯化、传代、鉴定

目的：探讨体外培养高纯度神经元的方法。方法：取SD新生大鼠，胰蛋白酶消化、离心，原代培养出神经元和神经胶质的混合细胞；振摇法和胰蛋白酶消化法去掉小胶质和星形胶质，传代培养神经元，免疫细胞化学法鉴定培养神经元的纯度。结果：第三次传代培养细胞，NF抗体标记阳性细胞遍布整张盖片，仅有零星散在CD68和GFAP阳性细胞。结论：本实验传代、培养的细胞高纯度的神经元，为后续实验打下了基础。     

人扁桃体隐窝上皮细胞的分离、原代培养与鉴定

目的：建立高效、稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代培养方法。方法：收集80例3~5岁儿童手术切除的扁桃体组织,分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法提取扁桃体隐窝上皮细胞并比较两种方法的提取效果;应用无血清角化细胞培养基进行细胞纯化及原代培养;用相差显微镜观察细胞形态和生长特点、免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞来源。结果：Ⅱ型中性蛋白酶联合消化法在分离扁桃体隐窝上皮细胞成功率、细胞密度以及细胞融合时间方面均高于组织块贴壁法（P < 0.05）,细胞接种后第2天开始贴壁,外观呈现多边形,岛状生长,培养12 d左右,细胞连成单层,呈现铺路石样生长。免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性,波形蛋白阴性;免疫荧光鉴定角蛋白8/18染色阳性。结论：应用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法以及无血清角化细胞培养基可建立高效稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代分离方法和体外培养体系。     

免疫磁珠分选法原代培养小鼠肺微血管内皮细胞

目的：探讨一种高效、稳定的小鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）原代培养方法。方法：选取45只1周龄Balb/c小鼠,随机分成3组,分别用酶消化法、组织贴块法、免疫磁珠分选法3种方法分离培养小鼠PMVECs,观察细胞形态学以及VIII因子相关抗原免疫荧光染色鉴定内皮细胞,计算各组原代培养成功率及从原代培养开始到首次传代所需时间,测定细胞纯度,MTT法绘制生长曲线。结果：3组原代培养的细胞在倒置显微镜下均能见到短梭形、多边形的微血管内皮细胞,血管内皮细胞特异性标志物VIII因子相关抗原表达阳性。免疫磁珠分选法组原代培养成功率及细胞活性显著高于其他2组,差异有统计学意义（P＜0.01）,从原代培养至首次传代所需的时间短于组织贴块法组,差异有统计学意义（P＜0.05）,细胞纯度显著高于酶消化法组,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：相比于酶消化法与组织贴块法,免疫磁珠分选法原代培养小鼠PMVECs具有重复性好,分离速度快,细胞纯度高及活性好的优点。     

小鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法的比较

目的：比较离体纯化和培养星形胶质细胞的不同方法,旨在获得高纯度的星形胶质细胞,为进一步研究奠定基础。方法：用原代培养、传代纯化和一次或两次振荡纯化的方法培养星形胶质细胞。结果：原代培养的星形胶质细胞纯度不高;经传代纯化培养后纯度达到99％以上,bystin表达量较少,且能经短时间模拟缺血诱导活性明显增高;经振荡纯化后bystin表达量明显增多,GFAP免疫荧光变亮,能耐受长时间模拟缺血,提示经振荡后星形胶质细胞已经处于“活化”阶段。结论：经过传代纯化的星形胶质细胞纯度最高,可以经模拟缺血诱导成反应性星形胶质细胞,因此能更好地反映其在脑中的功能,是研究星形胶质细胞在脑中的功能和反应性星形胶质细胞较好的培养方法。     

大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠脊髓组织星形胶质细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。方法:于无菌条件下取新生1~2 d的SD大鼠脊髓组织,采用机械吹打及胰酶消化法制成细胞悬液,通过差速贴壁和恒温摇床震荡去除杂细胞,进行培养。用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色对所培养的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态,传至第3代细胞纯度达95%以上。结论:成功建立了大鼠脊髓星形胶质细胞体外培养方法,为脊髓星形胶质细胞的实验研究奠定基础。     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法建立及鉴定

目的：纯化和鉴定体外培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞.方法：取1~3天新生大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元等,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白—胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）鉴定星形胶质细胞.结果：培养的细胞具有典型的星形胶质细胞形态且生长旺盛,第3代95%以上为星形胶质细胞,特异性抗原GFAP表达阳性.结论：该方法操作简单,可靠,是一种有效的新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法.     

