阿萨希毛孢子菌抗氧化酶活性研究

目的观察和测定44株不同来源阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)抗氧化酶活性。方法收集44株不同来源T.asahii,将其分为环境组(3株)、临床组(9株)、体内传代组(20株)和体外耐药组(12株),分别用羟胺法和可见光法测定其抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,并进行比较和分析。结果环境组:SOD酶活性均值为(4.01±0.66)U/mgprot,CAT酶活性均值为(48.51±7.60)U/mgprot;临床组:SOD酶活性均值为(10.45±3.87)U/mgprot,CAT酶活性均值为(110.56±35.77)U/mgprot;体内传代组:至传代第5代,菌株SOD酶活性均值为(8.65±4.15)U/mgprot,CAT酶活性均值为(71.36±12.19)U/mgprot;耐药组:至诱导末期第10代菌株SOD酶活性均值为(8.02±1.56)U/mgprot,CAT酶活性均值为(80.43±8.92)U/mgprot。结论 T.asahii具有较强的抗氧化能力。不同来源T.asahii抗氧化能力不同,主要体现在抗氧化酶活性的不同。其中,临床组菌株抗氧化能力最强,体内传代组菌株和体外耐药组菌株次之,环境组菌株最低。     

阿萨希毛孢子菌脂筏的观察

目的了解阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii,zasahii）菌丝生长与脂筏（rapidlifts）的关系。方法用荧光染剂Filipin对YPD液体培养基培养后的zasahii进行荧光染色,在荧光显微镜下观察染色结果;在菌悬液中分别入入不同浓度的两性霉素B（0．2、0．5、1、2μg／L）进行干预并荧光染色,对比观察干预前后菌丝的生长变化。结果Zasahii芽管、假菌丝以及菌丝顶端和分隔部位可见到Filipin荧光聚集;经不同浓度两性霉素B干预后,Zasahii生长受到不同程度的抑制,随着两性霉素B浓度的增加Zasahii的生长抑制越明显,顶端和隔膜部位荧光消失,而菌体内见散在荧光。结论脂筏在调控zasahii菌丝生长、分枝以及假菌丝继续出芽生长等方面起着重要的作用。     

阿萨希毛孢子菌生物膜形成研究

目的 观察阿萨希毛孢子菌（T. asahii）生物膜形态特征、活性分布。方法 用倒置显微镜和扫描电镜观察T. asahii生物膜的形态特征,2,3-二（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-5［（苯胺基）羧基］-2氢-氢氧化四氮唑（XTT）法和活菌计数法测定生物膜活性作定量分析,双荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察生物膜不同层面活菌分布、活性及生物膜厚度。结果 T. asahii在聚苯乙烯表面形成生物膜,该膜扫描电镜下呈复杂的三维立体结构,包括孢子、假菌丝和真菌丝。随时间延长,其活性不断升高,XTT法和活菌计数结果一致（r = 0.94,P ＜ 0.01）,激光共聚焦显微镜下显示T. asahii生物膜不同层面的活性曲线坡度缓和,无明显规律。生物膜的厚度为14.3 ~ 31 μm。结论 体外形成的T. asahii生物膜比其浮游状态下具有更加复杂的结构,生物膜不同层面菌活性无明显差异。     

阿萨希毛孢子菌感染的研究现状

阐述了阿萨希毛孢子菌的流行病学、分离现状、感染部位、临床类型以及微生物学的特征，复习有关阿萨希毛孢子菌感染的流行病学文献，发现阿萨希毛孢子菌是毛孢子菌属中最重要临床致病菌。此外对阿萨希毛孢子菌感染的治疗进行了探讨。     

阿萨希毛孢子菌胞外分泌酶水平的比较

目的探索阿萨希毛孢子菌细胞外分泌酶的种类与活性。方法采用卵黄琼脂培养基、BSA-琼脂培养基和AIP-ZYM试剂盒,观察11株阿萨希毛孢子菌细胞外分泌酶的种类及酶活性。结果11株阿萨希毛孢子菌中9株磷脂酶活性较强,2株酶活性弱;均未测得酸性蛋白酶分泌。AIP—ZYM试剂盒显示11株菌有共性分泌酶,也有部分菌株有特异性分泌酶。结论阿萨希毛孢子菌细胞外分泌酶种类多样,不同来源菌株产酶种类及酶活性亦不相同。     

