HGV E1区5′端基因的克隆、序列分析及表达

通过ＲＴ－ＰＣＲ从庚型肝炎患者血清中扩增出庚型肝炎病毒Ｅ１区５′端基因Ｅｐ，经限制性内切酶消化后克隆入ｐＵＣ１９质粒中。序列分析结果表明，该基因与中国河北株相关基因核苷酸的同源性为９２％。将该基因亚克隆入原核表达载体ｐＥＸ３１ｂ中，成功地构建了ｐＥＸ３１ｂ－Ｅｐ重组质粒，经４２℃诱导表达，在Ｍｒ２００００处可见一条明显的表达带，表达产物约占总菌体蛋白的８％。经蛋白铜染洗脱法纯化蛋白，ＥＬＩＳＡ检测表明，该蛋白具有抗原性。     

庚型肝炎病毒NS5非结构蛋白在昆虫细胞中的表达

庚型肝炎病毒（ＧＢＶＣＨＧＶ）是近年发现的疑似致人类肝炎的新型单股正链ＲＮＡ病毒,发病呈全球性分布,在人群中有一定的感染率。目前诊断主要以逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）为主,有必要研制特异的抗ＧＢＶＣＨＧＶ抗体诊断试剂。杆状病毒的多角体蛋白基因编码表达的蛋白,占感染细胞蛋白总量的比例较高,可使外源基因得到高效表达。由于昆虫细胞能够识别并正确进行诸如信号肽切除、磷酸化、糖基化等蛋白质表达后加工修饰,使得表达的蛋白接近天然蛋白,具有很高的生物活性。ＢａｃｔｏＢａｃ表达系统表达含有６…     

丙型肝炎病毒E2／NS1区基因cDNA的克隆及序列分析

从北京地区１份丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中提取ＲＮＡ，经逆转录和套式聚合酶链反应扩增ＨＣＶＥ２／ＮＳ１区基因约９３０ｂｐ，将其插入至ｐＧＥＭ－Ｔ质粒载体中，利用双脱氧链末端终止法测出该基因５’端４３１ｂｐ的核苷酸序列，将此序列与其它９个ＨＣＶ分离株的相应序列进行比较分析，结果表明，此序列与ＨＣＶⅡ型序列同源性较高，核苷酸水平同源性在８０％以上。由其编码的ＨＣＶ外膜蛋白Ｎ端存在两个高变部位（ＨＶＲ），在ＨＶＲ内、外具有几个保守氨基酸残基和氨基酸区域，它们与外膜蛋白空间构型的维持有关。     

TLMV5‘非编码区基因的克隆与序列分析

目的 调查ＴＴＶ阴性的非甲￣庚型肝炎患者中ＴＴＶ－ｌｉｋｅ ｍｉｎｉ ｖｉｒｕｓ（ＴＬＭＶ）感染情况,对ＴＬＭＶ５’非编码区（５’ＮＣＲ）部分基因进行分子克隆与序列分析。方法 采用巢式ＰＣＲ技术检测５３例ＴＴＶ阴性的非甲－庚肝炎患者血清ＴＬＭＶ ＤＮＡ,对ＰＣＲ产物进行克隆、测序和分析。结果 ５３例病例中ＴＬＭＶ ＤＮＡ阳性３７例（６９．８％）,对其中８株ＴＬＭＶ基因克隆测序,并与Ｔａｋａｈａｓｈ     

