HGV E1区5′端基因的克隆、序列分析及表达

通过ＲＴ－ＰＣＲ从庚型肝炎患者血清中扩增出庚型肝炎病毒Ｅ１区５′端基因Ｅｐ，经限制性内切酶消化后克隆入ｐＵＣ１９质粒中。序列分析结果表明，该基因与中国河北株相关基因核苷酸的同源性为９２％。将该基因亚克隆入原核表达载体ｐＥＸ３１ｂ中，成功地构建了ｐＥＸ３１ｂ－Ｅｐ重组质粒，经４２℃诱导表达，在Ｍｒ２００００处可见一条明显的表达带，表达产物约占总菌体蛋白的８％。经蛋白铜染洗脱法纯化蛋白，ＥＬＩＳＡ检测表明，该蛋白具有抗原性。     

小鼠白细胞介素5融合蛋白在大肠杆菌的表达

将质粒ｐＢＶ－ｍＩＬ－５的小鼠白细胞介素５（ｍＩＬ－５）的ｃＤＮＡ插入表达载体ｐＥＸ３１ｂ，转化大肠杆菌ＲＲＩ，经热诱导获得高效表达，表达的重组蛋白占菌体总蛋白的４０％。该融合蛋白由大肠杆菌ＭＳ２聚合酶的９９个氨基酸和ｍＩＬ－５的１１３个氨基酸组成，在菌体中以包涵体的形式存在，用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、尿素洗涤包涵体，初步纯化的重组蛋白纯度达９０％，已用于制备抗ｍＩＬ－５的单克隆抗体。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ证实ｍＩＬ－５重组蛋白能与抗ｍＩＬ－５多克隆ＩｇＧ特异结合。     

小鼠白细胞介素5融合蛋白大肠杆菌的表达

将质粒ｐＢＶ－ｍＩＬ－５的小鼠白细胞介素５（ｍＩＬ－５）的ｃＤＮＡ插入表达载体ｐＥＸ３１ｂ，转化大肠杆菌ＲＲＩ，经热诱导获得高效表达，表达的重组慢白占菌体总蛋白的４０％，该融合蛋白由大肠杆菌ＭＳ２聚合酶的９９个氨基酸和ｍＩＬ－５的１１３个氨基酸组成，在菌体中以包涵体的形式存在，用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００尿素洗涤包涵体，初步纯化的重组蛋白纯度达９０％，已用于制备抗ｍＩＬ－５的单克隆抗体，Ｗｅｓｔｅｒｎ     

单核细胞趋化蛋白－1在大肠杆菌中的表达

将人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，构建成质粒ｐＧＥＸ／ＭＣＰ转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经ＩＰＴＧ诱导后合成ＧＳＴ－ＭＣＰ－１融合蛋白。用１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测在３０ｋＤ左右有新生蛋白条带出现，表达量约占菌体总蛋白的３１．７％。趋化实验证明，该产物具备明确的单核细胞趋化活性。     

单核细胞趋化蛋白—1在大肠杆菌中的表达

将人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，构建成质粒ｐＧＥＸ／ＭＣＰ转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经ＩＰＴＧ诱导后合成ＧＳＴ－ＭＣＰ－１融合蛋白。用１２％ＳＣＳ－ＰＡＧＥ检测在３０ｋＤ左右有新生蛋白条带出现，表达量约占菌体总蛋白的３１．７％，趋化实验证明，该产物具备明确的单核细胞趋化活性。     

CD44H胞外区cDNA片段的克隆及在大肠杆菌中的表达

以ｐＵＣ／ＣＤ４４为模板，用ＰＣＲ法扩增出Ｈ型ＣＤ４４的ｃＤＮＡ片段。用ＥｃｏＲＩ／ＢｃＩＩ双酶切保留编码ＣＤ４４Ｈ的信号肽及胞外内ＤＮＡ片段，插入融合蛋白表达载体ＰＥＸ３１ｂ的ＥｃｏＲＩ／Ｓａ１Ｉ位点，形成重组质粒ＰＥＸ－ＣＤ４４，将ＰＥＸ－ＣＤ４４导入大肠杆菌菌ＲＲ１（ＰＣＩ８５７），经４２℃温控诱导，有额外蛋白的产生，分子量与预期大小一致，表达产物形成包涵体，表达产量占菌体总蛋白的２１％左右     

