抗丙型肝炎病毒5′非编码区核酶在细胞内对病毒翻译启动的抑制作用

目的　研究抗丙型肝炎病毒(HCV)5′非编码区(NCR)双位点213和260核酶(Rz)在细胞内对HCV翻译启动功能的抑制作用.方法　通过脂质体介导的基因转染方法,转染Rz基因和带荧光素酶(luc)的靶基因真核表达载体于人肝癌细胞(HHCC),应用液体闪烁计数仪检测luc报告基因的表达活性.结果　Rz213和Rz260均能在HHCC细胞内有效地抑制luc基历的表达,其抑制率在45%～70%之间,而针对两个不同切割位点的Rz之间无显著差异.结论　我们构建的Rz213和Rz260真核表达载体能在HHCC细胞内表达,并有效地抑制HCV5′NCR介导的翻译启动作用抗丙型肝炎病毒5′…     

丙型肝炎病毒与荧光素酶融合基因细胞模型的初步建立

为了建立易于检测且稳定的丙型肝炎病毒 (HCV)细胞模型 ,利用基因重组技术 ,构建了 HCV c DNA与荧光素酶 (luc)融合基因的可调控逆转录病毒载体 ,通过脂质体介导方法转染人肝癌细胞 (HHCC) ,观察 luc基因的表达活性 .结果表明 :成功地将luc基因融合于 HCV C和大部分 E1区基因下游 ,构建了带 HCV- luc融合基因的真核表达载体 (p BPST- HCV- luc) ;该载体在细胞内有效表达 luc活性 ,puromycin筛选可提高 luc的表达水平 ,并可受四环素调节 .结果说明 :初步建立了表达 HCV C- E1和luc融合基因的可调控细胞模型 ,为以 HCVC- E1为…     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

tRNA~(val)-CTE复合核酶真核表达载体构建

目的构建tRNA^val—CTE复合核酶真核表达载体，为进一步研究打下基础。方法用RT—PCR法扩增CTE DNA；合成含tRNA^val启动子和HCV5-NCIK区195住的核酶以覆内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ序列，通过退火连接到pPUR质粒的BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点之间，构建质粒pPHCV—Rz；用KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切后，将CTE cDNA定向插入表达载体pPHCV—Rz多克隆位点中，构建成重组表达质粒，并用酶切分析和序列测定进行了鉴定。结果酶切鉴定和测序证实tRNA^val启动子和HCV5-NCIK区195住的核酶基因以覆CTE cDNA被正确克隆入真核表达载体pPUK。结论tRNA^val-CTE复合核酶真核表达载体的成功构建，为开展利用tRNA^val-CTE复合核酶切割HCV RNA的研究奠定了基础。     

抗ADAR1锤头状核酶的计算机设计及其可控真核表达载体的构建

目的：选择针对ADAR1 mRNA的5’非编码区(NCR)和翻译起始区的锤头状核酶(ribozyrme，Rz)切割位点，构建针对ADAR1的Rz可诱导真核表达载体，旨在knock down ADAR1基因，开展ADAR1基因功能的研究．方法：应用计算机辅助设计，根据能量最低化原理，以ADAR1 mRNA的5’NCR和翻译起始区为靶序列，预测其二级结构，选择理想的Rz切割位点，设计并合成锤头状核酶．采用亚克隆法首先将人工合成的Rz DNA序列插入原核载体p1.5的XbaI和KpnI位点获得Rz原核表达质粒pRz-613；再将pRz-613中ADAR1Rz基因连同其两端的自剪切Rz序列一起克隆入可诱导真核表达载体pTRE的SacⅡ和EcoRI位点得到真核表达质粒pRz—ADAR1；通过酶切电泳和测序检查质粒重组后序列情况．结果：选出ADAR1 mRNA的第208位为Rz切点，设计并合成了RzDNA序列.所构建的pRz—ADAR1经酶切电泳鉴定显示，插入Rz序列大小约为180kb，和预期结果相同；经测序证实Rz序列正确．结论：利用计算机辅助设计，成功构建了针对ADAR1锤头状Rz可诱导真核表达载体pRz—ADAR1．     