庚型肝炎病毒(HGV)E2区cDNA的克隆与表达

目的　克隆ＨＧＶ Ｅ２ 基因并在原核细胞系统中表达ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白。方法　从ＨＧＶＲＮＡ 阳性血浆中抽提病毒ＲＮＡ,利用半巢式ＲＴＰＣＲ 法扩增ＨＧＶ Ｅ２ 基因片段并进行序列分析。然后将该片段克隆到ｐＧＥＸ５ｘ１ 表达载体上,进行诱导表达。表达产物用抗ＨＧＶ 阳性血浆作Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 活性鉴定。结果　获得ＨＧＶ Ｅ２ Ｎ 端长度为７７９ 个核苷酸的基因片段。该片段与美国株ＨＧＶ（Ｕ４４４０２） 、西非株ＧＢＶＣ（ Ｕ３６３８０） 、中国株ＨＧＶ（ Ｕ７５３５６） 的核苷酸序列同源性分别为８４ ％ 、８５ ％ 、９１ ％ ,推测的氨基酸序列同源性分别为８８ ％ 、９３ ％ 、９４ ％ 。表达产物为相对分子质量约５０ ×１０３的ＧＳＴＥ２ 融合蛋白,在细胞内形成包涵体。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 反应中在约５０ ×１０３ 处有显色条带。结论本研究成功地在原核细胞系统中表达了具有抗原性的ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白,为进一步研究ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白及Ｅ２ 抗体的生物学功能打下了基础。     

简并引物在扩增GBV-C/HGV NS3高度变异区的应用

目的试图比较简并引物扩增ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＮＳ３变异较大的区域的作用。方法设计了简并引物和减温（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）ＰＣＲ扩增程序以对目的基因进行扩增，并对阳性ＰＣＲ产物进行克隆及测序。结果该方法能够检测基因变异约达２１％的区域。结论提示该法是一项有效的了解基因家系的技术。     

中国人庚型肝炎病毒E1区5‘端基因相关多肽的抗原性初步研究

用逆转录－ＤＮＡ聚合酶链反应从１例中国庚型肝炎患者血清中扩增出仿前区部分基因及Ｅ１区５‘端共３０９ｂｐ基因片段，对其中包括Ｅ１区９６ｂｐ在内的１２０ｂｐ核苷酸进行了序列分析，发现此区段基因与录入号为Ｕ４４４０２Ｇｅｎｅｂａｎｋ报道的美国发现的ＨＧＶ相关序列具有９３％的同源性。     

庚型肝炎病毒NS5区基因序列测定和分析

目的为了研究哈尔滨市庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）非结构（ＮＳ５）区基因结构特征。方法对阳性标本进行了庚型肝炎病毒ＮＳ５区１８６核苷酸的基因扩增、分子克隆和序列分析，并利用基因分析软件处理结果。结果分离出的２株ＨＧＶＮＳ５区基因序列之间同源性为９５２％，而与国外报道的３株ＨＧＶ序列比较同源性在８４４％～９２４％，变异较大。结论提示ＨＧＶ有不同的基因型，这有待于对各区基因序列进行全面检测，综合判断之后才能确定。分离出的阳性株为从１９８４年肝炎患者血中分离，肯定了我市在８０年代就有庚型肝炎病毒感染存在     

中国株庚型肝炎病毒(HGV)感染猕猴的实验研究

应用０．５ｍｌ含中国株庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）的血清接种５只猕猴，５只猕猴于接种后１周血清ＨＧＶＲＮＡ均阳转；ＨＧＶＲＮＡ滴度在猴体内可高达１∶１０５，较接种血清中ＨＧＶＲＮＡ滴度（１∶１０２）高出许多，提示ＨＧＶ在猕猴体内复制。其中４只猕猴血清抗－ＨＧＶ阳转；４只出现ＡＬＴ异常。后用其中１只猕猴感染后４５天的血清给另２只猕猴接种，该２只猴也出现血清ＨＧＶＲＮＡ和抗－ＨＧＶ阳转及ＡＬＴ异常。本研究表明，中国猕猴有可能作为ＨＧＶ感染的动物模型。     