EphB2配体结合域基因片段的高效表达

目的;对酷氨酸蛋白激酶受体ＥｐｈＢ２胞外的配体结合区基因进行表达研究。方法：编码ＥｐｈＢ２胞外的配体结合区基因片段克隆于ｐＢｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）质粒中,经全自动序列分析仪测正确后,再克隆重组人表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１,构高效表达克隆ｐＨＴ。转化大肠杆菌ＤＨ５α表达。结果：经ＩＰＴＧ诱导５ｈ,蛋白表达即达高峰,ＳＤＳ ＰＡＧＥ及凝胶密度扫描分析,表达出约４１ＫＤ大小的蛋白,占菌体总蛋白的３５％     

Heymann肾炎致病原受体相关蛋白在大肠杆菌中的表达

为研究Ｈｅｙｍａｎｎ肾炎致病原的病理表型和免疫复合物形成机理，应用ＤＮＡ重组技术，将Ｈｅｙｍａｎｎ肾炎（ＨＮ）致病原受体相关蛋白（ＲＡＰ）的ｃＤＮＡ克隆到表达质粒ｐＧＥＸ中，构建重组表达质粒ｐＧＥＸ－Ｒ９３，经限制性内切酶图谱分析，ＤＮＡ测序，鉴定插入子ＲＡＰ－ｃＤＮＡ正确克隆到ｐＧＥＸ表达框架后，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经ＩＰＴＧ诱导，高效表达了谷胱甘肽巯基转移酶－受体相关蛋白（ＧＳＴ－ＲＡＰ）融合蛋白，蛋白产量占大肠杆菌总蛋白量的３９．４％。经ＧＳＴ－Ｓｅｐｈｏｓｅ４Ｂ亲和层析得到高度纯化的ＧＳＴ－ＲＡＰ。免疫印迹分析证明，针对ＧＳＴ－ＲＡＰ的抗血清能特异地识别肾皮质天然抗原４４０００α蛋白，免疫组化分析显示ＧＳＴ－ＲＡＰ抗血清特异性识别大鼠肾近曲小管刷状缘抗原。     

我国登革2型病毒E基因的克隆与表达研究

以我国登革２型病毒４３（Ｄ２－４３）株ＲＮＡ为模板，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了Ｅ基因。扩增的ｃＤＮＡ片段约１２９０ｂＰ， 与预期大小相一致，经ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实了Ｅ基因片段的特异性。将Ｅ基因的扩增片段首先克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐtⅡＫＳ~＋质粒ＤＮＡ中，利用重组子中载体的酶切位点，将该基因片段再克隆到高效表达载体ｐＢＶ２２０中。用ＰＣＲ技术从２０个重组子中筛选出６个阳性克隆　，经ＳａｌⅠ和ＰｓｔⅠ酶切进一步鉴定，证明这６个重组质粒中均含有Ｅ基因片段。采用温控诱导，４小时表达的蛋白量约占菌体总蛋白的２０％。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明，表达的蛋白可与该病毒株的多克隆腹水抗体和登革２型病毒标准株的单克隆抗体起特异反应。     

HIV-1核心蛋白p24在大肠杆菌中的表达与纯化

探索进一步提高ＨＩＶ－１Ｐ２４ｇａｇ蛋白在大肠杆菌中的表达效率,增加产物的纯化手段。方法：通过改造原核表达载体ＰＢＶ２２０和ｐＥＴ２８,构建了一种通用型温控原核表达载体ｐＶＶ５,将ＨＩＶ－１ｇａｇ基因的１１４８－１８５７编码序列,插入到ｐＶＶ５ｂ和ｐＥＴ２８ｂ的相应位点中,构建了重组表达质粒,ｐＥＧ１ｂ和ｐＥＧ７ｂ,转化到大肠杆菌中进行表达,产物利用ＩＭＡＣ金属螯合层析柱进行纯经,纯化的表达产物用     

