用PCR-SSP技术检测弱D型RHD基因1例

RhD抗原(ISBT004.001;RH1)是一种由RhD蛋白携带的非常重要的血型抗原,是引起新生儿溶血病的最主要原因［1］。极少数人红细胞的D抗原表达数目减少,被称之为弱D(以前叫作DＵ),在白种人中的比例为0.2%～1%,在黄种人中的比例则更低。一部分弱D被解释为RhD蛋白的质的变化,称之为部分D,通常是由RHD／RHCE杂化基因引起,另一部分弱D是由Cde单倍体反式位置的抑制作用引起,这些弱D可能有正常的RHD基因,其RhD抗原表达只是微量减少,被宽松地称之为高级DＵ,现在常被定为正常的RhD。最近笔者发现1名供血者红细胞为弱D型,且实验结果显示弱D型具有独特的基因结构,现报告如下。 1 对象与方法 1.1 研究对象献血者,男,21岁,汉族,在校学生,来本中心献血时被确定为弱D;阴阳性对照血样亦均取自本中心献血者,民族为汉族。 1.2 序列特异性引物针对RHD和RHCE基因之间最具差异的区段设计多对不同引物,特异性地扩增RHD基因的第2～7,9,10外显子和RHCE基因的第1,2,4,5外显子,以及RHD和RHCE基因的第4内含子(表1)。另以人类生长激素(HGH)基因序列特异性引物作为内对照引物,扩增片段为429bp(以上引物均由美国G&T公司合成、纯化及鉴定)。 1.3 基因组DNA的制备使用美国G&T公司基因组DNA抽提试剂盒,采用盐析法从供血者外周血分离获得。0.3ml EDTA抗凝外周血加入1 ml红细胞裂解液,离心弃上清,沉淀加入170μl核裂解液及4μl SDS,剧烈振荡,再加入72μl NaCl溶液,10000r/min离心5min,取上清加入210μl异丙醇沉淀DNA,将DNA溶于100μl TE溶液中,保存待用。 1.4 特异性PCR扩增反应体系11μl,含1μl DNA,8μl引物混合物,1U Taq酶。扩增条件为95℃预变性5min,95℃变性30s,60℃退火30℃s,72℃延伸90s,30循环。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测,电泳时间为25min。     

38例血清学弱D表型献血者RhCcEe表型与RHD基因型检测情况分析

目的研究深圳地区血清学弱D表型献血者RhCcEe表型与RHD基因型特点。方法收集38例献血者血液样本,抗-D抗体(IgM/IgG)检测RhD抗原。采用IgM抗-C、抗-c、抗-E、抗-e抗体检测RhCcEe抗原。利用PCR-SSP方法分析RHD基因10个外显子,必要时对RHD基因的所有外显子进行直接测序。统计学方法分析RhCcEe表型与RHD基因型之间的相关性。结果 38例血清学弱D表型献血者中发现8种已报道的等位基因,RHD*weak partial 15(15/38)、RHD*DEL1(11/38)、RHD*DVI.3(5/38)、RHD*weak D type 61(1/38)、RHD*weak D type 95(1/38)、RHD*DCC(1/38)、RHD*DFR1(1/38)、RHD*weak D type 50(1/38)、RHD*weak partial 15 / RHD*DEL1杂合(1/38)。其中RHD*weak D type 50在中国汉族人群中首次报道。另外,发现了1例新的RHD等位基因RHD*IVS9-1C(c.1228-1GC)。该等位基因的序列数据已提交GenBank,登记号为MT755965。经相关性分析,RHD*weak partial 15与RhE抗原相关系数为0.727(P0.01),RHD*DEL1与RhC抗原相关系数为0.645(P0.01)。结论深圳地区血清学弱D表型献血者的RHD基因结构呈现多态性,主要为RHD*weak partial 15、RHD*DEL1、RHD*DVI.3,并存在其他稀有的基因型;RHD*weak partial 15与RhE抗原、RHD*DEL1与RhC抗原存在显著正相关。     