华南地区HGV的流行状况和同源性分析

目的了解华南地区庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）的流行状况及ＨＧＶ不同株和不同基因区的同源性。方法采用逆转录聚合酶链反应技术（ＲＴ－ＰＣＲ）检测来自广东、香港、云南的不同人群血清标本共１９９１份。对其中２０份的５端非编码区（５ＵＴＲ）２３８ｂｐ和３份非结构蛋白５区（ＮＳ５）６２１ｂｐ进行了序列测定和同源性分析。结果一般人群ＨＧＶＲＮＡ阳性率为（０．７３～１．３４）％,献血员（２．５２～２．９０）％,静脉吸毒者１７．８６％,血液透析患者１４．１３％,接受骨髓移植者４１．６７％,在非甲～戊型肝炎病人为２５．３０％,肝细胞癌１４．４８％,乙型肝炎７．２２％,丙型肝炎（８．３３～１６．１３）％。不同株５ＵＴＲ同源性介乎（９０．４０～１００）％;不同株ＮＳ５区核苷酸同源性（９３．３０～９４．００）％,氨基酸为（９７～９９．２）％。结论接受骨髓移植、血液透析、静脉吸毒者,乙型、丙型、非甲～戊型肝炎病人及肝细胞癌患者是ＨＧＶ的高感染人群。不同ＨＧＶ株存在一定的地区性差异;同一地区不同人群的ＨＧＶ株变异不明显;序列中存在高度保守区及较大变异区     

人黑色素瘤抗原MAGE—3基因的克隆与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异抗原MAGE-3基因,以制备肿瘤DNA疫苗。方法 用RT-PCR方法制备MAGE-3基因,以哺乳细胞高效表达质粒pCI-neo为载体,构建重组DNA疫苗。重组体用载体上的通用引物为测序引物,鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化293细胞,用免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3基因的表达。结果 正确构建了MAGE-3/pCI-neo重组质粒,并且在转化细胞中检测出了MAGE-3的表达。结论 成功地构建了重组MAGE-3/pCI-neo肿瘤核酸疫苗,可以进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及疗效观察。     

中国南京庚型肝炎病毒部分基因的克隆及cDNA序列分析

采用反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）从南京地区某输血后丙型肝炎患者血清中克隆出庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）非结构区部分基因。序列分析结果表明：该序列与国外发表的庚型肝炎病毒ＨＧＵ４４４０２，ＨＧＵ４５９６６，ＨＧＵ３６３８０（ＧＢＶＣ）对应位置核苷酸序列同源性分别为８９０９％，９２１２％，８７２７％，与已报道的ＨＧＶ河北株序列同源性为９３９４％。对４０份输血后丙型肝炎血清和３０份非甲非乙非丙非丁非戊型肝炎血清进行了检测，ＨＧＶＲＮＡ阳性率分别为１０００％和６６７％。     

TLMV5＇非编码区基因的克隆与序列分析

目的　调查TTV阴性的非甲～庚型肝炎患者中TTV～like mini virus(TLMV)感染情况,对TLMV5＇非编码区(5＇NCR)部分基因进行分子克隆与序列分析。方法　采用巢式PCR技术检测53例T T V阴性的非甲～庚肝炎患者血清TLMV DNA,对PCR产物进行克隆、测序和分析。结果　53例病例中TLMV DNA阳性37例(69.8％),对其中8株TLMV基因克隆测序,并与Takahashi报道的TLMV序列(GenBank Accession No ab 026930、ab026931)比较,其核苷酸序列同源性在64％～83％之间。结论　在T TV阴性的非甲～庚肝炎患者中存在TLMV感染。TLMV5＇NCR基因变异性较大。TLMV的致病性及其与非甲～庚肝炎的关系尚有待进一步研究。     

小鼠MBL-A基因的克隆和序列分析

目的：克隆小鼠甘露聚糖结合凝集素-A(MBLA)基因的全长编码区cDNA。方法：利用RT-PCR方法，从Balb/c小鼠的肝细胞中，分离出MBL-A基因cDNA片段，克隆入pUC-T载体，测序并进行分析。结果：扩增得到的小鼠MBL-A基因cDNA全长720bp，编码240个氨基酸残基，包含了完整的富含半胱氨酸区、胶原区、颈区和糖识别域。分析表明，与Genbank中发表的序列具有99.9％的同源性。结论：获得小鼠MBL-A基因的克隆，为进一步研究MBL-A分子在体内的生物学功能奠定了一定基础。     