绿色荧光蛋白和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的 :探讨绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)和HCV 5′NCR(noncodingregion)调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达。方法 :用基因重组技术 ,将真核表达载体pCMVNCRLuc的HCV5′NCR及其调控的荧光素酶基因亚克隆至报告载体pEGFP C1的GFP基因下游 ,构建含GFP和HCV 5′NCR调控荧光素酶双顺反子的真核表达载体pGFPNCRLuc。用脂质体基因转染技术 ,将pGFPNCRLuc转染至肝细胞株QSG770 1。结果 :GFP和荧光素酶基因均得到高效表达 ,其荧光素酶表达强度与pCMVNCRLuc比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,GFP表达水平与pEGFP C1比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 :成功构建HCV和HCV 5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体 ,HCV和荧光素酶基因在肝细胞内得到共表达。该结果为特异性抗HCV药物评价系统的建立创造了条件     

丙型肝炎病毒F蛋白对p21基因的调节作用

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白对细胞p21基因转录、表达的影响。方法PCR扩增HCV 1b来源的F基因,克隆至pcDNA3.1真核表达载体。F基因质粒转染HepG2细胞,48h后抽提细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR及Western blot检测p21基因表达变化。结果HCV F蛋白在HepG2细胞内瞬时表达,相对于空载体对照(目标基因表达量为1),HCV F基因质粒转染细胞的p21转录水平为3.2,蛋白表达水平为1.4。结论HCVF蛋白增加p21转录和表达,其生物学效应值得进一步研究。     

抗人组织金属蛋白酶抑制剂1的核酶高表达载体的构建及体外活性鉴定

目的:构建特异性切割人组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases1,TIMP-1)的锤头状核酶的真核表达载体并在体外进行活性鉴定,为应用于瘢痕基因治疗奠定基础.方法:设计并合成针对人组织TIMP-1 mRNA的锤头状核酶基因Rz182、Rz358和Rz412及相应的点突变核酶基因,将核酶基因克隆于可在体内高表达核酶的载体pBSKneoU6中,制备嵌合于U6 snRNA分子的核酶基因克隆.逆转录聚合酶链式反应获得全长TIMP-1 mRNA基因片段并克隆至T载体.体外转录法大量制备以α-32P UTP 标记的核酶及靶RNA,进行体外切割实验.结果:核酶基因克隆制备正确,在体外成功转录出嵌合于U6 snRNA的核酶和靶RNA. 37℃的生理温度下,U6Rz182和U6Rz358成功切割了靶RNA,U6Rz182切割效率为49.23%,Km=29.7 nmol/L,Kcat=0.32 min-1.U6Rz358切割效率为55.21%.Km=39.6 nmol/L,Kcat=0.21 min-1.U6Rz412及突变核酶均未显示切割活性.结论:本研究中制备的U6Rz182和U6Rz358有良好的特异催化切割活性,有望在瘢痕成纤维细胞内抑制人TIMP-1的表达,成为新的抗瘢痕核酸药物.     

HCV 5′UTR调控GFP真核表达质粒的构建及表达

目的构建丙型肝炎病毒5′非翻译区（HCV 5′UTR）调控绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在HepG2细胞中表达。方法通过PCR扩增，获得HCV基因组HCV 5′UTR完整序列及C区序列的部分基因片断。将此片断插入pEGFP-NI载体多克隆位点区，构建受HCV 5′UTR调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒．应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察荧光。结果成功构建受HCV 5′UTR调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达。结论该载体的成功构建，可以用于直观地评价针对HCV 5′UTR的基因药物的效果。     