阿萨希毛孢子菌对氧化剂敏感性的实验研究

目的观察两种氧化剂对阿萨希毛孢子菌(T.asahii)临床分离株与环境分离株生长发育的影响。方法临床分离株与环境分离株菌悬液分别接种于加入了不同浓度的过氧化氢和甲萘醌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)与酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基(YPD液体培养基)中,肉眼、光镜及电镜下观察菌株的形态变化。结果①肉眼形态,随氧化剂浓度的升高,菌落直径逐渐缩小,当达到一定浓度时,菌落不再生长;相同条件下,环境分离株较临床分离株菌落直径小;②光镜形态,菌落发育延迟,数量减少,见许多芽管,随氧化剂浓度的升高,出现许多不易着色、发育不全的孢子,体积较小,偶见胞质萎缩的稍大孢子;③电镜形态,两种氧化剂对两株菌均有损伤,可见菌体表面皱缩,胞壁部分至完全破损,胞质溢出,菌株体积缩小。结论两种氧化剂对两株菌生长发育均有影响,呈浓度依赖,但甲萘醌对菌株影响更强;环境分离株受氧化剂影响更大。     

阿萨希毛孢子菌对氟康唑耐药性的体外诱导及其稳定性研究

【摘要】 目的 探讨体外以浓度梯级倍增的氟康唑诱导不同来源阿萨希毛孢子菌（T.asahii）获得耐药子代,并观察它们的耐药稳定性。 方法　保存的11株T.asahii中筛选出的氟康唑MIC值较低的临床分离株CBS2479及环境分离株CBS8904,在含氟康唑浓度梯级倍增的PDA固体培养基中分别传代培养,每次转种前均用E-test法测定氟康唑对其MIC值,直至其 ＞ 256 μg/ml;选用氟康唑MIC值 ＞ 256 μg/ml的耐药菌株CBS2479R/CBS8904R分别在不含氟康唑的PDA培养基中连续传代培养,并监测每代菌株MIC值,观察其耐药稳定性。 结果 氟康唑MIC值分别为0.25 μg/ml及1.5 μg/ml的T.asahii CBS2479/CBS8904均被成功地诱导为氟康唑MIC值 ＞ 256 μg/ml的耐药子代菌株CBS2479R/CBS8904R;将其在不含氟康唑PDA培养基中连续传代18 d,CBS2479R氟康唑MIC值未见下降;CBS8904R氟康唑MIC值逐渐下降,至第18天时降为64 μg/ml。 结论　氟康唑在体外能诱导不同来源的T.asahii均对其产生耐药性,不同来源的T.asahii其耐药子代的稳定性不同。 【关键词】 阿萨希毛孢子菌; 氟康唑; 抗药性     

阿萨希毛孢子菌对单核细胞产生细胞因子影响的研究

毛孢子菌(Trichosporon spp.)是一种机会致病真菌,可引起皮肤局限性及系统性感染。近年来国外有关该菌在免疫缺陷和肿瘤患者中引起播散性感染的报道逐渐增多^[1,2],但也有报道由该菌所致的播散性毛孢子菌病患者无免疫性或肿瘤疾患存在^[3]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素10(IL-10)是单核细胞抗感染中产生的细胞因子,具有多种生物学活性。     

阿萨希毛孢子菌顶体观察

目的厂解阿萨希毛孢子菌（Trichosporonasahii,T.asahii）菌丝生长与顶体（spitzenk6rper）的关系。方法用荧光染剂FM4—64对YPD液体培养基培养后的Zasahii进行荧光染色,经不同浓度细胞松弛素D抑制后,在荧光显微镜下观察染色结果。结果在T.asahii芽胞、芽管以及菌丝顶端和亚顶端均可见：到FM4—64荧光聚集;随着细胞松弛素D浓度的增加,其顶体荧光逐渐消失。T．asahii的生长受到明显抑制。结论T.asahii存在与真菌极性生长密切相关的顶体,其在控制菌丝生长方面起着重要的作用。     

