牵张应力对退变椎间盘髓核细胞增殖凋亡及细胞外基质表达的影响

目的 探讨不同强度牵张应力刺激对体外培养的人退变髓核细胞增殖凋亡和细胞外基质表达的影响。 方法 分选并体外培养人退变的髓核细胞,使用四点弯曲细胞力学装置对细胞施加不同强度的牵张应力,根据施加牵张应力强度的不同分为对照组（未给予应力刺激）、低强度组（1000 μ）、中强度组（2000 μ）和高强度组（4000 μ）四组。采用流式细胞仪测定退变髓核细胞的增殖情况;采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测各组细胞的细胞增殖核抗原(PCNA)、细胞凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）与Bcl-2相关X蛋白（Bax）、以及Ⅱ型胶原（ColⅡ）和蛋白聚糖(Aggrecan)的基因表达情况并进行分析。 结果 在不同强度的牵张应力作用下,退变髓核细胞的增殖凋亡和细胞外基质分泌呈现不同的变化。随着施加力学强度的增加,髓核细胞的增殖指数和PCNA基因表达水平先升高而后又逐渐降低,差异有统计学意义（P<0.05）。髓核细胞凋亡相关基因Bcl-2/Bax mRNA值在1000 μ强度牵张应力作用下为对照组的1.53倍,而在2000 μ和4000 μ强度下分别为0.71和0.43,同样呈现出随应力刺激增加先升高又降低的趋势,差异均有统计学意义（P<0.05）。给予1000 μ强度应力刺激后,Col Ⅱ和Aggrecan均有不同程度的表达增加,分别增加了2.1倍和2.3倍,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。随着牵张应力强度的增加,Col Ⅱ和Aggrecan基因表达逐渐降低,在4000 μ强度牵张应力刺激时,二者基因表达最低,差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论 不同强度的牵张应力对人退变髓核细胞的增殖凋亡以及细胞外基质的表达作用不同。     

氧化应激对大鼠髓核细胞凋亡的影响

背景:细胞凋亡在椎间盘退变过程中发挥重要作用,而导致细胞凋亡的因素很多,氧化应激是导致细胞凋亡的一个重要因素.目的:从细胞内信号转导水平验证过氧化氢对大鼠髓饮细胞氧化应激损伤的影响.设计、时间及地点:单一样本观察.试验于2008 03/10在山东省创伤骨科研究所完成.材料:p38MAPK特异性阻断刺(SB203580)、JNK特异性阻断剂(SP600125)购自碧云天生物技术有限公司:大鼠椎间盘来自2只新生24 h SD大鼠.方法:原代培养大鼠髓核细胞,将生长良好的髓核细胞制成细胞悬液,随即分为4组:H202组:用0,50.100,200,400,800μmol/L H2O2刺激:对照组:不加刺激的细胞:SB203580+H2O2组:给予特异性p38MAPK阻断剂SB203580预孵育细胞,再给予H2O2刺激:SP600125+H2O2组:给予特异性JNK阻断剂SP600125预孵育细胞,再给予H2O2刺激.上述处理后检测相关指标.主要观察指标:以免疫组织化学检测P-p38和P-JNK的表达情况及表达位置:Western印迹法检测SAPKJJNK、p38MAPK及其磷酸化组分的表达.结果:H2O2能够激活髓核细胞内p38和JNK的活性:SB203580能够有效地抑制p38MAPK的活性,而SP600125则能够有效的抑制JNK的活性;免疫荧光显示P-p38MAPK和P-JNK在细胞质和细胞核均有表达中,而对照组未发现.结论:大鼠髓核细胞受氧化应激后可通过p38MAPK和JNK通路导致细胞凋亡.     