转染﹀G基因HHCC细胞在裸鼠体内的转移特性

目的　利用转染 βG基因的 HHCC细胞构建裸鼠转移模型 .方法　将 HHCC细胞和转染 βG基因 HHCC细胞体外培养 ,观察细胞形态结构 ,流式细胞仪测定细胞周期 ,并采用裸鼠脾脏种植法对转βG基因 HHCC细胞的转移特性进行研究 .接种后 6 0 d,收集转移灶 ,常规制备光镜片 ,HE染色 .结果　转染βG基因 HHCC细胞内多见颗粒性物质 ,微绒毛及突起增多 ,溶酶体增多 ,内质网及核糖体丰富 ,糖元颗粒堆积 ,某些细胞出现变性、坏死 .转 βG基因 HHCC和 HHCC相比较 ,其细胞周期发生明显改变 ,S期细胞增多 (P<0 .0 5 ) ,G2期细胞减少 (P<0 .0 5 ) ;裸鼠脾脏种植后 6 0 d,发现实验组出现广泛转移在肝、肾、肠系膜淋巴结的肉眼可见的转移灶 ,而对照组仅出现肝内播散 .结论　转染βG基因可增强 HHCC细胞在裸鼠体内的转移能力     

HCV core真核表达质粒pcDNA3.1(-)/core的构建

目的构建HCV core基因真核表达质粒,为进一步研究和解析HCV诱发人不死化肝细胞癌化的机制,HCV感染的检测及疫苗和药物研发做好前期基础。方法将含HCV全长基因的pBRTM／HCV1-3011质粒于大肠杆菌JM109内扩增;提取pBRTM／HCV1-3011质粒;从pBRTM／HCV1-3011质粒中PCR扩增出HCV core片段并将其插入pGEM—T克隆载体;再与表达栽体pcDNA3．1(-)重组,以得到重组的真核表达栽体pcDNA3．1(-)／core;最后限制性酶切鉴定HCV core表达载体。结果从pBRTM／HCV1-3011质粒中扩增出的HCV core片段大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列;凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pcDNA3．1／core内。结论成功的构建了HCV core基因的真核表达载体pcDNA3．1(-)／core。     

RNA干扰抑制肝癌细胞KDR基因表达的实验研究

目的 通过研究RNA干扰(RNAi)对肝癌细胞激酶功能区受体(kinase domain receptor,KDR)基因表达的抑制,为肝癌基因治疗提供理论依据.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测KDR在肝癌细胞系HHCC、HepG2、Hep-6及正常肝细胞L-02的表达情况,筛选KDR高表达细胞株.设计构建针对KDR的靶向小干扰RNA(siRNA)质粒载体,通过脂质体转染高表达细胞株HHCC,观察其干扰效果.细胞计数法观察KDR-siRNA对HHCC细胞生长的影响.结果 酶切鉴定、DNA测序分析证实重组质粒构建成功,分别命名为KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3.荧光定量PCR结果显示:3个KDR-siRNA转染的HHCC细胞株KDR的表达明显受到抑制,抑制率分别为68.86%、82.63%和64.47%,其中KDR-siRNA2抑制作用最为明显;转染阳性和阴性对照组载体的HHCC细胞和未转染的HHCC细胞生长趋势较为一致,且生长速度明显高于转染3种KDR-siRNA表达载体的HHCC.从接种第2天开始,KDR-siRNA转染组与对照组比较,细胞增殖明显受到抑制(P＜0.01).结论 KDR靶向RNAi重组质粒载体能有效抑制肝癌HHCC细胞KDR基因的表达和细胞增殖,为探索KDR介导的肿瘤基因治疗的新途径奠定了实验基础.     

pEGFP-C1-PEX真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓间质干细胞中的表达

目的构建pEGFP-C1-PEX真核表达载体并转染大鼠骨髓间质干细胞(MSCs),观察其在MSCs内的表达。方法用RT-PCR法从大鼠C6胶质瘤细胞中扩增出带有XhoI、BamHI酶切位点的PEX基因片段,将PEX基因片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEG-FP-C1上,通过脂质体将pEGFP-C1-PEX转染入大鼠MSCs。结果pEGFP-C1-PEX真核表达载体构建成功,荧光显微镜下观察,pEGFP-C1-PEX表达载体转染到MSCs24h后可见PEX融合蛋白表达。结论pEGFP-C1-PEX真核表达载体能够在大鼠MSCs中表达PEX融合蛋白。     

