DEN-2分离株E基因部分序列原核蛋白表达

目的 通过构建登革2型病毒(DEN-2)临床分离株(B株)E基因区1-476bp的原核表达载体,进行原核表达,为DEN-2E蛋白功能的研究提供基础依据。方法 将DEN-2B株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-Eb;经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western blot)鉴定表达蛋白;对表达蛋白进行纯化,并滴定对C6/36细胞的细胞半数致死量(TCID50)。结果 成功构建了pET28a(+)-Eb原核表达重组质粒;SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,其相对分子量约为23kDa,表达量约占菌体总蛋白的29%;Western blot表明,该目的蛋白可与DEN-2鼠单克隆抗体结合。用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白,纯度达90%。DEN-2B株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-5.31。结论 pET28a(+)-Eb可在BL21(DE3)菌株中高效表达;DEN-2B株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有明显的细胞毒作用。     

江西省南昌市2011—2019年登革热流行病学特征分析

目的 分析南昌市2011—2019年登革热流行特征,为本地区疫情防控提供科学依据。方法 收集南昌市2011—2019年登革热监测资料进行描述性流行病学分析。结果 2011—2019年,南昌市累计报告登革热病例128例,其中输入性病例67例,本地病例61例,平均发病率0.026 8/10万;除湾里区没有病例报告外,其它8个县、区均有病例报告,其中5个县区报告本地病例;除1、2月份外,全年均有病例报告,病例报告高峰时间为6—10月,占所有病例数的91.41%;病例输入的高峰为6月和8月,占所有输入性病例数的83.58%;本地病例报告高峰为9月,占所有本地病例的78.33%;患者年龄最小4岁,最大84岁,中位数39岁,主要集中在20～49岁,占69.53%;男性75例,女性53例,男女性别比为1.42∶1;职业以家务及待业者最多,达48例（37.50%）;其次为农民22例（17.19%）,商业服务10例（7.81%）,工人8例（6.25%）等;境外输入病例70.18%来自柬埔寨。血清型主要以登革I型为主（97.37%）,无重症和死亡病例。结论 南昌市登革热疫情主要以东南亚输入并引起本地暴发流行;加强来自东南亚疫区入境人员的健康教育和本地区媒介伊蚊的监测和控制,对控制登革热疫情有重要意义。     

登革2型病毒B株E基因部分序列原核蛋白表达及单克隆抗体制备

目的 通过构建登革2型病毒B株E基因区1～476 bp的原核表达载体,进行原核表达,并制备单克隆抗体,为研制登革病毒诊断试剂奠定基础.方法 将登革2型病毒B株E基因序列克隆入原核表达载体pET28a(+),构建原核表达重组体pET28a(+)-E,将重组表达载体转化BL21(DE3)菌株进行原核表达.纯化后的蛋白免疫B...     

首次从深圳市登革热患者血清中分离到一株登革4型病毒

目的:对深圳市2005年登革热病原体进行分离鉴定.方法:采用酶链免疫吸附试验法和胶体金免疫层析法检测登革热疑似患者血清中的特异性IgM和IgC抗体.用C6/36细胞对早期病例血清进行病毒分离,以MGB荧光PCR方法鉴定.用逆转录-套式PCR方法对其进行型别鉴定.结果:从8份标本中成功分离到一株登革病毒,经逆转录-套式PCR方法鉴定为登革4型病毒,将其命名为DEN4-SZ0524.结论:首次从2005年登革热患者血清中分离到一株登革4型病毒,为进一步研究和控制该地区登革热提供了科学依据.     

183例登革病毒IgM抗体检测结果分析

目的了解登革热病人发病后检测登革病毒IgM抗体取血时限。方法利用临床医生报告的临床确诊病例进行流行病学个案调查,比较发病后不同采血时限登革病毒IgM抗体检出率。抗体检测采用ELISA法。结果183例临床确诊病人血检登革病毒IgM抗体有135例阳性,48例阴性,总检出率为73.77%。患者最早产生登革病毒IgM抗体的时间是在发病后第1d。以发病后取血时限分类比较,取血时限≤3d51例,检出18例,检出率为35.29%;取血时限在发病第4d22例,检出18例,检出率为81.82%;取血时限≥5d110例,检出99例,检出率为90.00%。经统计学处理,取血时限≤3d与≥5d比较检出率有显著性差异;取血时限在发病第4d与≥5d比较检出率无差异。结论对疑似登革热及登革出血热病人进行早期诊断,检测IgM抗体以发病第4d后取血为宜。     

