Twist基因干扰抑制猴视网膜微血管内皮细胞的迁移

目的 观察Twist基因干扰对体外培养的猴视网膜微血管内皮细胞(RF/6A)迁移及磷酸化Akt(pAkt)蛋白表达的影响.方法 体外培养的RF/6A细胞系,并构建Twist干扰质粒和对照质粒.分为Twist干扰质粒组、阴性对照组、磷酸盐缓冲液(PBS)组,各组应用脂质体基因转染方法,转入相应的质粒表达载体,采用Transwell小室法检测发生迁移的内皮细胞并计数;铺Matrigel胶,行内皮细胞体外成管实验,观察Twist基因干扰对内皮细胞成管的抑制作用;蛋白质免疫印迹检测Twist基因干扰对RF/6A细胞pAkt蛋白表达的影响.结果 Transwell小室计数结果表明,转染Twist干扰质粒后,迁移的细胞数显著低于阴性对照组和PBS组(F=23.786,P=0.000).体外成管实验结果表明,Twist干扰质粒组内皮细胞成管数显著低于阴性对照组和PBS组(F=7.159,P=0.014).Ttwist干扰质粒组的pAkt蛋白表达明显减少.结论 Twist基因干扰可显著抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移,可能机制是通过抑制pAkt蛋白的表达发挥作用.     

Twist基因干扰抑制猴视网膜微血管内皮细胞的迁移

目的 观察Twist基因干扰对体外培养的猴视网膜微血管内皮细胞(RF/6A)迁移及磷酸化Akt(pAkt)蛋白表达的影响.方法 体外培养的RF/6A细胞系,并构建Twist干扰质粒和对照质粒.分为Twist干扰质粒组、阴性对照组、磷酸盐缓冲液(PBS)组,各组应用脂质体基因转染方法,转入相应的质粒表达载体,采用Transwell小室法检测发生迁移的内皮细胞并计数;铺Matrigel胶,行内皮细胞体外成管实验,观察Twist基因干扰对内皮细胞成管的抑制作用;蛋白质免疫印迹检测Twist基因干扰对RF/6A细胞pAkt蛋白表达的影响.结果 Transwell小室计数结果表明,转染Twist干扰质粒后,迁移的细胞数显著低于阴性对照组和PBS组(F=23.786,P=0.000).体外成管实验结果表明,Twist干扰质粒组内皮细胞成管数显著低于阴性对照组和PBS组(F=7.159,P=0.014).Ttwist干扰质粒组的pAkt蛋白表达明显减少.结论 Twist基因干扰可显著抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移,可能机制是通过抑制pAkt蛋白的表达发挥作用.     

Twist基因干扰抑制猴视网膜微血管内皮细胞的迁移

目的 观察Twist基因干扰对体外培养的猴视网膜微血管内皮细胞(RF/6A)迁移及磷酸化Akt(pAkt)蛋白表达的影响.方法 体外培养的RF/6A细胞系,并构建Twist干扰质粒和对照质粒.分为Twist干扰质粒组、阴性对照组、磷酸盐缓冲液(PBS)组,各组应用脂质体基因转染方法,转入相应的质粒表达载体,采用Transwell小室法检测发生迁移的内皮细胞并计数;铺Matrigel胶,行内皮细胞体外成管实验,观察Twist基因干扰对内皮细胞成管的抑制作用;蛋白质免疫印迹检测Twist基因干扰对RF/6A细胞pAkt蛋白表达的影响.结果 Transwell小室计数结果表明,转染Twist干扰质粒后,迁移的细胞数显著低于阴性对照组和PBS组(F=23.786,P=0.000).体外成管实验结果表明,Twist干扰质粒组内皮细胞成管数显著低于阴性对照组和PBS组(F=7.159,P=0.014).Ttwist干扰质粒组的pAkt蛋白表达明显减少.结论 Twist基因干扰可显著抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移,可能机制是通过抑制pAkt蛋白的表达发挥作用.     