结合珠蛋白在阿萨希毛孢子菌小鼠皮肤感染中的表达与调控

目的探讨结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)在阿萨希毛孢子菌皮肤感染过程中的免疫调节作用。方法 80只BALB/c小鼠分为免疫抑制组和非免疫抑制组,两组小鼠皮下均接种3.2×107cfu/ml的阿萨希毛孢子菌菌悬液,分别于接种后0.5d、1d、3d、5d处死小鼠,取皮损组织,提取总RNA,RT-PCR检测Hp mRNA表达,基因芯片技术研究免疫相关基因差异表达。结果两组小鼠在第0.5d、1d、3d、5d后皮损组织均扩增出Hp mRNA,其中免疫抑制组皮损组织Hp mRNA表达水平明显高于非免疫抑制对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。免疫抑制组感染1d后皮损组织Hp mRNA表达明显高于0.5d、3d、5d,组间比较均有显著性差异(P<0.01)。筛选出的11条免疫相关差异表达基因中编码结合珠蛋白基因表达上调。结论结合珠蛋白参与了皮肤阿萨希毛孢子菌感染的过程。     

Ras1、Rac1、Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异

目的 研究Ras1、Rac1和Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异,探讨其在菌丝生长过程中的作用.方法 分别培养阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相,提取两组的总RNA,采用荧光定量PCR方法测定两组中Ras1、Rac1和Rho1 mRNA的相对表达量.结果 酵母相菌丝生成率(0.40％±0.53％)显著低于菌丝相(99.33％ ± 0.57％,t=13.93,P＜0.05).实时荧光定量PCR显示,以酵母相为对照组,将其Ras1、Rac1、Rho1基因表达量均设为1,则菌丝相的Ras1、Rac1、Rho1基因mRNA相对表达量分别为25.17±10.99、16.81±7.80、42.61±18.50,与酵母相比较,差异有统计学意义(t值分别为3.81、3.51、3.90,均P＜0.05).结论 Ras1、Rac1、Rho1基因可能参与了阿萨希毛孢子菌菌丝的生长过程.     

微进化对阿萨希毛孢子菌生物膜相关表型及耐药性的影响研究

【摘要】 目的 研究体内微进化对阿萨希毛孢子菌生物膜相关表型及耐药性的影响。方法 阿萨希毛孢子菌标准株源自荷兰真菌多态性保藏中心,阿萨希毛孢子菌原代株TO（氟康唑敏感）为解放军总医院第七医学中心皮肤科1例毛孢子菌病的临床分离株,进化株TEVO（氟康唑耐药）在该患者2014年复诊时分离。体外构建上述菌株的生物膜,使用四甲基氮盐（XTT）还原法及激光共聚焦扫描显微镜评估生物膜生长动力学并测定生物膜厚度;体外测定氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑对不同生长阶段生物膜的最低抑菌浓度（SMIC）,评估生物膜的耐药性。多组间比较采用单因素方差分析,Hartley检验对数据进行方差同质性检验,若方差齐,选用LSD检验进行组间多重比较,若方差不齐,选用Tamhane′T2检验进行组间多重比较。结果 在阿萨希毛孢子菌生物膜黏附（0 h）及形成阶段（4 ~ 24 h）,进化株TEVO代谢活性最弱（F黏附 = 35.705,P < 0.001;F形成 = 15.042,P < 0.001）。而黏附后第48小时生物膜成熟,此时生物膜代谢活性最弱的菌株为TO株（F = 10.985,P < 0.001）。生物膜厚度测量结果显示,成熟阶段TEVO株生物膜厚度［（26.1 ± 1.18） μm］大于TO株［（22.8 ± 1.73） μm,P = 0.001］,但小于标准株［（29.5 ± 1.28） μm,P = 0.001］。药物敏感性实验结果显示,在阿萨希毛孢子菌生物膜黏附及形成阶段,唑类抗真菌药物对TEVO株的SMIC值大于TO株;生物膜成熟阶段,3株菌生物膜的SMIC值均大于1 024 mg/L。结论 在宿主内环境和抗真菌药物的双重压力下,阿萨希毛孢子菌生物膜相关表型发生了适应性改变,并增强了对唑类抗真菌药物的耐药性。     