烟酰胺对体外培养兔椎间盘细胞凋亡及能量代谢相关基因的影响

背景：前期研究已证实，烟酰胺能够促进椎间盘细胞的增殖并对白细胞介素1B致椎间盘退变起到保护作用，而烟酰胺对椎间盘退变的保护机制还不很清楚。目的：观察烟酰胺对白细胞介素1β诱导体外培养的兔椎间盘细胞凋亡及能量代谢相关基因表达的影响。设计、时间及地点：实验于2007-11／2008—05在华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室完成。材料：3～4月龄日本大白兔10只，体质量1．5～2．Okg，取LM脊柱节段56个椎间盘组织，用于构建兔椎间盘组织凝胶培养模型。方法：将56枚椎间盘随机分为4组，每组14枚。正常对照组：不加入药物：烟酰胺组：加入0．5g／L烟酰胺；退变组：加入10μg/L白细胞介素1β;治疗组加入10μg／L白细胞介素1β及0．5g／L烟酰胺。培养2周后对各组标本行TUNEL染色及Fas，Caspase-3，Bcl-2，低氧诱导因子1d、葡萄糖转运体1、血管内皮细胞生长因子免疫组织化学染色。主要观察指标：各组标本TUNEL染色及免疫组织化学染色阳性细胞率。结果：TUNEL染色示加入烟酰胺后退变组阳性细胞率较正常对照组上升（P=0．001）。Fas染色退变组阳性细胞率较正常对照组明显上升（P〈0．01）。Bcl-2染色示烟酰胺组较正常对照组阳性细胞率升高（P=0．004）。Caspase-3染色示治疗组阳性细胞率较退变组下降（P=0．024），但仍高于正常对照组（P=0.006）。低氧诱导因子1d染色示烟酰胺组阳性细胞率低于正常对照组（P〈0．01）；退变组阳性细胞率较正常对照组上升（P〈0．01）。葡萄糖转运体1染色示治疗组阳性细胞率高于正常对照组（P〈0．01）。结论：烟酰胺可以抑制白细胞介素1β诱导的椎间盘细胞凋亡，改善白细胞介素10导致的椎间盘能量代谢障碍。     

急性髓系白血病细胞对骨髓基质细胞增殖、凋亡的影响

目的:研究在白血病微环境下,急性髓系白血病细胞对骨髓基质细胞(BM-MSC)增殖、凋亡的影响。方法:选取过表达MLL-AF9的急性髓系白血病(AML)小鼠模型与野生型(WT)小鼠为研究对象。应用流式细胞分选仪分选WT小鼠与AML小鼠来源的BM-MSC并计数。通过倒置荧光显微镜分析不同来源的BM-MSC的形态及生长差异性。采用Brdu法检测不同来源的BM-MSC增殖率。采用Annexin V/PI法检测不同来源的BM-MSC凋亡率。结果:与WT小鼠来源的BM-MSC比较,AML来源的BM-MSC数量显著增加(P<0.01),细胞增殖率显著增高(P<0.001);凋亡率显著降低(P<0.05)。在体外培养BM-MSC,加入条件培养基的BM-MSC生长速度显著加快,但形态没有明显差异。结论:在白血病微环境中,AML细胞能够促进BM-MSC增殖,抑制其凋亡。     

地塞米松可影响兔髓核细胞增殖及Ⅱ型胶原的表达

背景:地塞米松是细胞增殖的一种常用药物,但能否促进髓核细胞增殖呢?目的:观察地塞米松对兔椎间盘髓核细胞增殖的影响,以及对髓核细胞分泌Ⅱ型胶原的影响。方法:无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化髓核细胞进行培养;传代培养第2代髓核细胞7d,加入塞米松浓度分别为1,10,100,1000,10000nmol/L,培养1~5d每日MTT常规测一组490nm处的吸光值并制定生长曲线。另选取最佳作用浓度100nmol/L地塞米松加入髓核细胞进行培养,以不加于地塞米松为对照。结果与结论:MTT检测结果表明地塞米松对兔髓核细胞增殖有促进作用,最佳作用浓度为100nmol/L,最佳作用时间为48h;RT-PCR检测结果表明经地塞米松处理的髓核细胞其Ⅱ型胶原表达明显较对照组高(P<0.05)。提示地塞米松可以促进兔椎间盘髓核细胞的增殖,并可使兔髓核细胞内Ⅱ型胶原表达增高。     