D抗原阳性个体及无效等位基因携带者RHD基因数目测定

目的　测定Rh血型D抗原阳性个体的RHD基因数目。方法　采用聚合酶链式反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)技术 ,扩增 10名D阳性、5名弱D、2 5名Del表型和 12名携带无效等位基因的Rh阴性个体的RH基因座位下游盒子和融合盒子序列 ,产物经DNA限制性内切酶PstI消化后电泳 ,以 5份经血清学和序列分析基因分型方法确认的D阴性样本作为RHD-/RHD-纯合子对照 ,鉴定RHD+ /RHD+ 或RHD+ /RHD-基因型。结果　 10名D阳性个体均为RHD+ /RHD+ 纯合子、5份弱D样本及 12名携带无效等位基因的Rh阴性个体全部为RHD+ /RHD-杂合型。 2 5名Del表型个体中 9人为RHD+ /RHD+ 纯合型 (36 % ) ,其中 6人Rh表型为DCCee、3人为DCcee ;另 16名Del个体为RHD+ /RHD-杂合型 ,Rh表型均为DCcee。结论　D阳性个体RHD+ /RHD+ 纯合型多见 ,弱D型个体以RHD+ /RHD-杂合型为主 ,在Del表型个体存在高比率的RHD+ /RHD+ 纯合型 ;携带无效等位基因的个体多为RHD+ /RHD-杂合型     

48例D变异型基因背景研究

目的 明确48例D变异型标本的RHD遗传背景.方法 收集2020年7月～2021年7月送检苏州市中心血站和徐州市中心血站进行RHD血型确认的献血者和患者标本,D抗原盐水法阴性或弱阳性、间接抗人球蛋白试验至少有一种抗-D结果为阳性者鉴定为D变异型,提取D变异型标本的基因组DNA,采用PCR-SSP方法对标本RHD基因型进...     

1例Rh弱D15型基因型分析

Rh血型系统是目前被国际输血协会确认的30个红细胞血型系统中最具复杂性和多态性的血型系统,在临床输血中的重要性仅次于ABO血型.RhD抗原表型除正常D阳性和阴性表型外,还存在多种D变异型.D变异体主要包括弱D(weak D)、部分D(partial D)和DEL型[1].为避免在血清学上RhD变异体被误定Rh阴性,采用DNA基因分型技术鉴定D变异型变得越来越重要.     

无偿献血者弱D61标本基因分析

目的 对本市献血者中筛查到的1例D^el标本进行基因检测,分析造成其血清学表型的分子基础。方法 献血者EDTA抗凝血分离白膜层提取核酸用于基因分型和外显子编码序列分析,红细胞用于血清学检测,采用试管法和微柱凝胶法做血清学分型,采用基因分型试剂盒做基因分型,通过测序分析基因编码的外显子多态性,确定基因突变的位点或类型。结果 血清学检测结果本例标本RhD表型为D^el,RhCE表型为CCEe,荧光定量PCR结果显示本例标本RHD编码基因外显子均为阳性,排除弱D15和RHD^*DEL1[RHD(1227G>A)],RHD编码基因外显子序列分析结果显示,该标本在外显子编码序列的第28位发生点突变,为弱D61,基因型为RHD^*01 W.61[RHD(28C>T)]。结论 在本市无偿献血者中发现1例弱D61。     

一例RHD960A/1227A基因型的D变异型患者的血型鉴定及其家系分析

目的准确鉴定携带D变异型合并亚洲型DEL个体的血型。方法采用常规血清学方法对1名临床常规血型检测为RhD阴性、其父母皆为RhD阳性的先证者及家系成员做RhD血型鉴定,使用D-Screen试剂盒检测该例D变异型标本的RhD抗原表位;提取基因组DNA,采用MLPA基因分型方法和Sanger测序法对该例D变异型标本做RHD基因型分型。结果先证者血清学鉴定:D变异型,基因分型:RHD^*960A/RHD^*1227A(RHD^*960A/01EL.01);其父亲携带RHD^*1227A等位基因、其母亲携带RHD^*960A等位基因。结论携带RHD^*1227A等位基因(亚洲型DEL)个体不会在免疫刺激下产生同种抗-D,表现为D变异型;基因型鉴定及分析可为这种患者输血安全及这种孕妇产前检测提供准确的依据。     

