调心方对β淀粉样蛋白所致原代培养海马神经元细胞毒模型的影响

目的：建立β淀粉样蛋白（Aβ）所致的神经细胞毒模型，探讨调心方的药敏及作用机理。方法：原代培养大鼠海马神经元，用25μmol/L 集状态的Aβ1－42建立神经细胞毒模型。采用乳酸脱氢酶（LDH）释放量来检测神经元存活率，通过透射电镜、流式细胞仪检测判断神经元凋亡，应用免疫细胞化学法研究凋亡相关基因的表达蛋白（Bcl-2、Bax、 c-Jun）。结果：神经元经Aβ1－42处理后，LDH释放增加；电镜显示细胞体积缩小、染色质固缩、或浓聚成块状位于核周边、滑面内质网扩张；流式细胞仪检测可见亚二倍体峰；Bcl-2减少，而Bax与c－Jun增加。调心方使LDH释放减少，电镜下具有凋亡形态特征的细胞减少，流式细胞仪检测显示凋亡率下降，Bcl-2增加，Bax减少，而c-Jun变化不明显。四氢氨基吖啶（THA）组神经元存活率增加，但其他指标的变化不明显。结论：调心方对Aβ1－42神经细胞毒有保护作用，可提高细胞存活率，抑制凋亡，其抑制凋亡作用的机制可能是通过提高bcl-2、降低bax基因的蛋白表达而实现。THA对神经元存活率有提高作用，但抑制神经元凋亡的作用似不明显。调心方对抑制Aβ所致神经元凋亡明显优于THA。     

调心方对β淀粉样蛋白所致大鼠海马神经元凋亡的调控作用

目的 探讨调心方的药效及作用机制。方法 原代培养大鼠海马神经元,Aβ 1-42诱导神经细胞毒模型。采用FDA与PI双染检测神经元存活率,Hoechst 33258染色、TUNEL判断神经元凋亡,免疫细胞化学研究Caspase-3表达,Northern Blot、RT-PCR研究凋亡相关基因(bcl-2、bax、c-jun、c-fos)表达。结果 神经元经Aβ 1-42处理后,活细胞数减少,染色质浓缩、核碎裂,TUNEL染色阳性神经元增多,Caspase3表达增加,bcl-2 mRNA表达减少,而bax与c-jun表达增加、c-fos的表达变化不明显。调心方可显著改善上述变化。结论 调心方对Aβ 1-42神经细胞毒有保护作用,可提高细胞存活率,抑制凋亡。其机制可能通过提高bcl-2 mRAN水平,降低bax和c-jun mRAN水平,减少Caspase-3表达而实现。     

补肾方对β淀粉样蛋白所致大鼠海马神经元细胞毒作用的影响

目的:建市Aβ所致的神经细胞毒模型,探讨补肾方的药效及作用机理。方法:原代培养大鼠海马神经元,用25μmol/L聚集状态的Aβ1-42建立神经细胞毒模型。采用LDH释放量来检测神经元存活率,通过透射电镜、流式细胞计判断神经元凋亡,应用免疫细胞化学法研究凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、c-Jun)的蛋白表达。结果:神经元经Aβ1-42处理后,LDH释放增加;电镜显示细胞体积缩小、染色质固缩、或浓聚成块状位于核周边、滑面内质网扩张;流式细胞计可见亚二倍体峰;Bcl-2的蛋白表达减少,而Bax与C-Jun表达增加。补肾方使LDH释放减少,电镜下具有凋亡形态特征的细胞减少,流式细胞计显示凋亡率下降,Bcl-2蛋白表达增加,c-Jun表达减少,而Bax表达变化不明显。Tacrine组神经元存活率增加,但其它指标的变化不明显。结论:①补肾方对Aβ1-42神经细胞毒有保护作用,可提高细胞存活率,抑制凋亡。②其作用机制可能是通过提高bcl-2、降低c-Jun基因的蛋白表达而实现。③Tacrine对神经元存活率有提高作用,但抑制神经元凋亡的作用似不明显。补肾方对抑制Aβ所致神经元凋亡明显优于Tacrine。     