CARD9基因敲除小鼠骨髓来源树突状细胞对阿萨希毛孢子菌临床株的免疫反应缺陷

目的初步探讨CARD9基因敲除小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrowderived dendritic cell,BMDC)对阿萨希毛孢子菌临床株(Trichosporon asahii,T.asahii)的免疫反应缺陷。方法体外培养野生型(wild type,WT)与CARD9基因敲除型(CARD9knockout,CARD9-/-)小鼠BMDC并分别与热灭活的T.asahii进行共培养,比较两者对菌体的黏附吞噬能力、表面共刺激分子的激活、细胞因子的表达以及两种小鼠感染菌株后的生存率。结果共培养24 h后,WT与CARD9-/-小鼠BMDC对T.asahii的黏附吞噬情况比较未见明显差异;经T.asahii刺激的CARD9-/-小鼠BMDC的CD80、CD86激活情况以及白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α表达水平均明显低于WT小鼠BMDC(P0.05);感染T.asahii的CARD9-/-小鼠的生存率明显低于WT小鼠(P0.05)。结论 CARD9-/-小鼠BMDC对T.asahii的免疫反应缺陷主要体现在共刺激分子的激活以及促炎细胞因子的表达,但并未影响其对T.asahii的吞噬识别。     

氟康唑诱导耐药的阿萨希毛孢子菌ERG11基因表达研究

目的 探讨ERG11基因在阿萨希毛孢子菌耐药的作用以及基因表达量与药物浓度间的关系.方法 通过氟康唑体外诱导获得阿萨希毛孢子菌耐药菌株,将敏感株与耐药株同时置于含0~64μg/ml浓度氟康唑的培养基中培养,用实时PCR检测ERG11基因的表达情况.结果 在无药情况下,阿萨希毛孢子菌耐药株组ERG11基因表达(7.542±5.311)高于敏感株组(1.014±0.012),两组比较t=3.002,P=0.03.在不同浓度氟康唑作用下,耐药株组ERG11 mRNA水平分别为9.183±3.226,13.657±5.428,15.292±7.007,13.720±8.550,13.949±2.960,13.123±6.429,亦高于敏感株组3.281±2.068,3.459±1.923,3.242±2.530,3.651±0.728,3.969±1.924,3.824±1.875,均P<0.05.但ERG11表达量与氟康唑浓度之间差异无相关性(耐药株rs=0.229,P=0.096;敏感株rs=0.166,P=0.357).结论 阿萨希毛孢子菌ERG11基因过表达与氟康唑耐药有关.ERG11基因mRNA表达与氟康唑浓度之间无相关性.     

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对人THP-1单核细胞抗阿萨希毛孢子菌活性增强作用的研究

目的研究重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rh GM-CSF)对单核细胞吞噬、杀伤阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)功能的影响。方法不同浓度的rh GM-CSF(100 U/ml、200 U/ml及400U/ml)与人THP-1单核细胞预孵育48 h后,加入T.asahii临床株共培养1 h,应用瑞氏-姬姆萨染色,倒置显微镜下观察人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬情况;菌落计数法评估人THP-1单核细胞对T.asahii的杀伤情况。结果 rh GM-CSF预孵育可使人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬率从20%提高到84%左右。人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬率随rh GM-CSF浓度增高而升高,具有浓度依赖性。200 U/ml及400 U/ml的rh GM-CSF预孵育组,每毫升T.asahii菌落形成单位较对照组明显减少(P0.05)。结论 rh GM-CSF可明显增强人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬、杀伤活性。     

临床常见毛孢子菌的鉴定

为了探讨临床常见毛孢子菌（Trichosporon spp.)的鉴定方法，在形态学、营养生理学试验的基础上对临床常见的毛孢子菌－皮瘤毛孢子菌（Trichosporon inkin)、皮毛孢子菌（Trichosporon cutaneum)及阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii)进行核糖体核糖核酸（rRNA)基因（rDNA)的内转录间区（ITS）扩增，用限制性内切酶Cfr3I、NcoI对聚合酶链反应（PCR）产物进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析及序列测定，发现用Cfr13I做酶切，皮毛孢子菌的RFLP带型和阿萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌的不同；用NcoI做酶切，皮瘤毛孢子菌的带型与另两者不一致，序列分析的结果与形态学、营养生理学试验一致。结果提示，温度试验、API 20C、RFLP及序列测定可用于鉴定临床常见的毛孢子菌。