重组canstatin蛋白抑制体外视网膜微血管内皮细胞的迁移和增殖

目的 观察重组血管能抑素(canstatin)蛋白对体外培养的恒河猴视网膜微血管内皮细胞(RF/6A)迁移、增殖及磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phospho-extracelluar regulated protein kinases,pERK)、磷酸化Akt表达的影响,初步探讨重组canstatin蛋白抑制视网膜新生血管的作用机制.方法 体外培养RF/6A细胞系,在培养基中分别添加重组canstatin蛋白和等量的PBS,采用Transwell小室法检测各组发生迁移的内皮细胞并计数;铺Matri-gel胶,行体外成管实验,观察canstatin蛋白对内皮细胞成管的抑制作用;用MTT法检测重组canstatin蛋白对内皮细胞增殖的影响;Western blotting检测重组canstatin蛋白对血清刺激30 min后RF/6A细胞pERK、磷酸化Akt蛋白表达的影响.结果 加入重组canstatin蛋白后,显著抑制了细胞的迁移,重组canstatin蛋白组迁移的细胞数每视野(7.75±1.50)个显著低于PBS组(25.25±2.36)个(t=12.505,P=0.000);两组内皮细胞成管数分别为重组canstatin组每视野(18.67±7.02)个,也显著低于PBS组每视野(44.67±2.52)个(t=6.036,P=0.004).与PBS组相比,重组canstatin蛋白组的内皮细胞的增殖也受到抑制,后者48 h后平均吸光度A490为0.286 9±0.014 0,低于前者0.3349±0.021 7(t=3.723,P=0.01).同时,重组canstatin蛋白降低了RF/6A细胞中pERK蛋白的表达水平.结论 重组canstatin蛋白能通过下调pERK蛋白的表达抑制RF/6A细胞的迁移和增殖,具有潜在抑制视网膜新生血管形成的作用.     

雷帕霉素抑制猴视网膜微血管内皮细胞增生的实验研究

背景 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在细胞周期调控机制中扮演着重要角色,其抑制剂雷帕霉素（RAPA）可通过调控细胞周期抑制细胞增生. 目的 观察RAPA对体外培养的猴视网膜微血管内皮细胞RF/6A细胞系增生的影响. 方法 体外培养RF/6A细胞系,分别在培养液中加入PBS、10 μg/L RAPA和5μg/L RAPA.采用Western blot法检测cyclin D1蛋白在各组RF/6A细胞中的表达;采用流式细胞仪检测不同质量浓度RAPA作用后G0/G1期RF/6A细胞的比例;行血管内皮细胞体外成管实验观察不同质量浓度RAPA对RF/6A细胞成管的抑制作用. 结果 Western blot检测表明,PBS组、10μg/LRAPA组和5μg/L RAPA组RF/6A细胞中cyclin D1蛋白的相对表达量分别为0.92±0.04、0.58±0.02和0.73±0.02,3个组间的差异有统计学意义（F=246.320,P=0.000）,其中10 μg/L RAPA组和5μg/L RAPA组cyclin D1蛋白在RF/6A细胞中的相对表达量均明显低于PBS组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.细胞周期检测发现,PBS组、10 μg/L RAPA组和5μg/L RAPA组G0/G1期细胞比例分别为（42.13±0.57）％、（65.15±0.64）％和（54.09±0.78）％,3个组间差异有统计学意义（F=887.815,P=0.000）,其中10 μg/L RAPA组和5 μg/L RAPA组RF/6A细胞G0/G1期比例明显高于PBS组,差异有统计学意义（P＜0.05）.体外成管实验显示,PBS组、10 μg/L RAPA组及5μg/L RAPA组每个视野下血管内皮细胞成管数分别为（9.67±1.53）、（4.33±0.58）和（6.33±0.58）个/视野,3个组间比较差异有统计学意义（F=21.778,P=0.002）,10 μg/LRAPA组内皮细胞管数最少,其次为5μg/L RAPA组,均明显少于PBS组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 RAPA可通过下调cyclin D1蛋白的表达抑制RF/6A细胞的增生,较高质量浓度的RAPA作用更强.     

重组腺病毒介导p21对小鼠视网膜新生血管生成的抑制作用

目的 观察重组腺病毒-p21 (rAd-p21)对氧诱导小鼠视网膜新生血管(RNV)的抑制作用.方法 将56只健康7日龄C57BL/6J小鼠随机分为对照组、磷酸盐缓冲液(PBS)组、rAd-p21组及rAd-无目的基因对照(rAd-NC)组,每组14只.PBS组、rAd-p21组及rAd-NC组建立氧诱导RNV模型,并于小鼠11日龄时玻璃体腔分别注入1μl PBS、rAd-p21及rAd-NC.对照组不做任何处理.小鼠17日龄时,每组处死4只小鼠,摘取眼球分别作荧光视网膜铺片和切片,观察小鼠RNV发生情况;Image-Pro plus 6.0软件测量分析无灌注区面积;同时提取视网膜总RNA和总蛋白,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测p21、细胞周期素依赖蛋白激酶2(CDK2) mRNA及蛋白在视网膜组织中的表达.结果 荧光及光学显微镜观察发现,rAd-p21组小鼠视网膜无灌注区、新生血管及突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核较PBS组和rAd-NC组减少;rAd-p21组无灌注区面积较PBS组和rAd-NC组明显减少,组间差异有统计学意义(F=101.634,P＜0.05).RT-PCR及Western blot检测结果显示,rAd-p21组p21 mRNA和蛋白表达明显高于对照组、PBS组及rAd-NC组,组间差异有统计学意义(F＝839.664、509.817,P＜0.05);rAd-p21组CDK2 mRNA和蛋白表达明显低于对照组、PBS组及rAd-NC组,组间差异也有统计学意义(F=301.858、592.882,P＜0.05).结论 rAd-p21可通过上调p21表达、降低CDK2表达,抑制RNV生成.     