中国人群中发现的主要弱D型——弱D15个体的分子背景研究

为了探讨中国汉族人群弱D15型个体的Rh血型系统血型血清学表型及分子背景，采用常规血型血清学技术检测RhD抗原弱阳性个体RhD、C、c、E、e抗原表型；采用序列特异性引物-聚合酶链反应（SSP—PCR）方法同时检测RHD基因和RHCE基因；标本测序分析RHD基因全长编码区序列；同时通过特异性PCR技术测定RHD合子型或RHD基因数目。结果表明，血型血清学试验证实为D抗原弱阳性表型的人群中，有18例为弱D15型（占D抗原弱阳性表型56％），RHD基因全长编码区序列分析发现其第6外显子有一处碱基突变：845G〉A，编码区序列其它部分与正常RHD序列相同；检测Rh小因子有3种表型CcEe（2例）、CcEe（2例）、ccEe（14例），分别占弱D15型的11％、11％、78％，血清学检测结果与分子生物学检测结果一致。RHD杂合性试验鉴定显示仅表型为CcEe的2例标本为纯合型RHD^＋／RHD^＋，提示基因型为DCe／DcE；其余为杂合型RHD^＋／RHD^-，提示基因型分别是DCe／dce和DcE／dce。结论：弱D15型是中国人群中最主要的弱D型，其中大部分为杂合型。     

PCR技术检测弱D15型

目的　探讨采用DNA技术鉴定弱D15型。方法　根据文献和GenBank报道的基因序列 ,针对弱D15型基因 ,设计一对特异性引物 ,并引入一对内对照引物 ,建立简易的聚合酶链式反应 (PCR)技术检测弱D15型 ,之后用于检测 10份Rh阴性、10份Rh阳性、10份Del样品和 1例弱D15型DNA样品。结果　除 1例弱D15型样品检测为阳性外 ,其余均为阴性 ,显示PCR特异性检测弱D15型基因。结论　PCR方法简便、快速 ,能准确鉴定弱D15型 ,可用于临床常规实验室     

1例新的弱D型的鉴定

目的分析1例新的Rh血型弱D型个体的RHD等位基因及其红细胞D抗原表位。方法采用常规血清学方法检测Rh血型D、C、c、E和e抗原表型,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认D抗原,并分析D抗原表位;序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)测定RHD基因,然后分析RHD编码区全长序列,并检测RHD杂合型。结果血清学显示该个例为D抗原弱表现型,Rh因子为D+C+c+E-e+,PCR-SSP检测RHD基因显示与正常Rh(D)阳性对照相同。RHD编码区序列分析发现第9外显子存在1 212C>A碱基突变,其余外显子序列则与正常RHD基因一致(GenBank EF103573),RHD合子型鉴定为RHD+/RHD-杂合型,提示该个体基因型为CDe/cde。红细胞D抗原表位分析显示其具有基本完整D抗原表位。结论该个例为RHD1 212C>A碱基突变形成弱D72型。     

1例弱D24型的血清学表型与分子背景研究

目的分析鉴定1名RhD抗原弱阳性个体的血型血清学表型及分子背景。方法对1名常规RhD血型初筛为阴性的无偿献血者,采用间接抗球蛋白试验检测D抗原,并用常规血清学方法检测其RhC、c、E、e抗原表型;采用特异性PCR技术测定其RHD合子型,并作RHD基因全长编码区10个外显子序列测序。结果血型血清学鉴定该个体存在有弱的D抗原,其他Rh血型抗原为ccEe;RHD合子型为D/d;对RHD基因10个外显子的测序结果显示编码区存在1 013 T>C的突变,证实该个体为弱D24型。结论中国人群中的弱D型有待于进一步的发现和研究。     