调心、补肾方对β淀粉样蛋白神经毒模型神经元存活率及突触小泡蛋白表达的影响

目的：研究调心方和补肾方对Aβ1－42所致神经毒模型海马神经元存活率和突触小泡蛋白表达的影响。方法：原代培养大鼠海马神经元,用25μmol/L聚集状态的Aβ1－42建立神经细胞毒模型。采用FDA与PI双染后细胞计数、LDH释放量来检测神经元存活率,应用免疫细胞化学法研究突触小泡蛋白的蛋白表达。结果：神经元经Aβ1－42处理后,活细胞数减少,LDH释放增加,突触小泡蛋白表达减少。调心方、补肾方使活细胞数提高,LDH释放减少,突触小泡蛋白表达回升。Tacrine使神经元存活率增加,但突触小泡蛋白表达的变化不明显。结论：调心方与补肾方对Aβ1－42神经细胞毒有保护作用,可提高细胞存活率,使突触小泡蛋白表达回升,但两方作用无显差异。Tacrine对神经元存活率有提高作用,但提高突触小泡蛋白表达的作用不明显。     

调心方对β-淀粉样蛋白和皮质酮抑制大鼠海马脑片CA1区LTP的作用研究

采用细胞外微电极记录技术 ,观察调心方对 β 淀粉样蛋白和皮质酮抑制大鼠海马脑片LTP作用的影响。结果发现 ,在正常情况下 ,海马脑片LTP诱发成功率约为 6 0 % ,施以高频串刺激后PS幅度显著增高 ,PS潜伏期明显缩短。预先用 β 淀粉样蛋白 (0 2 μΜ )或皮质酮 (2 μM)孵育海马脑片对正常PS的形状、幅度无明显影响 ;但两者均可显著抑制脑片LTP的诱发率 ,并且PS增幅程度与对照组相比也显著降低 ,提示两者对海马LTP的诱生具有抑制作用。若用调心方 (7 4 5mg ml)与 β 淀粉样蛋白或皮质酮共同孵育脑片后 ,其LTP诱发率呈现上升趋势 ,同时PS增幅也显著提高。以上结果表明 ,调心方对 β 淀粉样蛋白或皮质酮对海马LTP的抑制效应具有明显的对抗作用 ,这可能是其改善AD患者认知功能障碍的作用机制之一     

电针血清对β淀粉样蛋白损伤原代培养大鼠海马神经元的保护作用

目的观察电针血清对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的原代大鼠海马神经元的保护作用。方法通过Aβ1-40脑内注射建立阿尔茨海默病大鼠模型,予以电针治疗后,留取各组血清。Aβ25-35处理原代培养海马神经元建立体外神经元损伤模型,实验分为正常组、模型组和电针血清组,通过MTT法检测神经元的增殖,采用TUNEL染色法检测神经元的凋亡,通过免疫细胞化学染色检测Caspase-3的表达。结果 MTT检测结果发现,经Aβ处理后,细胞活力显著下降。而与模型组比较,电针血清组细胞增殖能力明显增强(P＜0.01);TUNEL 染色结果显示,与模型组比较,电针血清组凋亡细胞数目明显减少(P＜0.01);经Aβ处理48 h后,Caspase-3表达水平明显升高,电针血清组Caspase-3阳性细胞数目较模型组显著减少(P＜0.01)。结论电针血清能促进海马神经元的增殖,降低其 Caspase-3的表达,对抗Aβ的神经毒性,减少神经元的凋亡。     

调心方对氧化损伤型类AD大鼠脑组织淀粉样蛋白(APP) mRNA表达的影响

目的：观察调心方对活性氧所致的氧化损伤型类AD大鼠脑组织NF-κB转录因子和APPmRNA水平的影响．方法：用二羟延胡索酸(DHF)加FeCl3-ADP左侧脑室注射法复制氧化损伤型类AD大鼠模型；Morris水迷宫法检测An大鼠空间记忆能力；RT-PCR法检测鼠脑皮层和海马APPmRNA水平；免疫组化法检测鼠脑皮层和海马NF-κB转录因子表达，以及调心方对上述各项指标变化的影响。结果：与正常对照组比较，AD模型鼠空间记忆能力显下降，脑组织NF-κB转录因子和APP mRNA水平明显增高；调心方对上述指标有明显的改善作用。结论：调心方能够通过下调An大鼠脑组织NF-κB转录因子和APP mRNA表达水平，减少Aβ产生，改善AD大鼠的空间记忆能力。     

