细胞凋亡显像剂99mTc-膜联蛋白Ⅴ的制备与体内分布

将本室改造的毕赤酵母接入100ml BMGY培养基培养24h,离心收集酵母细胞并重悬于100ml BMMY培养基,每12小时加入终浓度为0.5%甲醇诱导表达具有内在金属螯合位点的突变型人膜联蛋白V。48h后离心沉淀培养基,获得的上清经硫酸氨沉淀、分子筛分离纯化蛋白;SDS-PAGE鉴定其相对分子质量     

细胞凋亡显像剂^99mTc-膜联蛋白V的制备与体内分布

将本室改造的毕赤酵母接入100ml BMGY培养基培养24h，离心收集酵母细胞并重悬于100ml BMMY培养基，每12小时加入终浓度为0．5％甲醇诱导表达具有内在金属螯合位点的突变型人膜联蛋白V。48h后离心沉淀培养基，获得的上清经硫酸氨沉淀、分子筛分离纯化蛋白；SDS—PAGE鉴定其相对分子质量为36000，并测定其纯度为95％。纯化后的蛋白加入终浓度为1mmol／L二硫苏糖醇，37℃保温15min恢复活性，     

膜联蛋白V的异硫氰酸荧光素标记和应用研究

目的 制备一种新型的膜联蛋白V,用异硫氰酸荧光素进行标记,观察它对外露磷脂酰丝氨酸(PS)红细胞的荧光染色情况.方法 带有金属螫合位点的膜联蛋白V通过毕赤酵母的培养和甲醇诱导表达获得,膜联蛋白V粗品通过离子交换和硫酸铵沉淀得到纯化产物.在硼酸盐缓冲液完成膜联蛋白V的异硫氰酸荧光素标记,标记产物经过离子交换进行纯化.红细胞经过戊二醛处理后Ps外露于细胞表面.在荧光显微镜下观察异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V对外露PS红细胞的结合.结果 毕赤酵母重组表达的新型膜联蛋白V经过离子交换和硫酸铵沉淀后得以纯化和浓缩.经过异硫氰酸荧光素进行标记后观察到它对外露PS红细胞的结合.结论 毕赤酵母系统重组表达的膜联蛋白V具有结合外露PS红细胞的能力,可以应用于细胞凋亡的体外检测.     

膜联蛋白Ⅴ的异硫氰酸荧光素标记和应用研究

目的制备一种新型的膜联蛋白Ⅴ,用异硫氰酸荧光素进行标记,观察它对外露磷脂酰丝氨酸（PS）红细胞的荧光染色情况。方法带有金属螯合位点的膜联蛋白Ⅴ通过毕赤酵母的培养和甲醇诱导表达获得,膜联蛋白Ⅴ粗品通过离子交换和硫酸铵沉淀得到纯化产物。在硼酸盐缓冲液完成膜联蛋白Ⅴ的异硫氰酸荧光素标记,标记产物经过离子交换进行纯化。红细胞经过戊二醛处理后PS外露于细胞表面。在荧光显微镜下观察异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白Ⅴ对外露PS红细胞的结合。结果毕赤酵母重组表达的新型膜联蛋白Ⅴ经过离子交换和硫酸铵沉淀后得以纯化和浓缩。经过异硫氰酸荧光素进行标记后观察到它对外露PS红细胞的结合。结论毕赤酵母系统重组表达的膜联蛋白Ⅴ具有结合外露PS红细胞的能力,可以应用于细胞凋亡的体外检测。     

基因工程酵母菌来源的D-氨基酸氧化酶分离纯化

目的以基因工程酵母表达的胞内D-氨基酸氧化酶(DAAO)为原料,通过破细胞,分离纯化DAAO。方法采用机械研磨,反复冻溶,超声波等多种方法破细胞,获得粗酶液,硫酸铵分段沉淀。沉淀透析后,经DEAE Sephadex A-50,DEAE-DE52,Q-sepharose等离子交换柱进行第一步分离,获得的含酶粗品,再经Sephacryl S-100分子筛进一步纯化获得电泳纯的DAAO。结果超声波破壁为最佳的破壁方法,得到的每毫升酶液所含的酶活力是其他破壁方法的两倍以上,最高达到12000U／mL。两步硫酸铵沉淀能粗分DAAO,50％硫酸铵沉淀酶回收率可达85％以上。用Q-sepharose、Sephacryl S-100分子筛柱层析两步纯化,酶活力回收率最高可达90％,SDS-PAGE显示单一蛋白条带。结论本实验方法能得到电泳纯的DAAO,总回收率约为40％。     