1 例RHD*weak D type 72 患者的血型鉴定及家系RHD 基因序列分析

目的 研究1 例RhD 血型鉴定部分凝集结果个体及其家系血清学表现和RHD 基因。方法 通过血型微柱凝胶卡检测先证者ABO 及RhD 血型;盐水试管法检测先证者及其父母RhCcEe 抗原;间接抗人球蛋白试验(indirect antihumanglobulin test,IAT) 及流式细胞术检测先证者RhD 抗原。PCR 序列特异性引物(PCR sequence specific primer, PCRSSP)检测RHD 基因以及RhD 杂合型分析,基因测序方法分析RHD 基因编码区序列。结果 血清学检测发现先证者血型为A 型RhCcee,血型微柱凝胶卡、盐水试管法以及IAT 法检测RhD 抗原,结果呈部分凝集现象。流式细胞术结果显示先证者RhD 抗原性减弱。经RHD 基因编码序列分析发现,RHD 基因第9 外显子上的第1212 位碱基发生C ＞A 纯合突变,为RHD*weak D type 72 的特征性突变点。家系调查显示,先证者父亲为O 型RhCCDee,母亲为A 型RhCcDee。父亲携带RHD*weak D type 72 等位基因,基因型为RHD*weak D type 72 / RHD+;母亲一条染色体缺失了全部的RHD 基因,基因型为RHD+/ RHD-。证明先证者分别从父亲和母亲遗传RHD*weak D type 72 和RHD-等位基因,基因型为RHD*weak D type 72 / RHD-。结论 发现了1 例RHD*weak D type 72/RHD-基因型个体,丰富了RHD*weakD type 72 变异型的研究数据。根据家系调查证明,RHD*weak D type 72 等位基因由遗传获得,而非由个体基因变异形成。     

人类RHD基因及RhD蛋白的研究进展

人类RHD基因及RhD蛋白多态性均较强,在输血医学中的重要性仅次于ABO血型抗原.RhD蛋白具有很强的免疫原性,能够引起新牛儿溶血病和溶血性输血反应.RhD蛋白存在多种变异体,主要包括弱D、不完全D和Del型.本文就人类RHD基因、RhD蛋白及其变异体的相关内容作一综述.     

DEL型个体抗体筛选的调查分析

目的探讨DEL型个体是否对D抗原产生体液免疫应答。方法对经间接抗球蛋白试验确认为Rh(D)阴性的1030名献血者和89名孕妇做抗体筛选,对抗体筛选为阳性的献血者用10个O型谱细胞和筛选特异细胞做抗体鉴定。对产生抗-D的Rh(D)阴性献血者和孕妇用DEL特异性引物鉴定检测DEL型;对117名Rh(D)阴性献血者以吸收放散试验检测DEL型,对DEL阳性的献血者做抗体筛选。结果10名献血者和5名孕妇产生抗-D,他们的DEL基因分型均为阴性;117名Rh(D)阴性献血者DEL吸收放散试验检测阳性24名,并且抗-D阴性。结论在产生抗-D的个体中未检出DEL型,在DEL型的个体亦未检出抗-D。     

华北地区汉族人群Rh(D)抗原弱表现型个体的分子遗传机制研究

目的探讨汉族人群非血缘关系Rh(D)抗原弱阳性个体的血清学表型及分子遗传机制。方法采用常规血清学技术从非血缘关系随机献血者中筛检Rh(D)抗原弱阳性个体(包括弱D型、部分D型),对其进行Rh D、C、c、E、e抗原表型的检测;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法同时检测其RHD基因和RHCE基因;测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定其RHD合子型。结果血清学试验证实为D抗原弱阳性表型的有32例个体,占无关供者人群比率为0.015%,其中18例个体为弱D15型(845G>A),1例为弱D12型(830G>A),1例为携带DEL等位基因(1227G>A)的弱D型,8例为部分D表型中的DⅥⅢ型(RHD-CE(3-6)-D),1例为部分D表型中的DⅤa(Hus)(RHD-CE(5)-D),3例标本10个外显子检测均未见异常。Rh小因子检测有3种表型CcEe(4例)、Ccee(10例)、ccEe(18例),其血清学与分子生物学检测一致。RHD杂合性试验鉴定显示仅4例标本为纯合型RHD+/RHD+,其余为杂合型RHD+/RHD-。结论汉族人群D抗原弱阳性比率明显少于高加索人,汉族人群D弱表现型中,弱D15型频率最高;部分D的弱表现型中,DⅥⅢ型占主要比例。     

中国人中发现2种新的弱D型

目的 鉴定并确认在中国人中发现的2种新的弱D型.方法 对2份从上海市血液中心无偿献血者血样中筛查出的RhD抗原减弱的标本,采用常规Rh分型试剂对其作血清学分型,使用D-screen试剂盒分析其RhD抗原表位;对RHD基因全部外显子测序并分析杂合性,使用PCR-SSP方法对新的弱D型作基因分型.结果 在2名弱D型献血者中分别发现2种新RHD等位基因:RHD(R10P)和RHD(A414V);D抗原表位分析结果与弱D表型相一致.建立了测定新等位基因的PCR-SSP检测方法.结论 在中国人群中发现了2种新的弱D型,初步阐明了这2种弱D表型的分子机制.     