绿色荧光蛋白和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的：探讨绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)和HCV5′NCR(noncoding region)调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达。方法：用基因重组技术，将真核表达载体pCMVNCRLuc的HCV5′NCR及其调控的荧光素酶基因亚克隆至报告载体pEGFP-C1的GFP基因下游，构建含GFP和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子的真核表达载体pGFPNCRLuc。用脂质体基因转染技术，将pcGFPNCRLuc转染至肝细胞株QSG7701。结果：GFP和荧光素酶基因均得到高效表达，其荧光素酶表达强度与pCMVNCRLuc比较，差异无显著性（P＞0.05)，GFP表达水平与pEGFP-C1比较，差异无显著性（P＞0.05)。结论：成功构建HCV和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体，HCV和荧光素酶基因在肝细胞内得到共表达。该结果为特异性抗HCV药物评价系统的建立创造了条件。     

反义核苷酸抑制人高迁移率族蛋白1表达对胰腺癌细胞的影响

目的　构建高迁移率族蛋白 1(HMGB1)基因的反义真核表达载体 ,寻找胰腺癌基因治疗新途径。方法应用分子克隆技术构建HMGB1基因反义真核表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1,转染胰腺癌细胞株PANC 1,通过逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、免疫印迹法 (Westernblot)、噻唑蓝 (MTT)比色法检测转染 4 8h后胰腺癌细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化。结果　成功构建 pcDNA3 1/antisense HMGB1反义真核表达载体。所获反义表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1转染可使PANC 1细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低 (P <0 0 1)。反义 pcDNA3 1/antisense HMGB1的导入能有效抑制PANC 1增殖活性 (P <0 0 1)。 结论　应用反义RNA技术阻断HMGB1基因的表达 ,能有效抑制癌细胞的体外增殖活性 ,为基因治疗提供了新思路     

HPV16 E6/E7融合基因真核表达载体的构建

目的构建pEGFP-N1-E6/E7融合基因真核表达载体。方法应用聚合酶链反应技术(polymerasechain reaction,PCR)从SiHa细胞中扩增出人类乳头瘤病毒16型(HPV16)E6/E7基因全长片段,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1上。结果获得了包含全长阅读框架的HPV16E6/E7基因,并成功克隆到真核表达载体中。结论成功构建了pEGFP-N1-E6/E7融合基因真核表达载体。     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的 :构建人NKG2D重组真核表达载体 ,并研究其在COS 7细胞中的表达。方法 :应用RT PCR ,自健康人外周血单个核细胞 (PBMC)中获取NKG2DcDNA ,应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后 ,构建含目的基因的真核细胞表达质粒 ,并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS 7细胞 ,用RT PCR和流式细胞术 (FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果 :重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS 7细胞中获得表达。结论 :成功地构建了重组表达载体pcD NA3.1 NKG2D ,并实现了在COS 7细胞中的瞬时表达 ,为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法：扩增HCV NS5A基因，构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3．1(-)—NS5A；并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：质粒pcDNA3．1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白，共转染实验中pcDNA3．1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3．8倍。结论：构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因，深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的：构建人NKG2D重组真核表达载体，并研究其在COS-7细胞中的表达。方法：应用RT-PCR，自健康人外周血单个核细胞(PBMC)中获取NKG2D cDNA，应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后，构建含目的基因的真核细胞表达质粒，并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS-7细胞．用RT-PCR和流式细胞术(FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果：重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS-7细胞中获得表达。结论：成功地构建了重组表达栽体pcDNA3．1-NKG2D，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。