缺氧对猴视网膜脉络膜微血管内皮细胞增生及p21表达的影响

背景 视网膜新生血管性疾病是临床常见的致盲性眼病,主要与血管内皮细胞增生有关,因此抑制血管内皮细胞的增生成为防治视网膜新生血管性疾病的研究重点.p21参与调控细胞在G1/S期的转变,抑制细胞增生,但p21在视网膜新生血管性疾病中的表达与血管内皮细胞增生的关系有待研究. 目的 探讨缺氧条件下体外培养猴视网膜脉络膜微血管内皮细胞(RF/6A)增生情况及其与p21表达变化的关系.方法 体外培养R F/6A细胞株,复苏传代后计数稀释,接种于培养瓶中,细胞贴壁后分为常氧对照组(体积分数5％ CO2+体积分数95％O2培养)和缺氧实验组(1％O2+5％ CO2+体积分数94％N2培养),缺氧实验组在缺氧培养箱中分别持续培养1、3、6、12h.用流式细胞仪检测常氧对照组和缺氧实验组RF/6A细胞周期的分布,MTT比色法检测并比较常氧对照组和缺氧实验组的细胞增生情况,Western blot检测p21在常氧对照组和缺氧实验组RF/6A细胞中的表达.结果 流式细胞仪检测结果显示,缺氧实验组G0/G1期细胞比例先降低后升高,各培养组间G0/G1期细胞比例的差异有统计学意义(F=20.083,P=0.000),S期和G2/M期细胞比例均先增高后降低,各组的总体差异均有统计学意义(F=7.861,P=0.001;F=10.305,P=0.003).缺氧实验不同时间组G0/G1期细胞比例均明显低于常氧对照组,而S期和G2/M期细胞比例明显高于常氧对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).MTT比色法检测结果显示,缺氧实验组细胞增生能力(A570值)先增强后减弱,各组的总体差异有统计学意义(F=7.768,P=0.001),缺氧实验3h组和6h组A570值分别为0.315 ±0.062和0.365±0.064,均明显高于常氧对照组的0.205±0.063,差异均有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测结果显示,p21在缺氧实验组的表达先降低后升高,各组的总体比较差异有统计学意义(F=16.738,P=0.000),缺氧实验组各时间点细胞中p21相对表达量均明显低于常氧对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 缺氧早期p21表达下调并诱导RF/6A细胞增生,但随着缺氧时间的延长,p21的表达上调,同时细胞增生将受到抑制.     

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对视网膜血管内皮细胞IGF-1/VEGF信号通路的抑制作用

背景 视网膜新生血管(RNV)是多种眼底血管疾病的共同表现,研究证实胰岛素样生长因子(IGF-1)能够刺激血管内皮细胞的增生,从而促进新生血管的形成,而多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)在IGF-1信号转导的过程中发挥转录抑制的作用.但PSF在RNV形成过程中的作用尚不清楚.目的 研究PSF对IGF-1/血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的调控作用.方法 将猕猴视网膜血管内皮细胞RF/6A进行培养后分为Pegfp-C2-PSF质粒转染组、pGenesil-PSF-RNAi质粒转染组及各自的对照组,分别在细胞中转入真核质粒Pegfp-C2-PSF、pGenesil-PSF-RNAi及相应的空白质粒.各组细胞培养液中分别添加或不添加胰岛素样生长因子1(IGF-1)以刺激细胞生长,采用MTT法检测各组RF/6A细胞的增生率并筛选各组最适PSF剂量,用于进一步的实验.采用逆转录PCR法测定和比较不同PSF转染组间用或不用U0126处理组间RF/6A细胞中VEGF mRNA的表达;采用Western blot法验证PSF对IGF-1诱导的细胞外调节蛋白激酶(ERK)活化的促进作用.结果 IGF-1刺激后Pegfp-C2-PSF质粒转染组以0.50 μg PSF为最适剂量,其RF/6A细胞的增生率为0.220±0.020,细胞中VEGF mRNA相对表达量为0.79±0.07,分别低于其对照组的0.260±0.006和未转染组的1.26±0.19,差异均有统计学意义(P=0.040、0.016);IGF-1刺激后pGenesil-PSF-RNAi质粒转染组以1.00 μg PSF作为最适剂量,其RF/6A细胞增生率为0.35±0.02,VEGF mRNA相对表达量为2.29±0.43,分别高于其对照组的0.210±0.019和未转染组的1.26±0.19,差异均有统计学意义(P=0.003、0.019).IGF-1刺激后1、3、6 h Pegfp-C2-PSF质粒转染组细胞中pERK蛋白表达量均明显低于未转染组,差异均有统计学意义(P=0.017、0.000、0.000).Pegfp-C2-PSF质粒转染组U0126+处理后细胞中VEGF mRNA的相对表达量为0.93±0.21,明显低于未转染组的1.32±0.08,差异均有统计学意义(P=0.037),同时明显低于Pegfp-C2-PSF质粒转染组无U0126处理的细胞中VEGF mRNA的相对表达量1.23±0.09,差异有统计学意义(P=0.002).结论 PSF可抑制IGF-1诱导的RF/6A细胞中的ERK信号通路的活化,下调VEGF在RF/6A细胞中的表达,进而抑制RF/6A细胞的增生.     