雷公藤红素对人急性髓系白血病原代细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察雷公藤红素对人类急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞增殖和凋亡的影响.方法 初诊人AML细胞按雷公藤红素浓度分成5组,A组为阴性对照组,B～E组分别为雷公藤红素1,2,5,10μmol/L处理组,应用四甲基偶氮唑兰比色法及流式细胞术等方法检测雷公藤红素对细胞的生长增殖抑制作用及诱导凋亡作用.结果 作用不同时间后,B～E组增殖抑制率随雷公藤红素浓度的增加而增加,与A组比较差异均有统计学意义(P＜0.01);C,D组增殖抑制率与B组比较差异有统计学意义(P＜0.01),与E组比较差异无统计学意义(P＞0.05);雷公藤红素抑制作用的最适浓度为2μmol/L;C～E组作用6,12,24 h时增殖抑制率比较差异无统计学意义(P＞0.05),与3h时比较差异均有统计意义(P＜0.01);B～E组作用于AML细胞6h后均能诱导AML细胞凋亡,D组细胞凋亡率最高;2 μmol/L雷公藤红素作用于AML细胞3,6,12,24 h,其细胞凋亡率随时间延长而逐渐增高.结论 雷公藤红素有明确抗AML细胞增殖的能力,其作用可能与诱导细胞凋亡有关.     

烟酰胺对帕金森病小鼠黑质细胞凋亡的影响

目的：探讨黑质细胞凋亡在帕金森病发病机制中的作用及烟酰胺对帕金森病小鼠黑质细胞凋亡和Bax蛋白表达的影响。方法：给C57BL小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)制备帕金森病小鼠模型。利用原位缺口末端标记法(TUNEL)及Bax免疫组化方法观察黑质细胞凋亡情况及烟酰胺干预的影响。结果：帕金森病小鼠黑质致密带可见大量凋亡细胞[(19.43&;#177;3．33)个／视野]Bax蛋白表达(Bax阳性细胞平均灰度值80.59&;#177;3.73)。预先应用烟酰胺能使凋亡细胞减少[(6.33&;#177;2．35)个／视野]，烟酰胺+MPTP甲组与MPTP组间比较差异有显著性意义(q=9．23，P&;lt;0.05)。预先应用烟酰胺也能使Bax蛋白表达降低(Bax阳性细胞平均灰度值107．59&;#177;2.50)，烟酰胺+MPTP组与MPTP组间比较差异有显著性意义(q=7.44，P&;lt;0．05)结论：烟酰胺可降低MPTP诱导的C57BL小鼠黑质细胞Bax蛋白表达，减少黑质细胞凋亡。     

退变兔髓核细胞和正常髓核细胞生物学特性的比较

目的探讨退变和正常兔髓核细胞的不同生物学特性。方法分离和培养原代兔椎间盘髓核细胞,体外传至第5代使其发生退变,细胞分成原代髓核细胞组(原代)和第5代退变细胞组(退变),用倒置显微镜和HE染色观察其形态学变化,用番红O染色观察糖胺聚糖的变化,用Ⅱ型胶原免疫组织化学观察Ⅱ型胶原的变化。结果原代兔髓核细胞在体外传至第5代后,细胞由类软骨细胞样的星形或多角形变为梭形或纤维长条形。番红O染色显示,退变组红色平均染色面积显著低于原代(P<0.05),免疫组织化学染色显示,退变组棕黄色平均染色面积显著低于原代(P<0.05)。结论原代兔髓核细胞在体外传到第5代时由类软骨细胞样变成纤维细胞样,且糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的含量显著下降,为进一步构建体外髓核细胞退变模型提供了依据。     

退变兔髓核细胞和正常髓核细胞生物学特性的比较

目的探讨退变和正常兔髓核细胞的不同生物学特性。方法分离和培养原代兔椎间盘髓核细胞,体外传至第5代使其发生退变,细胞分成原代髓核细胞组（原代）和第5代退变细胞组（退变）,用倒置显微镜和HE染色观察其形态学变化,用番红O染色观察糖胺聚糖的变化,用Ⅱ型胶原免疫组织化学观察Ⅱ型胶原的变化。结果原代兔髓核细胞在体外传至第5代后,细胞由类软骨细胞样的星形或多角形变为梭形或纤维长条形。番红O染色显示,退变组红色平均染色面积显著低于原代（P〈0．05）,免疫组织化学染色显示,退变组棕黄色平均染色面积显著低于原代（P〈0．05）。结论原代兔髓核细胞在体外传到第5代时由类软骨细胞样变成纤维细胞样,且糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的含量显著下降,为进一步构建体外髓核细胞退变模型提供了依据。     