调心方对Aβ25-35杏仁核注射大鼠脑内细胞周期相关蛋白表达的影响

目的 :探讨调心方对 β淀粉样蛋白 (β amyloid ,Aβ)片段Aβ2 5 3 5杏仁核注射大鼠脑内细胞周期相关蛋白表达的影响。方法 :用Aβ2 5 3 5多肽片段进行大鼠单侧杏仁核注射 ,以模拟阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)脑内Aβ对神经系统的损害。应用免疫组织化学染色和积分光密度分析检测磷酸化tau、Aβ、cyclinA、cyclinB1等蛋白水平的变化。结果 :与生理盐水对照组比较 ,Aβ注射大鼠脑内的磷酸化tau、Aβ、cyclinA、cyclinB1等蛋白水平有不同程度的升高 (P <0 0 5 ) ,而给予调心方的动物在一定程度上能降低这些蛋白的水平 (P <0 0 5 )。结论 :调心方对Aβ引起的动物脑内神经元异常表达的细胞周期相关蛋白有一定的抑制作用。     

调心方有效部位对类老年痴呆大鼠的影响

目的研究调心方有效部位(TX0201)对β-淀粉样蛋白(Aβ)25-35所致类老年性痴呆(AD)模型大鼠神经免疫调节的作用机制。方法采用双侧杏仁核注射Aβ25-35造成类AD大鼠模型,观察大鼠Morris水迷宫空间记忆能力,并分别通过免疫组化和RT-PCR方法研究类AD大鼠大脑组织中的原纤维酸性蛋白(GFAP)、APPmRNA表达和炎性细胞因子白细胞介素-1β、白细胞介素-6的变化以及TX0201的影响。结果类AD模型大鼠Morris水迷宫测试出现空间记忆能力下降,皮层、海马APPmRNA的表达上调;海马、皮层GFAP阳性胶质细胞和白细胞介素-6mRNA以及海马白细胞介素-1βmRNA表达增高。TX0201能有效控制以上病理变化。结论TX0201能显著改善Aβ诱导的痴呆模型大鼠学习记忆障碍,降低海马APPmRNA表达,减轻神经细胞的炎症和免疫联级反应。提示有效控制AD患者脑内Aβ免疫联级反应是TX0201的重要作用机制之一。     

调心方对杏仁核注射Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病模型大鼠的影响

目的 研究调心方(HBR)对杏仁核注射β淀粉样蛋白(Aβ25-35)致阿尔茨海默病(AD)模型大鼠相关病理变化的作用。方法 单侧杏仁核注射Aβ25-35造成AD大鼠模型，采用Morris水迷宫法、放射免疫法、免疫组化法、RT—PCR法，以Aricept为对照，观察HBR对AD模型大鼠的空间学习记忆能力、胆碱能系统、Aβ1-40沉积、tau蛋白异常磷酸化及脑额叶皮层内APPmRNA表达的影响。结果 HBR可显著改善Aβ25-35诱导的AD大鼠空间学习记忆障碍，提高模型大鼠的胆碱乙酰化转移酶(ChAT)活性及M受体结合容量(Rt)值，减少APPmRNA的表达和Aβ1-40的沉积，抑制tau蛋白的异常磷酸化。结论 HBR对Aβ25-35诱导的AD大鼠空间学习记忆障碍及胆碱能系统损害具有显著改善作用，可以明显减轻Aβ1-40的沉积和tau蛋白的异常磷酸化。     