Chemerin对恒河猴脉络膜-视网膜内皮细胞血管形成的影响及其机制研究

目的　探究Chemerin对恒河猴脉络膜-视网膜内皮细胞RF/6A血管形成的影响及其可能作用机制。方法　RF/6A细胞随机分为3组，其中CO组:正常培养RF/6A细胞24 h；CH组:RF/6A细胞与10 μg·L^-1 Chemerin混合培养24 h；CN组:在CH组基础上+200 μmol·L^-1N-乙酰半胱氨酸混合培养24 h。通过荧光探针-二氢乙啶(DHE)法、MTT法、细胞划痕实验、基质胶(Matrigel)法、Western blot等检测CO组、CH组、CN组RF/6A细胞活性氧（ROS）表达水平、增殖情况、迁移能力、管腔形成、p38MAPK蛋白表达的差异。结果　CH组RF/6A细胞中ROS表达水平、细胞增殖数量均显著高于CO组、CH组（均为P<0.05）。CO组、CH组、CN组RF/6A细胞迁移面积(像素)分别为31 268±1397、56 489±2653、39 684±1864，细胞管腔形成数量分别为（1.06±1.12）个、（6.04±2.24）个、（3.08±3.67）个，3组间细胞迁移面积、管腔形成数量比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。Western blot检测结果显示，CH组RF/6A细胞中p38MAPK蛋白相对表达量显著高于CO组、CN组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　Chemerin对RF/6A细胞血管形成有促进作用，其机制与ROS介导的MAPK通路激活有关。     

曲安奈德对缺氧条件下恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞VEGF表达的影响

目的:研究曲安奈德对缺氧条件下恒河猴视网膜脉络膜内皮细胞VEGF表达的影响,探讨曲安奈德治疗视网膜脉络膜新生血管的作用机制。方法:采用免疫组化图像分析和半定量RT-PCR方法,检测曲安奈德对正常和缺氧条件下RF/6A细胞VEGF表达的影响。结果:缺氧条件下VEGF蛋白在细胞胞质中的染色强度明显增强,加入曲安奈德后VEGF蛋白在细胞胞质中的染色强度明显减弱,正常条件下的VEGF蛋白的A值为276.8±8.6;正常加药组的A值为137.1±10.2;缺氧条件下的A值为406.1±8.8;缺氧加药组的OD值244.2±12.8。半定量RT-PCR表明VEGFmRNA在正常对照组RF/6A细胞中的相对表达量为1.38±0.05;缺氧对照组RF/6A细胞中的相对表达量为5.41±0.06;正常加药组RF/6A细胞中的相对表达量为0.70±0.06;缺氧加药组RF/6A细胞中的相对表达量为4.23±0.05,以上两种方法,缺氧对照组与正常对照组比较、缺氧对照组与缺氧加药组比较、正常对照组与正常加药组比较差异均有显著性意义(P=0.000)。结论:缺氧状态下RF/6A细胞中VEGF的表达明显增高,曲安奈德能显著抑制正常和缺氧状态下RF/6A细胞中VEGF的表达。     