人野生型p53 cDNA的克隆、表达和意义

目的：为探讨肿瘤细胞ｗｔ ｐ５３蛋白功能失活机制的研究,检测肿瘤患者血清抗ｐ５３抗体辅助临床诊断提供人ｗｔ ｐ５３蛋白。方法 将人ｗｔ ｐ５３基因ｃＤＮＡ片段插入到大肠杆菌表达载体ｐＱＥ－３０中,得到重组表达质粒ｐＱＥ３０－ｐ５３,用ｐＱＥ３０－ｐ５３重组质粒转化大肠杆菌Ｍ１５细胞,转化菌落经ＰＣＲ扩增和ＢａｍＨⅠ、Ｘｂａ Ｉ酶切证实ｐ５３基因插入。ＩＰＴＧ诱导大肠杆菌表达ｗｔ ｐ５３蛋白,通过Ｎ     

hIL-15成熟肽段基因的克隆及其原核表达载体的构建

本文采用ＲＴ ＰＣＲ的方法自成人脾脏中扩增出ｈＩＬ １５成熟肽段基因，定向克隆入ｐＵＣ１９中，筛选带有插段的阳性克隆。经序列测定证实后，插入大肠杆菌融合表达载体ｐＧＥＸ ４Ｔ １中，构建重组表达质粒ｐＧＩＬ １５。ＳＤＳ ＰＡＧＥ证实ｐＧＩＬ １５大肠杆菌中可表达分子量为３８６ｋＤ的融合蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的１８５％。目的蛋白经纯化后具有促进靶细胞ＤＮＡ合成的作用。     

A组轮状病毒外壳蛋白VP4的原核表达

选用原核表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ，该载体表达谷胱苷肽－Ｓ转移酶融合蛋白，将完整的Ａ组轮状病毒外壳蛋白基因插入ｐＥＧＸ２Ｔ中，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上没有明显的表达条带，而将部分ＶＰ４基因和６３１个碱基，插入ｐＧＥＸ２Ｔ，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中有明显的表达条带。     

人细胞色素P4502B6的GST融合蛋白及其抗体的制备

目的：获得纯化抗原用于制备ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体方法：ＰＣＲ扩增目的基因片段,亚克隆入融合蛋白表达载体ＰＧＥＸ－３ｂ,构建了重组质粒ＰＧＥＸ／２Ｂ６。然后将该重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ分离,获纯化融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６。用ＧＳＴ－３Ｂ２免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,自腹水中获取ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体。结果：融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６（ＣＹＰ２Ｂ６２０２￣３５２ａａ）,并获     

诱导条件对TNF—α ScFv在原核系统中表达量的影响

目的：探讨诱导时间对目的蛋白表达量的影响。为大量获得抗ＴＮＦ－α单链抗体提供实验依据。方法：将Ｅ６ＳｃＦｖ基因分别克隆入表达载体ｐＥＴ１５ｂ－Ｅｔａｇ和ｐＢＶ２２０中,构建重组质表达质粒ｐＥＴＥ６ＳｃＦｖ和ｐＢＶＥ６ＳｃＦｖ。在化学诱志和温度诱导两种条件下,于诱导后相同时间点等量取菌体,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对各时间点表达产物扫描定量。     

中国版纳猪MHCI类P1分子全长的原核表达与纯化

目的：获得原核表达的中国版纳猪ＳＬＡＩ类Ｐ１蛋白质分子。方法：ＰＣＲ扩增去信号肽的ＳＬＡＩ类Ｐ１ｃＤＮＡ序列，亚克隆至ｐＧＥＭＴ载体，测序。将亚克隆的Ｐ１　ｃＤＮＡ片段插入表达载体ｐＥＴ４２ｂ（＋），构建重组表达质粒ｐＥＴ－４２ｂ（＋）／ｓｌａ－ｐｌ，转化Ｅ·ｃｏｌｉ表达菌 ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＬ，ＩＰＴＧ诱导 Ｐ１－８ ｘ ｈｉｓ融合蛋白表达，经包涵体洗涤，８ ｍｏｌ／Ｌ尿素变性溶解，Ｎｉ２＋亲和层析，梯度透析后，定量保存。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定目的蛋白的表达与纯化。结果：目的蛋白（分子量３９．５ ｋＤ）表达量占细菌总蛋白 １５％，每升表达菌获得纯度９５％的目的蛋白 ４０ ｍｇ～６０ｍｇ。结论：成功建立猪 ＳＬＡ分子全长原核表达、纯化体系，为建立间接识别猪移植抗原ＳＬＡＩ类分子的人Ｔ细胞系及表位分析打下基础。     