调心方对大鼠海马脑片长时程增强效应的影响

目的：观察调心方对大鼠海马脑片长时程增强（LTP）效应的影响。方法：采用细胞外微电极技术，记录大鼠海马脑片CA1区细胞外群峰电位（PS），然后施以100hz,100串的强直刺激，诱发LTP产生。结果：在正常情况下，大鼠海马脑片LTP的诱发成功率约为60％，施以高频串刺激后PS幅度显著增高，PS潜伏期明显缩短，用调心方（7.45mg/ml）预先孵育海马脑片对正常PS的形状，幅度均无明显影响，提示其并不影响海马脑片的基础突触传递，但施以高频刺激后脑片LTP的诱发率呈现升高趋势，同时其PS增幅与正常对照组比较也显著提高，结论：调心方可提高大鼠海马脑片LTP的诱发率及增幅，这可能是其改善海马学习记忆功能的作用机制之一。     

调心方药物血清对动物阿尔茨海默病相关的tau蛋白磷酸化的调节作用

目的：研究调心方对动物阿尔茨海默病相关的tau蛋白磷酸化的调节及其可能的作用机制。方法：采用冈田酸（Okadaic acid）处理NG108细胞模型，MTT比色法、蛋白印迹法、免疫共沉淀等方法进行测定。结果：MTT方法观察到磷酸脂酶抑制剂冈田酸（20nmol/L）处理NG108细胞12h能导致细胞活性明显下降，调心方药物血清能改善细胞的活性；多种tau蛋白抗体免疫印迹法见调心方药物血清能逆转冈田酸导致的NG108细胞tau蛋白过度磷酸化。免疫共沉淀研究观察到调心方提取液抑制tau蛋白与可调节tau蛋白磷酸化的早老蛋白－1（Presenilin-1）的结合。结论：调心方能抑制tau蛋白的过度磷酸化，其部分机制可能与调心方调节早老蛋白－1与tau蛋白结合有关。     

调心方活性部位对大鼠海马脑片CA1区诱发LTP的影响

目的：研究调心方活性部位A对大鼠海马脑片诱发长时程增强(LTP)效应的影响。方法：采用细胞外微电极记录技术，记录大鼠海马脑片CA1区诱发群峰电位(PS)，然后施以100Hz，100串的强直刺激诱发LTP。结果：调心方活性部位A对大鼠海马脑片正常PS的形状、幅度无影响，提示并不影响海马的基础突触传递。给予强直刺激后，高浓度活性部位A可以明显增大LTP幅度，提示具有促进和维持LTP的作用。结论：调心方活性部位A可能是调心方促进和维持大鼠海马脑片诱发LTP的有效成分之一，对LTP的促进作用也是调心方活性部位A益智作用的机制之一。     

调心方对快速老化模型小鼠海马学习记忆有关基因表达的影响

目的：研究调心方对快速老化模型小鼠（senescence accelerated mouse,SAM)海马学习记忆有关基因表达的影响。方法：应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）的方法，以β-actin为内参照，检测SAM海马盐皮质激素受体（MR），早老蛋白1（PS－1），早老蛋白2（PS－2），tau,APP,apoE及bcl-2等学习记忆有关基因表达水平的变化及调心方对其影响。实验中选用E2020为对照药物。结果：与同龄抗快速老化的R系（SAMR1）比较，5月龄快速老化亚系（SAMP8）海马MR，tau,PS-2,APP基因表达水平显著升高，apoE基因表达水平降低；而PS－1和bcl-2基因表达水平无明显变化；12月龄SAMP8海马MR,tau基因表达水平升高，bcl-2基因表达水平降低，而PS－1，PS－2，apoE,APP基因表达水平无明显变化。连续口服给予调心方对5月龄SAMP8海马MR，tau,apoE基因的异常表达具有纠正作用，对12月龄SAMP8海马MR,bcl-2基因的表达异常亦具有纠正作用。结论：连续口服给予调心方对5月龄及12月龄SAMP8海马学习记忆有关基因的异常表达有纠正或调节作用。     