Smac对人晶状体上皮细胞增生的抑制作用及促凋亡作用

背景 晶状体后囊膜混浊(PCO)是囊外白内障摘出术后的主要并发症,其发病机制与晶状体上皮细胞(LECs)的增生、移行和上皮-间质转化(EMT)有关,探讨相关的预防和靶向治疗措施至关重要.目的 探讨Smac对人LECs增生和凋亡的作用及防治PCO的生物学作用. 方法 对HLE-B3细胞株及Smac过表达人LECs株进行培养,将培养的HLE-B3细胞分为PBS组、空质粒转染组和siRNA-Smac3转染组,分别将PBS、空质粒载体和带有增强型绿色荧光蛋白(GFP)的siRNA-Smac3质粒转染细胞24 h,计算siRNA-Smac3质粒转染率.在细胞培养液中分别添加不同质量浓度(5、10、20和50 μg/ml)TGF-β2或200 μmol/LH2O2以建立PCO模型或氧化应激凋亡模型.将细胞分为PBS组、TGF-β2组和Smac过表达+TGF-β2组,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞增生活力;将细胞分为PBS组、H2O2组和siRNA-Smac+H2O2组,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;分别采用实时定量PCR和Western blot法检测培养的细胞中Smac、caspase-3及增生细胞核抗原(PCNA)mRNA及蛋白的相对表达量. 结果 siRNA-Smac3质粒转染细胞后GFP阳性细胞达80％以上,荧光定量PCR筛选出最佳干扰质粒为siRNA-Smac3.siRNA-Smac3转染组GFP阳性细胞率为(72.32±2.31)％,明显高于空质粒载体组的(4.91±0.24)％,差异有统计学意义(t=116.342,P＜O.001).LECs中Smac mRNA相对表达量为35.21±4.11,高于空质粒载体组的15.24±2.48,差异有统计学意义(t=215.47,P＜0.05).20 μg/ml TGF-β2作用后PBS组、TGF-β2组和Smac过表达+TGF-β2组的细胞增生率分别为(98.4±1.7)％、(98.9±0.1)％和(64.2±3.1)％,Smac过表达+TGF-β2组明显低于TGF-β2组,差异有统计学意义(P＜0.05).PBS组、H2O2组和siRNA-Smac+H2 O2组细胞凋亡率分别为(2.9±1.2)％、(45.1±4.5)％和(27.5±1.8)％,siRNA-Smac+H2 O2组细胞凋亡率明显低于H2O2组,差异有统计学意义(P＜0.05).荧光定量PCR结果显示,PBS组、H2 O2组和siRNA-Smac+ H2 O2组caspase-3 mRNA相对表达量分别为0.321±0.103、0.715±0.112和0.479±0.209,siRNA-Smac+H2O2组细胞中caspase-3 mRNA相对表达量明显低于H2 O2组,差异有统计学意义(P＜0.05);PBS组、TGF-β2组和Smac过表达+TGF-β2组细胞中PCNA mRNA相对表达量分别为0.299±0.013、0.645±0.102和0.490±0.209,与TGF-β2组比较,Smac过表达+TGF-β2组细胞中PCNA mRNA相对表达量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot结果显示,caspase-3蛋白在siRNA-Smac+H2O2组和H2O2组相对表达量为0.712±0.012和0.973±0.051,siRNA-Smac+ H2 O2组细胞中caspase-3蛋白的相对表达量明显低于H2O2组,差异有统计学意义(t=132.52,P＜0.05);PCNA在Smac过表达+TGF-β2组和TGF-β2组,相对表达量为0.782±0.212,相对表达量为1.126±0.251,Smac+TGF-β2组PCNA蛋白相对表达量显著低于TGF-β2组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Smac基因抑制人LECs株HLE-B3细胞系的增生并促进细胞的凋亡,其可能用于防治PCO.     