ROBO3在儿童急性髓系白血病患者中的表达及其对细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究ROBO3在儿童急性髓系白血病（AML）患者中的表达及其对AML细胞增殖和凋亡的影响。方法：采用荧光定量PCR法检测不同治疗阶段的儿童AML患者骨髓中ROBO3的表达,分析初诊患儿ROBO3表达量与临床特征的关系。同时采用电转染的方法靶向干扰ROBO3表达,应用CCK-8法检测其对AML细胞系（HL-60和THP-1）增殖的影响,流式细胞术检测其对凋亡的作用。结果：与健康对照组相比,ROBO3在初诊儿童AML患者中显著高表达,尤其是在非M3型、年龄偏小的患者（<10岁）及高危组中高表达。而且与初发组相比,治疗后完全缓解组ROBO3 mRNA的表达水平显著下降。靶向ROBO3可以有效抑制AML细胞的增殖,并促进细胞凋亡。结论：ROBO3在儿童AML患者中差异表达,很可能是儿童AML潜在的标志物及新靶点。     

细胞密度对髓核细胞产生蛋白聚糖影响的体外实验

背景:退变的椎间盘组织一个重要改变是聚集蛋白聚糖明显减少,如何能够刺激髓核细胞产生更多的蛋白聚糖是学者们一直探索的问题.目的:将椎间盘髓核细胞以不同的密度植入凝胶材料中,评价细胞密度对蛋白聚糖含量的影响.设计、时间及地点:对比观察实验,于2007-08/2008-02在解放军北京军区总医院骨科实验室完成.材料:清洁级3月龄日本大耳兔3只.Live/Dead Assay kit,sGAG Assay kit试剂盒由北京纵横洋洲医药生物科技有限公司提供.方法;无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化其髓核细胞,传第2代时以1.0×109L-1密度接种在自制的壳聚糖支架中,细胞密度扩增至4×109L-1和25×109L-1时进行检测.主要观察指标:阿利辛蓝法测蛋白聚糖含量.氪氩激光器共聚焦显微镜下观察培养细胞存活情况.结果:培养14 d,细胞密度为4×109L-1时,聚集的蛋白聚糖总量为(551.65±70.10)mg/L,当细胞密度增加到25×109L-1时,聚集蛋白聚糖总量为(2245.28±462.52)mg/L.但蛋白聚糖增加的量和细胞密度并不成比例,细胞密度增加了6倍,蛋白聚糖含量只增加了两三倍.低密度培养7 d时,结果显示100%的细胞存活.高密度培养7 d时,30%的细胞在材料中央死亡,边缘部位的细胞几乎全部存活.结论:体外三维培养髓核细胞产生的蛋白聚糖随种植细胞密度增加而缓慢增加,高细胞密度对蛋白聚糖聚集有限制作用.     

人骨形态发生蛋白7基因转染对兔髓核细胞增殖和细胞外基质合成的影响

背景:以往的研究表明人骨形态发生蛋白7(hBMP·7)能够有效促进细胞外基质合成,修复受损的椎间盘基质,恢复椎间盘高度.因此有希望用于控制和逆转椎间盘退变.然而重组蛋白半衰期短,生物学活性低,退变椎M盘中很难保持骨形态发生蛋白7浓度.基因治疗能够宵效预防这些缺陷.目的:观察人骨形态发生蛋白7基因转染对原代培养的兔髓核细胞牛物学活性的影响,为人骨形态发生蛋白7基因治疗椎间盘退变的体内实验研究奠定基础.设计、时间及地点:随机对照,细胞学体外实验.于2005-12,2006-09在解放军第二军医大学长海医院全军胸心外科研究所实验室完成.材料:4周龄新西兰大耳白兔6只,体质量约500 g.Ad-hBMP7由长海医院胸心外科研究所构建.方法:麻醉后处死白兔,提取髓核,依次经过链霉蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和儿型DNA酶在37℃条件下消化4 h,细胞接种于培养皿内,孵箱内培养,7 d后每周更换培养液2次.将细胞随机分为3组,用整合有人骨形态发生蛋白7基因的腺病毒感染髓核细胞,整合有Lac-Z基因的腺病毒感染的髓核细胞以及末转染的髓核细胞作为对照组.主要观察指标:以反转录-聚合酶链反应和Western-blot的方法在不同水平检测其表达情况,以四甲基偶氮唑盐的方法观察其对细胞增殖能力的影响,以改进的二甲基亚甲蓝色比色法和ELISA法观测人骨形态发牛蛋白7基因转染对细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原能力的影响.结果:鉴定确定入骨形态发牛蛋白7基因为正向插入腺病毒载体,无突变.原代培养的兔髓核细胞形态与文献报道一致.腺病毒载体介导的人骨形态发生蛋白7基因能够高效转染髓核细胞,并表达人骨形态发生蛋白7,同时促进了髓核细胞增殖以及合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原,较对照组有显著性差异(P<0.05).结论:腺病毒介导的人骨形态发生蛋白7基因具有逆转兔椎间盘退变的能力.     