调心方活性部位对皮质酮抑制大鼠海马脑片CA1区诱发长时程增强的作用

目的以长时程增强(LTP)为指标,研究调心方(TXR)活性部位A(TXR-A)对皮质酮抑制大鼠海马脑片LTP作用的影响。方法将脑片分为正常对照组、皮质酮组、皮质酮 TXR组、皮质酮 不同浓度TXR-A组,记录前脑片用含药人工脑脊液(ACSF)孵育1h,记录时用相同ACSF灌流。采用细胞外微电极记录技术,记录大鼠海马脑片CA1区诱发群峰电位(PS),然后施以100Hz、100个脉冲的强直刺激HFS诱发LTP。结果与正常脑脊液组相比,皮质酮(2μmol/L)孵育海马脑片1.5h以上,强直刺激后PS增幅显著降低,提示皮质酮对海马LTP具有抑制作用。用不同浓度的TXR-A 皮质酮孵育脑片1.5h以上,强直刺激后高浓度TXR-A组的PS平均幅度显著提高,且作用优于TXR。提示TXR-A可以对抗皮质酮对LTP的抑制。结论该活性部位可能是发挥TXR改善皮质酮抑制大鼠海马CA1区诱发LTP作用的主要成分之一,拮抗皮质酮对LTP的抑制是其益智作用的机制之一。     

调心方对APP/PS1双转基因AD小鼠脑组织突触的保护作用

目的探讨调心方对APP/PS1双转基因AD小鼠学习记忆能力和海马CA1区突触和神经元结构、突触数量的影响。方法将54只3月龄APP/PS1双转基因AD小鼠随机均分为模型组、调心方组(1.485 g·kg~(-1)·d~(-1))和盐酸多奈哌齐组(0.083 mg·kg~(-1)·d~(-1)),以同月龄同性别下18只C57BL/6J野生小鼠作为正常组,各组采取相应干预措施。灌胃12周后,采用Morris水迷宫进行行为学检测,采用透射电镜观察小鼠海马CA1区突触和神经元结构、突触数量和神经元。结果 (1)与正常组比较,模型组小鼠逃避潜伏期的时间明显延长(P0.01),穿越平台的次数明显减少(P0.05),在原平台象限停留的时间明显减少(P0.01);海马CA1区神经元细胞核固缩,核膜皱缩增厚,核周出现空晕,部分临近胞膜处染色较深,异染色质,线粒体肿胀,粗面内质网扩张呈囊泡状,神经毡内突触数量明显减少(P0.01),突触结构出现大片的轴浆空泡化。(2)与模型组比较,调心方组小鼠逃避潜伏期的时间明显缩短(P0.01),穿越平台的次数明显增加(P0.01),在原平台象限停留的时间明显增加(P0.01);海马CA1区神经元细胞核圆形,核膜清晰完整,核仁明显,染色质细腻,线粒体嵴清晰可见,线粒体部分略微肿胀,粗面内质网和核糖体都较正常,突触结构较清晰,突触数量明显增加(P0.01),细胞器病变有所减轻。结论调心方可改善APP/PS1双转基因AD小鼠学习记忆水平,改善神经元和突触结构的退变和突触数量的减少,对认知和突触具有保护作用。     

祛风定痛方对小鼠偏头痛模型的影响

目的 探讨祛风定痛方对小鼠偏头痛模型的作用。方法 复制利血平致低五羟色胺(5-HT)偏头痛模型,观察祛风定痛方对模型小鼠脑组织5-HT水平、凝血时间的影响及其止痛效果。结果 祛风定痛方高、中、低剂量组与模型组比较均能明显升高利血平致低5-HT模型小鼠脑组织中5-HT水平(P < 0.05),明显延长小鼠凝血时间(P < 0.05,P < 0.01),有效抑制福尔马林致小鼠疼痛反应,减少小鼠Ⅰ时相舔足时间(P < 0.01),但不能够减少小鼠Ⅱ时相舔足时间;祛风定痛方能够提高电刺激致大鼠疼痛痛阈,其高剂量组在给药后30,60,90,120 min时与正常对照组比较,差异有统计学意义(P < 0.01),中剂量组在给药后60,90 min时与正常对照组比较,差异有统计学意义(P < 0.01,P < 0.05),小剂量组在给药后60 min时与正常对照组比较,差异有统计学意义(P < 0.05)。结论 祛风定痛方治疗偏头痛可能与升高脑组织5-HT水平、延长偏头痛小鼠凝血时间有关,提示其有良好的镇痛作用。