白细胞介素-6对糖尿病小鼠角膜缘干细胞活化的促进作用和角膜上皮愈合的加速作用

背景 白细胞介素(IL)-6既介导炎症反应过程又在损伤修复中发挥重要作用,但其具体机制及其在糖尿病角膜组织损伤修复中的作用值得探讨. 目的 探讨IL-6在正常和糖尿病小鼠角膜缘干细胞活化和角膜上皮修复过程中的作用及其机制.方法 正常6～8周龄C57B L/6小鼠52只,采用随机数字表法随机分为正常对照鼠32只和糖尿病模型鼠20只,采用50 mg/kg链脲佐菌素连续腹腔内注射5d的方法诱导建立小鼠糖尿病模型.正常对照小鼠和糖尿病模型小鼠均行角膜上皮刮除术,然后分别于刮除后即刻和48 h结膜下注射IL-6或等容量PBS,采用荧光素染色法评价随时间延长的角膜上皮的愈合情况.体外培养小鼠角膜上皮干/祖细胞(TKE2细胞系),采用结晶紫染色法评估不同质量浓度IL-6处理后细胞克隆率(CFE),并与空白对照组进行比较;采用免疫荧光检测法和Western blot法检测细胞和小鼠再生上皮中干细胞标志物△NP63、Ki67的表达以及关键转录因子STAT3磷酸化水平;采用实时荧光定量PCR法和ELISA法检测小鼠角膜再生上皮中IL-6的mRNA及蛋白水平.结果 角膜荧光素染色检查显示,正常对照小鼠和糖尿病模型小鼠PBS注射组与IL-6注射组注射后24、48和72 h残留角膜上皮缺损面积占原始缺损面积的百分比随角膜上皮损伤后时间延长均明显缩小,同时间点IL-6注射组角膜上皮缺损面积均明显小于PBS注射组,组间总体差异均有统计学意义(正常对照组:F分组=19.982,P＜0.01;F时间=589.350,P＜0.01;糖尿病组:F分组=25.411,P＜0.01;F时间=334.807,P＜0.01).空白对照组及10、20、50、100 ng/ml IL-6处理组CFE分别为(13.23±1.12)％、(15.87±1.30)％、(21.69±1.62)％、(25.33±1.28)％和(18.67±1.54)％,随着IL-6质量浓度的增加CFE逐渐增加,总体比较差异有统计学意义(F=35.547,P＜0.01).50 ng/ml IL-6处理5、10、15、30和60 min细胞中△NP63、Ki67和p-STAT3蛋白的相对表达量随着处理时间的延长均逐渐增加,各时间点细胞中△NP63、Ki67和p-STAT3蛋白的相对表达量均明显高于空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).糖尿病组和正常对照组小鼠角膜上皮刮除后24 h的再生上皮中IL-6 mRNA相对表达量分别为0.45±0.21和1.00±0.16,糖尿病组小鼠角膜再生上皮中IL-6 mRNA相对表达量较正常对照组小鼠下降56％,差异有统计学意义(t=3.42,P=0.03),糖尿病小鼠角膜上皮刮除后48 h的再生上皮中IL-6蛋白质量浓度为(257±12)ng/μl,明显低于正常对照组小鼠的(323±17) ng/μl,差异有统计学意义(t=5.60,P＜0.01). 结论 IL-6能够通过激活STAT3信号通路促进正常和糖尿病小鼠角膜缘干细胞的活化和增生,进而促进角膜上皮修复,而封闭内源性IL-6则会延迟小鼠角膜上皮的修复.     

复方血栓通对猴脉络膜一视网膜内皮细胞增生、移行和管腔形成的作用

目的探讨复方血栓通干预猴脉络膜．视网膜内皮细胞（Rr／6A）参与血管生成的作用及机理。方法实验研究。本研究分为四部分：①取对数生长期RF／6A细胞进行培养,设立空白对照组、阳性对照组以及不同浓度的复方血栓通观察组．每组均加入终浓度为10ng／ml的血管内皮生长因子（VEGF）．阳性对照组加入终浓度0．20mg／ml的硫酸鱼精蛋白,复方血栓通观察组设立0．39～50．00mg／ml的多个不同浓度组。培养24h后采用酶联免疫检测仪测定各组吸光度4值,观察不同浓度的复方血栓通对VEGF诱导的RF／6A细胞增殖的影响。②设立空白对照组和终浓度为3．13、6．25、12．50mg／ml的复方血栓通组,培养24h后检测不同浓度复方血栓通对RF／6A细胞移行的影响。⑧设立空白对照组和终浓度为0．39、0．78、1．56mg／ml的复方血栓通组,培养12h后检测不同浓度的复方血栓通对RF／6A细胞管腔形成的影响;④设立空白对照组、终浓度为0．20mg／ml的硫酸鱼精蛋白阳性对照组和终浓度为1．56、3．13、6．25mg／ml的复方血栓通组,培养24h后,运用Western Blot和实时定量逆转录聚合酶链反应（RT．PCR）的方法,分别检测不同浓度的复方血栓通对RF／6A细胞表达VEGF、基质金属蛋白酶2（MMP．2）蛋白和mRNA的影响。对多组计量资料进行单因素方差分析。结果①各组间4值差异有统计学意义（F=158．669,P〈0．01）,同空白对照组比较,0．78～25．00mg／ml浓度的复方血栓通对VEGF诱导的RF／6A细胞增殖具有明显抑制作用（尸均〈0．011;②复方血栓通浓度为0、3．13、6．25和12．50mg／ml时,RF／6A细胞移行数分别为123．3±13．8、114．3±15．5、54．0±6．1和40．3±10．1,组间差异有统计学意义（B36．918,P〈0．01）;与空白对照组比较,6．25和12．50mg／ml浓度的复方血栓通对RF／6A细胞移行具有明显的抑制作用（P均〈0．01）;③复方血栓通浓度为0、0．39、0．78和1．56mg／ml时RF／6A细胞内皮管腔形成数分别为20．3±2．5、12．7±2．1、9．7±1．2和0．7±0．6,组间差异有统计学意义（F=64．324,P〈0．01）;与空白对照组比较,0．39、0．78和1．56mg／mA浓度的复方血栓通对RF／6A细胞内皮管腔形成均具有明显的抑制作用（P均〈0．01）,且抑制作用随浓度增加而增强;④空白对照组、阳性对照组以及1．56、3．13和6．25mg／ml浓度的复方血栓通组VEGF和MMP．2蛋白相对含量组间差异均有统计学意义（F=343．346、1670．505,P均〈0．01）;与空白对照组比较,其余各组均具有显著抑制RF／6A细胞VEGF和MMP-2蛋白表达的作用（P均〈0.01）,复方血栓通的抑制作用随浓度增加而增强;各组VEGF和MMP-2mRNA相对含量的差异也有统计学意义（F=228．130,208．579,P均〈0．01）,与空白对照组比较,其余各组均具有显著抑制RF／6A细胞VEGFmRNA表达的作用（P均〈0．01）,复方血栓通的抑制作用随浓度增加而增强。结论复方血栓通可能通过抑制RF／6A细胞增殖、移行以及管腔形成来抑制其参与新生血管生成．其机理可能与抑制RF／6A细胞VEGF、MMP-2的表达有关。     