Ad-hNGFβ转染原代培养的大鼠脊髓星形胶质细胞及其生物活性研究

目的:体外培养新生SD大鼠脊髓星形胶质细胞,观察携带人β神经生长因子基因的重组腺病毒(Ad-hNGFβ)对其存活及毒性作用,为Ad-hNGFβ在体研究打下基础。方法:分离新生SD大鼠的脊髓星形胶质细胞(Astrocyte,Ast),应用DMEM/F-121∶1培养基进行原代培养扩增鉴定。重组Ad-hNGFβ(MOI=25,50,100)转染Ast后,噻唑蓝(MTT)法检测病毒感染滴度与细胞存活的关系。ELISA方法测定培养3,6,9,12,15d时培养上清中hNGFβ的含量;用流式细胞仪对转染细胞进行倍体分析,观察转染Ad-hNGFβ对细胞周期和凋亡的影响;Western blot印迹法测定转染后表达产物的存在形式。结果:从新生SD大鼠的脊髓组织中成功分离培养出星形胶质细胞,GFAP免疫荧光阳性。经MTT法测定,当MOI=25,50,100时试验组的吸光值OD490与对照组比无显著差异,P>0.05。转染Ad-hNGFβ后试验组细胞培养上清中hNGFβ表达量与对照组同期相比有显著差异,P<0.01;且hNGFβ可持续表达至15d。Ad-hNGFβ转染细胞后所表达的活性产物以hNGFβ二聚体的形式存在。流式细胞仪测得细胞增殖指数与对照组比明显升高,P<0.01。结论:Ad-hNGFβ可有效介导hNGFβ基因转染原代培养的脊髓星形胶质细胞,并且成功表达有活性的hNGFβ,增加细胞活性。     

大鼠海马神经元及星形胶质细胞的体外培养

目的：改进大鼠海马神经元、星形胶质细胞及两者混合状态的体外培养方法,获得高纯度的海马神经细胞。方法：选取孕期18~20 d 的SD 大鼠胎鼠作为原代海马细胞培养的材料来源。断头后于冰板上剥离双侧海马,去除表面血管及薄膜,利用眼科剪分离为小块。随后使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,将海马组织碎块移入酶消化液中。本方法选择Accutase 和0.1% DNase 作为酶消化液,37 ℃消化 15 min,期间轻柔振动。使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,终止消化。0.1% DNase 加入Neurobasal 和B-27 的混合液对消化后的海马组织碎块进行轻柔吹打,获得单细胞悬液。将悬液过200 目筛,进行细胞计数。将过筛的单细胞悬液移入DMEM 培养基（DMEM+10%胎牛血清）中,按照每平方厘米2.5×104 的细胞密度进行接种。经PDL 孵育的塑料片置于培养基底部。细胞于37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。4 h 后,依据所需细胞种类的不同,更换相应培养基。海马神经细胞于培养后7~10 d 可用于实验。结果：通过本方法可得到高纯度的大鼠海马神经细胞,且根据实验需求,通过更换培养基,可得到纯神经元、纯胶质细胞及两者混合的三种培养状态。培养的神经元及星形胶质细胞纯度均>98%。结论：该文在传统海马神经细胞体外培养方法基础上,进一步降低了实验操作难度,方法稳定有效。     

SD大鼠脑皮层星形胶质细胞的原代培养及纯化方法改良

目的:探讨大鼠大脑皮层星形胶质细胞的培养方法,以获得纯度高的细胞进一步对其进行体外实验研究。方法:在Mc-Carthy方法基础上改用出生后1d的SD大鼠的大脑皮层,结合机械分离和胰酶消化后制备单细胞悬液接种,差速贴壁1h,培养14d以后上摇床以去除混杂细胞,细胞融合后传代,每次传代前都经历胰酶冲洗和差速贴壁,传3代后利用GFAP-FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。结果:经过原代传代及纯化,大脑皮层星形胶质细胞体外培养成功,并有较高的纯度。GFAP-FITC免疫荧光染色阳性。结论:经过合理取材、改良纯化方法后,可以更为简便得到纯度很高的星形胶质细胞。     

EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代细胞生物特性的比较研究

目的比较培养EA．HY926人脐静脉内皮细胞株与原代脐静脉内皮细胞（HUVECs）的优缺点及生物学特性。方法通过倒置显微镜、透射电镜形态学鉴定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检查及生长曲线测定,比较2种脐静脉内皮细胞的形态、生长喵线等差异。结果透射电镜观察到原代HUVECs中发现较多Webel—Palade小体,而EA．HY926细胞株较少见。免疫组织化学染色ImageProPlus6．0软件进行分析EA．HY926人脐静脉内皮细胞株与原代HUVECs平均光密度值分别为（2234．02±78．78）、（4138．80±594．01）。原代HUVECs的染色程度明显较EA．HY926细胞株高,差异有统计学意义（Pd0．01）。EA．HY926人脐静脉内皮细胞株生长曲线较原代HUVECs稳定。结论培养原代HUVECs耗时长,生长期较短,易出现杂细胞的污染,细胞的增殖能力有限,花费昂贵。EA．HY926细胞株虽生物特性较差,但其操作简便,具有一定程度的原代HUVECs所具有的生物特性,细胞均一以及增长旺盛,可用于较复杂、细胞创伤较大的体外内皮细胞的研究。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养

目的：建立分离纯化、快速扩增大鼠骨髓基质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的方法。方法：用全骨髓接种贴壁法,培养分离纯化大鼠BMSCs,传代扩增、测定生长曲线和贴壁率,形态学观察、免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原。结果：全骨髓贴壁法能有效分离纯化大鼠BMSCs,细胞在10%胎牛血清BMSCs培养基中生长状态稳定,第2代细胞生长曲线呈S型、第2、4、6代贴壁率基本相同,贴壁速度无显著性差别,p〉0.05。CD29、CD44和CD90免疫组化鉴定细胞均呈阳性。结论：全骨髓接种贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMSCs,在含10%胎牛血清的BMSCs培养液中,细胞稳定扩增,可能与细胞培养微环境良好有关。     

新生大鼠视网膜干细胞分离培养及其生物学特性

目的：探讨新生大鼠视网膜干细胞的分离培养及其生物学特性。方法：采用机械酶-分离法体外扩增培养SD大鼠视网膜干细胞,观测细胞增殖能力,绘制CCK-8检测生长曲线;诱导细胞分化,免疫组织化学检测细胞巢蛋白、溴脱氧尿核苷、微管缔合蛋白-2、神经胶质原纤维酸性蛋白、胸腺糖蛋白1．1的表达。结果：原代视网膜干细胞形成大量的细胞球悬浮生长,传代后的细胞也可以形成细胞球,呈线性生长,巢蛋白和溴脱氧尿核苷表达阳性;诱导分化后的细胞部分原纤维酸性蛋白、微管缔合蛋白-2、胸腺糖蛋白1．1表达阳性。结论：新生SD大鼠视网膜干细胞可在体外分离培养和扩增,表达干细胞特性,并可向视网膜节细胞分化。     

嗜酸乳杆菌部分生理特性的研究

目的：对嗜酸乳杆菌生长曲线等生理特性进行研究,初步掌握该菌的生长、繁殖和代谢规律。方法：按国标GB/T4789.35-2003的方法测定菌落总数。以培养时间为横坐标,pH值、滴定酸度和菌落总数对数为纵坐标,绘制菌株（种）生长曲线。通过测定pH值及OD值,确定菌株（种）的最佳培养条件。通过测定活菌数,确定菌株（种）的接种方法及生长促进因子。结果：综合分析生长曲线,确定嗜酸乳杆菌在5%接种量,37℃下最佳收获期为12h～16h;最佳培养条件：初始pH值5.8,37℃培养;选择4种天然廉价物料（添加剂）作为菌株（种）的促生因子,发现对其生长均有促进作用,影响大小依次为：西红柿汁5%〉香菇汁3%〉胡萝卜汁5%〉啤酒5%〉对照。结论：得到嗜酸乳杆菌的最佳生长条件,为菌液培养、冻干粉制备及活菌制剂打下基础。