中国人庚型肝炎病毒E1区5＇端基因相关多肽的抗原性初步研究

用逆转录－ＤＮＡ聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从１例中国庚型肝炎（ＨＧＶ）患者血清中扩增出含Ｅ１前区部分基因及Ｅ１区５＇端共３０９ｈｐ基因片段。对其中包括Ｅ１区９６ｂｐ在内的１２０ｂｐ核苷酸进行了序列分析，发现此区段基因与录入号为Ｕ４４４０２Ｇｅｎｅｂａｎｋ报道的美国发现的ＨＧＶ相关序列具有９３％的同源性，氨基酸的同源性为９８％。Ｇｏｌｄｋｅｙ蛋白质分析程序显示，此区段的Ｅ１区可能存在抗原位点。化学合成可能为抗原位点长约２９个氨基酸的多肽Ｅ１Ｐ１。利用Ｅ１Ｐ１及ＮＳ３区内短肽ＮＳ３Ｐ１包被的ＥＬＩＳＡ方法检测了１２名非甲－戊肝炎患者血清。Ｅ１Ｐ１检出的２份血清（２／１２）中有抗－Ｅ１Ｐ１ＩｇＧ的存在。ＮＳ３Ｐ１捡出的３份血清（３／１２）中有抗－ＮＳ３Ｐ１ＩｇＧ的存在，其中包括Ｅ１Ｐ１检出的两份阳性血清。本结果说明在ＨＧＶＥ１区内至少有一个抗原位点存在。     

中国人丙型肝炎病毒基因组3‘端非编码区的研究

目的 分析中国丙型肝炎病人ＨＣＶ基因组３‘端非编码区,以促进对ＨＣＶ基因组复制机制的研究。方法 采用两种方法,从上海地区感染ＨＣＶ的病人血清中,扩增获得ＨＣＶ基因组３’端非编码区：一是用套式ＰＣＲ直接的增,二是先分别ＨＣＶ３‘ＮＣＲ的前半部分和后半部分,再将两片段进行融合ＰＣＲ。ＰＣＲ产物进行测序后作同源性分析。     

中国上海丁型肝炎病毒部分基因的克隆与序列分析

从我国上海无症状乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）携带者混合血清中提取ＲＮＡ，通过逆转录聚合酶链反应获得丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）的长约３７０个碱基对的ｃＤＮＡ片段，将其克隆测序并与已知的ＨＤＶ各基因型代表株序列比较，结果表明，它与意大利株的同源性较高（９８．１％），与台湾株（Ｉａ型）及美国－１（Ｉｂ型）的同源性相近（９１．０％，９２．０％），与日本－１株（Ⅱ型）及秘鲁株（Ⅲ型）的同源性为７９．３％（     

竞争性逆转录—聚合酶链反应检测Ⅰ型胶原mRNA的表达

近来出现的竞争性逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）能较简便、准确地用于基因表达的定量研究［１］。我们依其原理构建了一个竞争片段，成功地将竞争性ＲＴＰＣＲ法应用于Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ表达的定量研究。一、材料与方法１．抽提ＲＮＡ：收集经不同浓度（０、１０－６、１０－８、１０－１０ｍｍｏｌ／Ｌ）血管紧张素Ⅱ（Ｓｉｇｍａ公司）刺激１２小时后的血管外膜成纤维细胞（血管外膜成纤维细胞的培养参照文献［２］），弃培养液进行以下操作：加入ＴＲＩｚｏｌ（ＧＩＢＣＯＬ）试剂１ｍｌ，反复吹打；加氯仿２００μｌ，振荡１５…     

庚型肝炎病毒（HGV／GBV—C）NS3区基因序列的多变性

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病人血清中检测庚型肝炎病毒。采用５６个循环周期的减温ＰＣＲ方法对ＮＳ３区基因进行扩增，并对阳性ＰＣＲ产物进行了克隆、测序。在ＮＳ３区，ＨＧＶ与样品之间核苷酸的同源性在８２．０％～９１．４％之间；而ＧＢＶ－Ｃ与样品之间的同源性为７８．４％～８４．２％之间。ＮＳ３区变异较大，这种变异可能与ＨＣＶ的基因变异的趋势相类似。