登革病毒E蛋白区段基因克隆及高效表达

目的进行登革病毒Ｅ蛋白区段的高效表达,制备抗原,为分析Ｔ、Ｂ细胞表位及免疫功能的研究奠定基础。方法以含有Ｄ２ＶＥ区的质粒ｐ３０．ＶＤ２为模板,ＰＣＲ扩增了编码Ｄ２ＶＥ蛋白３０８～４６８ａａ区段的基因片段,以ｐＭＹ为表达载体,构建了表达质粒ｐＤＥ１,并用酶切法使之缺失跨膜区疏水ａａ较多的编码序列,又构建了表达质粒ｐＤＥ２,分别转化大肠杆菌,获得了不同的工程菌株。经诱导培养,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,免疫印迹及酶联检测分析表达产物。结果含ｐＤＥ１质粒工程株只能表达微量的特异性蛋白;而含ｐＤＥ２质粒的工程菌株则能高效表达Ｄ２Ｖ特异性Ｅ蛋白,重组表达产物占菌体蛋白的２５．３１％。用４ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体,上清中Ｅ蛋白纯度可达８０％。以粗提物包板进行酶联检测,结果表明,该重组Ｅ蛋白具有ＤＶ４个型交叉抗原的特性。结论缺失Ｃ末端疏水区编码序列的Ｄ２ＶＥ基因片段,可在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得高效表达,其表达产物具有ＤＶ属特异性。     

抗人CD3单链抗体的表达及其分离纯化

本研究将构建的抗人ＣＤ３单链抗体基因，克隆到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，用ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合蛋白，并以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，在Ｍｒ为５２０００左右出现一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的４０％。经初步纯化和复性后，用ＧＳＴ亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗人ＣＤ３ＳｃＦｖ，竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有ＣＤ３亲和活性     

Heymann肾炎致病原受体相关蛋白羧基端多肽表达的研究

本研究中，用ＰＣＲ方法扩增了受体相关蛋白基因第６３３～９５７碱基ｃＤＮＡ片段。将编码成熟分子量为４４×１０３受体相关蛋白和羧基端１０８氨基酸多肽的ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１内，限制性图谱分析测定了插入子的方向并用ＤＮＡ序列分析加以证实。带有质粒ｐＧＥＸ－Ｒ９３（包含完全ＲＡＰｃＤＮＡ９５７碱基）的重组菌过度表达了分子量为６５×１０３融合蛋白，其含量占总蛋白的３９．４％。带有质粒ｐＧＥＸ－Ｒ３５（包含ＲＡＰｃＤＮＡ３２４碱基）表达了４０×１０３的融合蛋白，蛋白含量３２．２％。通过谷胱甘肽亲和层析柱，从细菌溶解物中纯化了融合蛋白，每升培养物能纯化到１０～２０ｍｇ的蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明抗Ｒ９３和抗Ｒ３５两种抗血清特异性结合到大鼠肾皮质微绒毛提取物中的４０×１０３的带。间接免疫荧光显示抗Ｒ９３和抗Ｒ３５两种抗体标记肾近曲小管刷状缘抗原。文中对表达的受体相关蛋白的意义和其抗原性进行了讨论。     

戊型肝炎病毒中国株结构区ORF2 cDNA的克隆及表达

将戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）中国株结构区第二开放读码框架（ＯＲＦ２）８３７ｂｐ ｃＤＮＡ片段插入ｐＧＥＸ１λＴ质粒中进行表达。经免疫吸印法证明，该质粒表达的融合蛋白具有识别抗－ＨＥＶ的抗原表位，可用于制备抗－ＨＥＶ检测试剂。