miR-30b对大鼠糖氧剥夺性视网膜神经节细胞损伤的保护作用

背景 缺血缺氧损伤是引起大部分视觉系统损害的主要原因,目前尚无有效药物从根本上缓解缺血缺氧带来的损害.研究发现,微小RNA(miR)-30b有助于减轻缺血缺氧导致的心肌损伤,但其对糖氧剥夺的视网膜神经节细胞(RGCs)生存是否有类似的保护作用鲜有文献报道. 目的 研究重组腺相关病毒介导的miR-30b转染对糖氧剥夺RGCs的保护作用.方法 取出生后24 h的8只SD大鼠眼球,剥离出视网膜组织以进行RGCs的原代培养,将原代培养的细胞分为重组腺相关病毒(rAAV)-miR对照组、rAAV-miR-30b拟似物组、rAAV-miR-30b抑制物组和PBS组,分别在培养液中添加rAAV-miRNA、rAAV-miR-30b拟似物、rAAV-miR-30b抑制物或PBS培养细胞6d,RGCs∶AAV为1∶10 000.各组细胞分别进行低氧培养箱(37 ℃,体积分数5％ CO2、17％ N2、3％ O2)联合低糖(葡萄糖质量浓度为1.0 g/L)培养液进行培养以建立原代糖氧剥夺RGCs模型,并与正常培养(37℃、5％ CO2)的细胞进行对照.采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组细胞活力,采用免疫荧光染色法检测各组细胞中神经元特异性标志物TubulinⅢ的表达,并计算存活RGCs数目.采用Hoechst/PI染色法检测各组细胞的凋亡和坏死情况. 结果 培养7d的正常成熟RGCs可见1-3条完整的细长神经元突起及其分支.糖氧剥夺后随着时间延长,培养的RGCs逐渐减少和破坏,突起的主干结构破碎.rAAV-miR-30b拟似物组细胞相对活性分别为3.310±0.162,明显高于rAAV-miR-30b抑制物组和rAAV-miR对照组的0.949±0.141和0.900±0.181,差异均有统计学意义(t=10.508、10.296,均P＜0.001).存活的RGCs可表达TubulinⅢ,呈红色荧光.rAAV-miR-30b拟似物组TubulinⅢ阳性细胞数量为(13.800±1.924)/视野,明显多于rAAV-miR-30b抑制物组的(0.600±0.548)/视野和rAAV-miR对照组的(0.800±1.304)/视野,差异均有统计学意义(￡=15.141、14.912,均P＜0.001).rAAV-miR-30b拟似物组、rAAV-miR对照组和PBS组细胞凋亡率和死亡率的总体比较差异均有统计学意义(F=10.851,P=0.002;F=6.378,P=0.013),rAAV-miR-30b拟似物组细胞凋亡率和死亡率均明显低于rAAV-miR对照组和PBS组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 低氧培养箱联合低糖培养液建立稳定的原代RGCs糖氧剥夺模型;rAAV介导的miR-30b转染可抵抗糖氧剥夺对RGCs的损伤.     