硼替佐米与吡喃阿霉素联合对T细胞淋巴瘤细胞系Hut-78细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨硼替佐米(BTZ)与吡喃阿霉素(THP)联合对人皮肤T细胞淋巴瘤细胞系Hut-78细胞的增殖抑制作用及其机制.方法 不同浓度的BTZ、THP单药或两药联合作用于Hut-78细胞48 h后,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,应用联合指数分析两药是否存在协同效应,在此基础上应用流式细胞术分析细胞周期分布和细胞凋亡情况,利用Western blot法检测细胞周期抑制蛋白P21的变化.结果 BTZ与THP单药对Hut-78细胞增殖具有显著的抑制作用,呈时间和剂量依赖性,两药联合时,BTZ序贯THP组的细胞增殖抑制率显著高于BTZ与THP同时组及THP序贯BTZ组(P值均＜0.01),当细胞增殖抑制率＞50%时,THP序贯BTZ呈拮抗效应,而BTZ与THP同时及BTZ序贯THP则表现为协同效应,随着增殖抑制作用的增加,仅BTZ序贯THP的协同作用更为显著.BTZ与THP单药能有效诱导Hut-78细胞凋亡,呈剂量依赖性,且BTZ序贯THP的细胞凋亡诱导作用较单药显著增强.BTZ单药可使细胞明显阻滞于G2/M期,上调P21蛋白的表达水平,序贯应用THP可显著增强BTZ对细胞周期的阻滞作用.结论 BTZ序贯THP可协同抑制Hut-78细胞增殖并诱导其凋亡,协同机制可能与序贯应用THP增强BTZ介导的P21表达上调及G2/M期细胞阻滞有关,提示BTZ与THP联合可能成为治疗T细胞非霍奇金淋巴瘤的新选择.

Abstract：

Objective To investigate the in vitro effect of bortezomib (BTZ) alone and in combination with pirarubicin (THP) on the growth inhibition of human cutaneous T-cell lymphoma cell line Hut-78.Methods Hut-78 cells were cultured with different concentrations of BTZ or THP alone and the two drugs combination for 48 h. Cell proliferation, cell cycle and apoptosis were evaluated. The cell cycle inhibitor P21 was determined by Western blot. Results BTZ or THP alone significantly inhibited the growth of Hut-78 cells in a time- and dose-dependent manner. In the combination groups, the inhibitory effect of BTZ followed by THP was the highest ( P ＜ 0. 01 ). When the inhibition rate was more than 50%, the combination index analysis showed significant synergistic if treated with BTZ followed by THP or the two at the same time, but antagonistic if treated with THP followed by BTZ. With the inhibition rate increasing, only the synergistic effect of BTZ followed by THP was further increased. The apoptosis rate of BTZ followed by THP was higher than that of single agent each(P ＜0. 01 ). BTZ alone significantly increased the proportion of cells in G2/M phase ( P ＜0. 01 ) in a dose-dependent manner and up-regulated the expression level of P21. Sequential THP notably enhanced BTZ-induced cell cycle arrest and apoptosis. Conclusions BTZ alone effectively induces growth inhibition and apoptosis of Hut-78 cells in vitro. BTZ followed by THP can synergistically enhance this cytotoxic effect. The mechanism may be that THP enhances BTZ-induced G2/M arrest and P21 up-regulation.     