RhD阴性患者输注“亚洲型”DEL型红细胞短期内引起高效价抗-D的同种免疫研究

目的 通过对1例RhD阴性患者输注“亚洲型”DEL红细胞后诱发同种抗-D免疫的研究分析,探讨RhD阴性患者输注DEL型策略。方法 采用血清学方法进行ABO及Rh系统血型抗原检测、不规则抗体筛查及鉴定,高分辨熔解曲线和基因测序分析检测DEL型的RHD基因分型。结果 受血者为O型,RhD阴性。供血者为RHD 1227G>A突变的“亚洲型”DEL,R h表型为Ccee。受血者输血后抗体筛查阳性,并鉴定为抗D和抗C,抗D效价512,抗C效价128。结论 RhD阴性患者输注“亚洲型”DEL红细胞会引起抗-D同种免疫。因此对于RhD阴性献血者应加强DEL型的筛查,必要时可以增加RHD基因检测以保障输血安全。     

江西地区RhD阴性个体的RHD基因与RhCcEe抗原的表达分析

目的调查江西地区RhD表型确认为阴性者的RhCcEe表型与RHD基因型间的关系,确认RHD基因的外显子模式对RhCcEe抗原表达的影响。方法血清学直接凝集法检测D、C、c、E、e抗原,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认RhD阴性血型,对IAT确认为RhD抗原阴性的样本,随机抽取111例,使用PCR-SSP法行RHD基因分型。结果 464例标本中,确认为RhD阴性者451例(97.1983%),RhD变异性13例(2.8017%),111例确认RhD阴性的标本中,共检出六种RHD基因型,包括RHD(-)5例,RHD-CE(2-9)-D 71例,DVI III 1例,DEL RHD1227A 12例,弱D152例,RHD(+)20例,血清学上,111例标本中共检出ccee61例(54.96%),Ccee36例(32.43%),CCee8例(7.21%),CcEe和ccEe各3例(2.70%)。结论 RhD阴性人群中RHD基因序列的不同影响RHCcEe各表型的表达。     

献血者弱D型8例

笔者2000年1月~2005年2月对本中心247273名献血者进行了Rh阴性筛选及确认,报告如下。1材料与方法1.1试剂单克隆抗-D(Ig M、IgG、Ig M IgG类)、抗-C、-c、-E、-e血清、筛选细胞、抗球蛋白试剂、酶试剂(上海输血技术有限公司),聚凝胺(台湾BaSo公司),进口单克隆抗-D(Ig M IgG类)血清(美国I mmuncor公司、加拿大Dominion公司及荷兰Sanquin公司)。1.2微量法筛选96孔U型微量板中加入5μl抗-D,取适量献血者红细胞,或用STAR自动加样仪(瑞士Microlab)加样(30μIg M抗-D加30μl8%的红细胞盐水悬液),5~10min观察结果,并做阴阳性对照。1.3…     

在中国人群中首次发现1例Rh血型弱D12型

目的分析鉴定1名RhD抗原弱阳性个体的血型血清学表型及分子背景。方法采用常规血型血清学技术检测Rh D、C、c、E、e抗原表型;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)方法同时检测RHD基因和RHCE基因,并测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定RHD合子型或RHD基因数目。结果血型血清学试验证实该标本为D抗原弱阳性表型,与相应Rh抗血清反应为C-c+E+e+;SSP-PCR检测显示RhCcEe基因定型结果与血型血清学完全一致,且有完整的RHD基因;但RHD基因全长编码区序列分析发现该标本的RHD第6外显子存在1处碱基突变:830G>A,编码区序列其它部分与正常RHD序列相同;RHD杂合性试验鉴定显示为RHD+/RHD-杂合型,推测该个体基因型可能为DcE/dce。结论对照国内外文献报道和GenBank记录的基因序列,该个例为在中国人群中首次发现的弱D12型。