首次从福建省登革热患者血清中分离登革Ⅰ型病毒

[目的]查明2004年夏秋季福州市部分地区发生疑似登革热暴发流行的病原。[方法]采用C6/36细胞对患者血清标本进行病毒分离,应用免疫荧光、RT-PCR方法进行鉴定。[结果]从27份患者血清标本中分离出16株病毒,经鉴定为登革Ⅰ型病毒。[结论]福州市本次暴发流行由登革Ⅰ型病毒所致,系福建省首次从暴发流行患者血清中分离出登革Ⅰ型病毒,为登革热流行的防治提供科学依据,同时对进一步研究其流行特点和诊断试剂奠定了基础。     

登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究

目的 为了对2004年浙江省报告的输入性疑似登革热病例查明病因，从分子水平分析流行毒株的生物学特征，追踪传染源，为疾病的预防控制提供实验室依据。方法 对疑似患者血清标本采用ELISA、IFA和荧光RT—PCR方法分别检测登革病毒IgM、IgG抗体和病毒核酸，并用C6／36和BHK-21细胞分离登革病毒。采用RT—PCR方法扩增病毒E基因和NS1基因后分别进行序列测定，并与不同国家和地区的登革热毒株进行同源性和进化树分析。结果 从患者血清中检测到登革病毒IgM、IgG抗体和登革2型病毒核酸，并分离到登革2型病毒；浙江省登革2型病毒分离株（ZJ／01／04）与登革2型国际标准株Jamaica、国内Fujian／10／99株和Saudi／92株在E基因上氨基酸的同源性分别为97．1％、99．2％和99．6％，而与登革1、3、4型毒株相同区域氨基酸同源性分别为68．7％、66．9％和63．6％。基因进化树显示ZJ／OI／04分离株与Saudi／92株亲缘关系最近，在进化树的同一分支上。结论 从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该输入病例是由登革2型病毒引起，该毒株最有可能来源于沙特阿拉伯。     

2018年广州市输入型登革病毒3型基因组全序列测定和特征分析

目的 分析广州市2018年输入型登革热病毒3型（DENV - III）毒生物学来源,为本地登革热防控提供科学依据和基线数据。方法 通过传染病监测网络收集广州市2018年输入型DENV - Ⅲ病例,对患者急性期血清进行病毒分离培养、全基因组测序、系统发生树重建和生物信息学分析。结果 共分离到4株DENV - Ⅲ型毒株,株间核苷酸（氨基酸）同源性为91.8%～97.3%（97.6%～99.4%）;泰国输入的分离株属于G - I型,与印度尼西亚2016年分离株的距离最近;其余3株分离株属于G - Ⅲ型,在进化树上处于同一分支,分别与老挝、巴基斯坦和新加坡分离株的距离最近;经过比对,4株分离株和13株参考株的E蛋白区域有18个氨基酸位点出现替换,NS1蛋白区域有7个氨基酸位点出现替换,NS5蛋白区域有21个氨基酸位点出现替换。结论 广州市2018年输入型DENV - Ⅲ毒株分属于2个不同的基因型亚群,在进化上距离较远,抗原性差异较大;通过全基因组测序和特征分析,逐步完善周边地区的病毒特征信息,为防控工作提供生物学溯源依据,具有重要意义。     

广州市首次出现两个血清型登革热流行

1991年4～11月,广州市发生了两个血清型别的登革热流行,病例数258例,发病率4.35/10万;死亡3例,病死率1.17%。前期以散发的登革Ⅳ型为主,后期呈局部性登革Ⅰ型病毒流行。在分离到的51株登革病毒中,登革Ⅰ型病毒45株,Ⅳ型6株。123例双份血清补结试验结果表明,有74例恢复期血清抗体滴度≥4倍升高,其中Den-1为60例,Den-4为14例。DHF/DSS病例占9.67%。实践证明,广州市对登革热流行采取的预防监测系统的控制措施,已达到监测散发病例的水平,两个血清型别的流行在国内尚属首次。     

广东省流行的3株登革热2型病毒基因组全序列测定及分析

目的测定广东省3株登革热2型病毒的全序列,探讨其来源及基因型。方法运用RT PCR法扩增来自广东省的登革热2型GD09/93、GD05/98和GD19/2001病毒株的全序列,采用遗传距离法构建进化树。结果3株登革热2型病毒的全基因组长度均为10 723 nt,5′及3′端各有一非编码区,结构基因和非结构基因位于基因组97~10 269 nt之间,共编码3391个氨基酸,读码结构完全相同。GD05/98与GD09/93、GD05/98与GD19/2001、GD09/93与GD19/2001之间的碱基序列同源性分别为93.3%、92.4%和97.6%,氨基酸序列同源性分别为96.7%、96.5%和98.5%。结论3株登革热2型病毒均对乳鼠致病,与对乳鼠不致病的参考株（DEN2-04株）比较共有18个氨基酸位点的差异引起极性或电荷变化,PrM-134、NS2A-153、NS4B-102所带电荷的变化对抗原性影响较大。GD05/98株与泰国分离株同为Ⅱ基因型,GD09/93和GD19/2001株与印度尼西亚、澳大利亚、台湾株分在Ⅳ基因型;表明我国登革热2型病毒有不同的基因型,而不同时期也存在同一种基因型传播。     