肿瘤坏死因子α诱导人髓核细胞凋亡的作用途径

背景:在与细胞凋亡有关的众多因素中,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成员发挥了重要的作用.但TNF是通过何种途径诱导椎间盘髓核细胞凋亡的机制尚未阐明.目的:探讨TNF-α激活后,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号转导通路中P38MAPK和应激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase,JNK/SAPK)两条途径对人髓核细胞凋亡的作用.方法:体外培养人髓核细胞,将细胞随机分成4组:TNF-α刺激组,P38MAPK阻断组,P-JNK/SAPK阻断组和对照组.采用TUNEL法检测髓核细胞凋亡情况,免疫荧光法检测P-P38MAPK和P-JNK/SAPK的表达及定位:Western Blot法检测P38MAPK,JNK/SAPK及其磷酸化形式的表达.结果与结论:TUNEL法检测凋亡结果中,TNF-α刺激组较其他各组的凋亡细胞密度大(P＜0.01);免疫荧光结果显示TNF-α刺激组P-P38MAPK和JNK/SAPK在细胞质和细胞核的表达高于各阻断组和对照组(P＜0.01);Western Blot结果显示P38MAPK,P-JNK/SAPK在各组髓核细胞内均有表达,但无活化形式,TNF-α刺激组可见P-P38MAPK,P-JNK/SAPK表达,但相应阻断组无表达.结果表明,外源性TNF-α可通过P38MAPK和P-JNK/SAPK途径导致人髓核细胞凋亡.     

体外培养人退变髓核细胞的生物学性状

背景:椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础.目的:观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性.方法:分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达.ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平.结果与结论:体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变.对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势.     

体外培养人退变髓核细胞的生物学性状

背景：椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础。目的：观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性。方法：分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达。ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平。结果与结论：体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变。对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势。     

共同培养骨髓基质干细胞对髓核细胞增殖分化的影响

目的:针对椎间盘退行性变的组织修复目前集中于细胞移植治疗,实验在体外联合培养条件下观察骨髓基质干细胞对髓核细胞增殖分化的影响。方法:实验于2005-12/2006-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和同济医院卫生部重点实验室进行。①实验方法:4月龄健康新西兰大耳白兔3只,麻醉后于髂嵴处作骨髓腔穿刺,抽吸6mL骨髓,分离骨髓基质干细胞;相同实验兔抽取骨髓后立即处死,取腰骶部脊柱之椎间盘,切开纤维环,取出髓核组织,分离椎间盘髓核细胞,同时设立单独髓核细胞培养组。②实验评估:在相同的培养条件下,定期观察两组髓核细胞在光镜下形态学变化及电镜下细胞超微结构的改变;于诱导培养7,14d通过RT-PCR法、Western blot法和免疫组化法法检测两组髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达。结果:①髓核细胞大体形态学及超微结构变化:髓核细胞与骨髓基质干细胞共同培养后,髓核细胞很快就呈现为圆形或多角形,且细胞形体变大、折光性好,贴壁时间早,数量增殖快,超微结构细胞表面可见许多短而粗的微绒毛突起,胞质内有大量扩张的粗面内质网、丰富的线粒体和高尔基体,细胞合成代谢旺盛。单独培养的髓核细胞胞体小,贴壁、增殖慢,细胞器不丰富。②髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白与聚集蛋白聚糖检测结果:RT-PCR和Western blot检测显示诱导培养7,14d骨髓基质干细胞与髓核细胞共同培养组的Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖条带均明显亮于单独髓核细胞培养组,吸光度值比较差异有显著性意义(P<0.01)。免疫组化检测显示骨髓基质干细胞与髓核细胞共同培养组中Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖在细胞胞浆中的表达随时间延长而逐渐增加,2周达到高峰,单独髓核细胞培养组中此两种蛋白表达很低,且培养第7,14天无明显变化。结论:骨髓基质干细胞在体外与髓核细胞共同培养时,能激活髓核细胞并促进其增殖分化,增加髓核细胞外基质的合成。提示骨髓基质干细胞与髓核细胞联合培养有利于退变椎间盘的髓核细胞修复、再生。