缺氧诱导因子1α对早期糖尿病视网膜病变状态下人粒细胞系白血病细胞表面黏附分子CD18表达的调节

目的　观察在早期糖尿病视网膜病变(DR)状态下,缺氧诱导因子1α（HIF-1α）对细胞表面黏附分子CD18表达以及白细胞和血管内皮细胞黏附的影响。方法　收集早期DR患者及年龄匹配的健康人外周血血清,用于体外培养人粒细胞系白血病细胞（HL60）和恒河猴视网膜血管内皮细胞系细胞（RF/6A）。分为糖尿病血清培养组（B组）、糖尿病＋HIF 1α反义寡核苷酸组（ASODN）（C组）、糖尿病＋HIF 1α 正义寡核苷酸组（SODN）（D组）,健康人血清培养细胞为正常对照组（A组）。以流式细胞仪和Real-time PCR分别检测HL60细胞表面CD18蛋白阳性细胞比例和CD18 mRNA的表达水平,以虎红染色法观察HL60细胞和RF/6A细胞的黏附率。结果　A、B、C、D组CD18阳性细胞比例分别为17.06±6.01、42.23±2.60、25.33±3.05、32.40±10.57,各组之间差异有统计学意义（F=36.47,P＜0.001）。和A组比较,B、C、D组CD18 mRNA水平分别是A组的21.05±2.07、2.23±0.96、25.07±2.27倍,各组之间差异有统计学意义（F＝180.34,P＜0.001）。A、B、C、D组细胞黏附率分别为0.06±0.002、0.09±0.10、0.05±0.007、0.07±0.01,各组之间差异有统计学意义（F=13.06,P=0.002）。结论　在体外培养条件下,糖尿病血清可以促进HL60细胞表达CD18蛋白和CD18mRNA,促进HL60细胞和血管内皮细胞的黏附,HIF-1α表达被抑制后,这种促进作用减弱。HIF-1α对糖尿病状态下细胞表面黏附分子CD18表达及白细胞和血管内皮细胞之间的黏附具有调节作用。      

Treg细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎发病过程中的动态变化

背景 研究表明,调节性T细胞(Treg)是一类负向调控免疫应答的T细胞亚群,在维持免疫稳态和免疫耐受方面发挥重要作用.自身免疫性葡萄膜炎是一种免疫性眼病,Treg细胞在自身免疫性葡萄膜炎发生和发展过程中的调控作用尚不完全清楚. 目的 观察Treg细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠发病过程中的动态变化.方法 选取84只6～8周龄SPF级Lewis大鼠,采用随机数字表法随机分为模型组和对照组.模型组于大鼠双后足垫、腹部双侧及背部皮下注射光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)1177-1191、结核菌素(TB)、完全弗氏佐剂(CFA)和PBS混合乳化剂共300μl,对照组大鼠以同样方法皮下注射等容量不含IRBP的TB与CFA乳化剂.分别于造模后第9、13、18、23、28、35、48天观察模型组和对照组大鼠的眼部炎症症状并根据严重程度进行炎症评分.于造模后上述时间点分别处死模型组及对照组大鼠各6只,采用常规组织病理学方法观察各组大鼠眼部虹膜、睫状体和视网膜组织形态变化;分离大鼠脾脏淋巴细胞,采用流式细胞术检测大鼠脾脏悬液中Treg细胞特异性标志物Foxp3标记细胞比例;采用实时荧光定量PCR法检测大鼠脾脏淋巴细胞中Foxp3 mRNA相对表达量变化. 结果 免疫后第8天模型组大鼠虹膜血管扩张充血,开始出现眼部炎症表现,免疫后第13天虹膜血管明显扩张,前房可见渗出和积脓,瞳孔区有膜样渗出,炎症评分最高,为(3.75±0.42)分,之后眼部炎症反应逐渐减轻,至免疫后第23天炎症反应接近消失,造模后第7、11、13、15、17、19、21天间模型鼠眼炎症反应评分总体比较差异有统计学意义(F=81.709,P＜0.001).对照组大鼠眼部检查正常.组织病理学观察发现,模型组大鼠虹膜、睫状体、视网膜等组织有中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞浸润,组织结构排列疏松,以免疫后第13天最为明显,此后逐渐减轻,至免疫后第23天虹膜、睫状体和视网膜组织结构接近正常,炎性细胞浸润消失.流式细胞技术检测发现,免疫后第13、18、23、28、35、48天模型组大鼠脾脏Foxp3标记细胞比例分别为(5.50±0.64)％、(13.36±0.98)％、(10.34±0.79)％、(9.58±1.02)、(6.73±0.81)％和(5.58±0.47)％,明显高于对照组的(2.80±0.38)％、(3.36±0.53)％、(3.65±0.57)％、(3.37±0.43)％、(3.33±0.50)％和(3.13±0.61)％,差异均有统计学意义(t=-6.272、-15.556、-11.910、-9.753、-6.154、-5.491,均P＜0.01).模型组和对照组造模后各时间点大鼠脾脏淋巴细胞中Foxp3 mRNA的相对表达量变化与Foxp3标记细胞比例变化趋势基本一致. 结论 EAU大鼠葡萄膜炎的发病及转归与Treg细胞数量和功能变化密切相关.