深圳市大鹏新区首发登革热病例的分子病毒学分析

[目的]对深圳市大鹏新区首例疑似登革热病例的病原体进行分析及型别鉴定,从分子水平对病毒的生物学特征进行研究,以追溯病毒的地域来源.[方法]采用实时荧光RT-PCR方法对采集的疑似登革热患者血液样本进行登革病毒核酸检测及分型鉴定.扩增E基因并进行序列测定,与国内外不同地区登革热病毒株进行同源性比较和遗传进化分析.[结果]...     

云南边境地区登革1型病毒非结构蛋白编码区序列测定及进化分析

登革病毒有4个血清型,可引起登革热和登革出血热/登革休克综合征.登革病毒包括5'和3'非编码区(UTR)及一个单一的开放阅读框(ORF),该ORF编码一个聚蛋白前体,经蛋白酶裂解加工成3种结构蛋白(C、PrM和E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1].     

云南边境地区登革1型病毒非结构蛋白编码区序列测定及进化分析

登革病毒有4个血清型,可引起登革热和登革出血热/登革休克综合征.登革病毒包括5'和3'非编码区(UTR)及一个单一的开放阅读框(ORF),该ORF编码一个聚蛋白前体,经蛋白酶裂解加工成3种结构蛋白(C、PrM和E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1].     

云南边境地区登革1型病毒非结构蛋白编码区序列测定及进化分析

登革病毒有4个血清型,可引起登革热和登革出血热/登革休克综合征.登革病毒包括5'和3'非编码区(UTR)及一个单一的开放阅读框(ORF),该ORF编码一个聚蛋白前体,经蛋白酶裂解加工成3种结构蛋白(C、PrM和E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1].     

广州市2019年登革热确诊病例空间聚集性及登革病毒E基因进化特征分析

目的:分析2019年广州市登革热流行情况,评估登革病毒4种血清型对流行的影响。方法:在传染病报告信息管理系统中收集2019年广州市登革热确诊病例信息,使用ArcGIS 10.2软件进行空间自相关性和聚集性分析,使用荧光定量PCR对血清标本进行核酸检测,将结果为阳性的血清标本进行病毒分离并测定E基因序列,用PhyML 3...     

深圳登革热患者血清中2型病毒株的分离鉴定

目的:对深圳市2004年-2006年登革热病原体进行分离鉴定。方法:采用酶链免疫吸附试验和胶体金免疫层析法检测疑似登革热患者血清中的特异性IgM、IgG抗体。用C6/36细胞对早期病例血清进行病毒分离,以MGB荧光PCR方法鉴定。并用逆转录-半套式PCR(RT-semi-nested-PCR)方法和荧光PCR方法对其进行型别鉴定。结果:从10份抗体阳性的病人血清标本中成功分离到一株登革病毒,经鉴定为登革2型病毒,将其命名为DEN2-SZ0521。结论:首次从深圳市登革患者血清中分离到一株登革2型病毒,为进一步研究和控制该地区登革热提供了科学依据。     

2017-2019年登革病毒NS1抗原阳性预测值及影响因素分析

目的 评价NS1抗原阳性预测值在登革热病例监测中的应用价值,为登革热病例早诊断、早隔离提供科学依据,为疫情防控争取黄金时间.方法 对2017-2019年中山市登革热病例监测数据开展描述性流行病学分析,采用二分类logistic回归分析NS1抗原阳性预测值的影响因素.登革病毒NS1抗原检测方法为胶体金法和ELISA法,复...     

登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增

目的采用长链RT—PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株（NGC）全长基因组。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列设计引物，在上游引物中加入Sp6RNA聚合酶启动子核心序列，下游引物中加入Cla Ⅰ内切酶位点。从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术进行扩增。以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段。结果长链RT—PCR法扩增出约11kb基因片段，经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列。结论通过长链RT—PCR技术，获得了登革2型病毒NGC株全长基因组，为进一步构建感染性克隆打下基础。     

2008年柯萨奇病毒A组1 6型北京地区分离株全基因组序列分析

中国近年的手足口病(HFMD)流行中呈柯萨奇病毒16(CA16)和肠道病毒EV71交替或共同流行的趋势,目前GenBank数据库中CA16全基因组序列较少,本研究对北京地区2008年的1株CA16全基因组序列进行测定.