突变型人膜联蛋白V的重组表达

目的将人膜联蛋白V基因突变后转化入毕赤酵母重组表达,从培养液中纯化出具有内在金属螯合位点的活性突变型人膜联蛋白V。方法应用特异引物将天然人膜联蛋白V基因的5'和3'端进行突变改造,将突变型膜联蛋白V基因插入到pPIC9K质粒并进行基因测序鉴定。将正确连接的表达质粒线性化后用电穿孔法转化到毕赤酵母GS115中。通过MD平板筛选转化子、BMGY培养基培养、甲醇诱导表达目的蛋白质。培养物经过离心获取上清液,用SDS-PAGE和银染分析蛋白质的表达情况,通过外露磷脂酰丝氨酸的红细胞和异硫氰酸荧光素标记膜联蛋白V测定上清液中突变型人膜联蛋白V的结合活性。结果天然人膜联蛋白V基因5'端融合GCAGGCGGCTGCGGCCAT编码序列,3'端946~948位TGT突变为AGC。毕赤酵母转化子分泌产生相对分子质量为36000的蛋白质,其半数抑制浓度为4nmol/L。结论利用毕赤酵母系统表达出高活性的、具有内在金属螯合位点的突变型人膜联蛋白V。     

人TALL-1基因在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的 研究在毕赤酵母(Pichia Pastoris)系统中人TALL-1基因的分泌表达,获得具有生物活性的重组TALL-1.方法 将人TALL-1基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用Sac Ⅰ将重组质粒线性化,电转化Pichia Pastoris GS115感受态细胞,筛选阳性整合子并进行甲醇诱导表达,采用MTY对表达产物进行初步的生物活性检测.结果 经过诱导表达条件的优化,人TALL-1在酵母培养基BMMY中实现了分泌表达;免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组产物可以结合其特异抗体;生物学活性检测证实其可抑制Hela细胞增殖.结论 在毕赤酵母系统中实现了人TALL-1的分泌表达,具有生物学活性的重组TALL-1分子可以用于进一步的结构与功能研究.     

鼠肾和人肝癌组织中GGT的分离纯化和鉴定

鼠肾（或人肝癌）组织经匀浆，超速离心．ＴｒｉｔｏｎＸ－１００取。硫酸按沉淀，脱氧胆酸钠处理。硫酸铵沉淀，木瓜酶处理后再经硫酸铵沉淀。经ＤＥＡＥ－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ５２离子交换柱层析，ＳｅＰ。ｈａｄｅｘＧ２００凝胶柱层析，最后获得ＧＧＴ的纯制备物，比活性分别为４１７ｕ／ｍｇ（鼠肯）和１５．１ｕ／ｍｇ（人肝癌组织）。经鉴定达到了电泳纯的均质化程度。该纯化程序较其它方法简便、价廉，一般实验室均能开展，可用于哺乳动物组织中ＧＧＴ的分离纯化，特别是分离提纯原发性肝癌组织中的ＧＧＴ。     

99Tcm-annexinV在肺癌化疗评估中的应用

目的制备放射性药物99Tcm-annexinV,评估其在早期预测肺癌化疗效果中的作用。方法通过毕赤酵母重组表达、硫酸铵沉淀和分子筛层析纯化得到annexinV,采用氯化亚锡还原法在annexinV的氨基端标记放射性核素99Tcm,经脱盐柱纯化获得标记产物。采用薄层层析测定99Tcm-annexinV的标记率和放射性化学纯度,外露磷脂酰丝氨酸的红细胞测定99Tcm-annexinV的生物活性。通过在615小鼠腋部皮下接种LA795细胞和组织插块法获得荷肺癌小鼠模型,经腹腔注射环磷酰胺治疗肺癌后6、12、24和48h测定99Tcm-annexinV在小鼠体内的分布情况。结果毕赤酵母工程菌株分泌表达annexinV,经硫酸铵分级沉淀和分子筛层析纯化后annexinV得以有效回收。室温下30min完成anne-xinV的99Tcm标记,标记率为50.2%。99Tcm-annexinV放射性化学纯度为93.9%,其生物活性保存良好。生物分布实验表明,99Tcm-annexinV通过肾脏排泄。615荷肺癌小鼠模型经过环磷酰胺化疗后48h,99Tcm-annexinV在肿瘤组织的摄取达到最高,肿瘤/肌肉放射性摄取率之比为6.34,肿瘤/血液放射性摄取率之比为4.09。结论制备了毕赤酵母来源的99Tcm-annexinV,有可能应用于早期预测肺癌化疗效果。     

Annexin32的酵母表达及免疫原性分析

目的：在毕赤酵母中表达Annexin32并研究其功能。方法：用G418法快速筛选出的9个高拷贝转化子，经平板培养法（MD和MM）及PCR鉴定表型后，分别在BMMY、BMM、MM3种培养基中以甲醇诱导表达，培养上清行SDS－PAGE和Western印迹鉴定，用（NH4）2SO4＋PI法沉淀，过FPLC－Superdex75分子筛纯化蛋白并以此免疫小鼠。结果：有两个表型为Mut^a的高拷贝转化菌表达量较高，以BMMY为优，表达产物有两条带，相对分子质量分别约为3.8万和4万，占分泌总蛋白的80％以上，产物浓度为200－350mg/L。Western印迹证实两条表达产物均具有天然Annexin32分子的免疫原性。动物实验证明，酵母表达的Annexin32的免疫原性明显高于原核表达者。结论：在毕赤酵母中成功表达了Annexin32，为进一步研究打下了基础。