重复序列PCR与多位点分型技术在热带假丝酵母菌基因分型中的比较

目的分析比较重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)与多位点分型技术(MLST)在热带假丝酵母菌基因分型中的应用。方法收集来自5个地区6家医院的147株热带假丝酵母菌,分别以Ca-21、Ca-22、Com-21两两组合为引物,选用最合适的引物对进行REP-PCR后通过电泳获得REP-PCR型。在不同型别中各挑选3株采用MLST法扩增热带假丝酵母菌的6个管家基因,扩增片段测序后与数据库比对得到相应的序列型(sequencetype,ST)。结果 REP-PCR以Com21-Com21为引物对分型效果最好,REP-PCR与MLST分型结果一致。147株热带假丝酵母菌产生A～H共8种REP-PCR型,分别对应MLST的ST146、新型1、ST136、ST127、ST177、ST169、新型2和ST117。结论 REP-PCR与MLST在热带假丝酵母菌的基因分型中分辨率相同,而REP-PCR更为方便迅速,可作为实验室大量菌株分型的首选方法。     

光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌环境分离株的氟康唑敏感性与多位点序列分型分析

目的 分析分离自树叶、树皮和腐殖质的光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌,对其进行耐药性分析和分子流行病学分型,比较环境分离株与临床分离株的进化关系,为流行病学调查及有效控制侵袭性假丝酵母菌感染提供理论支持。 方法 2017年9月采集云南省境内环境标本,分离培养提取菌株DNA进行转录间隔区测序鉴定;使用微量肉汤稀释法进行氟康唑药敏实验;采用多位点序列分型进行分子流行病学分型;利用eBURST分析菌株亲缘性。 结果 采集环境标本200份,分离光滑假丝酵母菌3株和热带假丝酵母菌10株。 13株环境分离株均对氟康唑敏感。 3株光滑假丝酵母菌的序列型均为ST3,10株热带假丝酵母菌被分为7个二倍体序列（DST）,包括4个新DST型（DST813 ~ DST816）。 eBURST分析显示,光滑假丝酵母菌均为CC3型,CC730是热带假丝酵母菌环境株的主要型别。 结论 环境分离株与临床分离株存在相同的起源株。 树叶、树皮或腐殖质中的光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌可能对人类健康造成危害,是人类假丝酵母菌感染的潜在来源。      

重复PCR指纹技术用于鲍曼不动杆菌基因分型

Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ（鲍曼不动杆菌）属条件致病菌，近年来随激素及抗生素的广泛应用，所致的医院感染显著增多，特别容易造成重症监护病房（ＩＣＵ）的暴发流行［１］。建立一种快速、准确的分型方法对于流行病学研究及感染的控制有重要意义。重复ＰＣＲ指纹技术具有简便、快速、分辨力强的特点［２］。我们采用该法对２９株鲍曼不动杆菌作分型研究取得满意效果。１　材料与方法１１　菌株的收集与鉴定　所有菌株均分离自１９９８年３～７月我院临床各科送检的痰液、脓液、眼分泌物及吸痰清洁液，经ＡＴＢ细菌…     

微卫星多态性和多位点序列分析技术在光滑念珠菌基因分型中的应用评估

目的评估微卫星多态性分析技术在临床光滑念珠菌基因分型中的作用。方法收集2011年1月至2012年12月仁济医院和东方医院临床分离的光滑念珠菌59株,采用多位点序列分析(MLST)和微卫星多态性分析技术进行基因分型,比较2种基因分型方法的结果和分辨力。结果 59株光滑念珠菌经MLST分型得到6个序列型,其中ST-7型43株、ST-10型7株、ST-15型和ST-55型各3株、ST-3型2株、ST-43型1株,鉴别力指数(DP)为0.456;经微卫星多态性分析方法分为10型,其中A型25株、B型10株、C型8株、D型6株、E型3株、F型和G型各2株、H~J型各1株,DP为0.770。结论微卫星多态性分析方法简便、快速,分辨力高于MLST技术,可作为实验室基因分型的首选方法。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA重复序列PCR的分型研究

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (ＭＲＳＡ)是一种重要的致病菌 ,具有多重耐药性 ,可导致严重的医院感染 ,故治疗比较困难。对ＭＲＳＡ进行分型研究 ,查明其传播途径 ,是控制ＭＲＳＡ传播的环节之一。本文旨在建立一种简便、快速、可靠、分辨率好的分型方法。1　材料与方法1.1　材料　①菌株 :金黄色葡萄球菌来自 1999年 3月至 1999年 5月湖南医科大学附属湘雅医院烧伤科患者的烧伤创面。②试剂 :鉴定ＭＲＳＡ的培养基购自浙江军分区后勤部卫生防疫检疫所。引物ＥＲＩＣ 2 5′ ＡＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＣＧ 3′[1] ,由上海生工…     

应用PCR—SSP对异基因骨髓移植供受者HLA—DQA1位点的基因分型

为探索一种可靠性和灵敏性高的ＨＬＡⅡ类基因的配型方法，根据Ｏｌｅｒｕｐ提出的１６个特异性引物序列，用多聚酶链反应－序列特异性引物（ＰＣＲ－ＳＳＰ）方法，对ＤＱＡ１基因位点的多态性进行检测和分型，并与多聚酶链反应－序列特异性寡核苷酸探针杂交（ＰＣＲ－ＳＳＯＰＨ）及多聚酶链反应－单链构型多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）检测结果进行比较，获得了一致的分型结果。ＰＣＲ－ＳＳＰ可分辨出ＤＱＡ１位点的纯合体和杂合体     

随机扩增多态性DNA技术用于白假丝酵母菌临床分型

白假丝酵母菌亦称白念珠菌，是医院感染常见的病原菌。本研究应用随机扩增多态性（RAPD）DNA技术用于白假丝酵母菌分型，以了解其流行病学意义。     

REP-PCR分型法用于白假丝酵母菌群分析

目的运用Agilent生物分析仪对临床白假丝酵母菌进行重复序列（REP）-聚合酶链反应（PCR）分型,并分析其流行趋势。方法设计REP引物,进行PCR扩增,用DL7500 Labchip芯片在Agilent 2100生物分析仪上对产物做微流电泳,获得虚拟凝胶视图,再运用GelCompareⅡ软件对其DNA指纹图谱做聚类分析。结果白假丝酵母菌菌株指纹图谱相似度较高,〉80%以上。被分析的100株临床株可分为9个基因型。结论REP-PCR的Agilent 2100同源性分析具有快速、易于操作、高重复性和高分辨率等优点,可广泛用于流行病学调查与研究。     

白色念珠菌体外生物膜形成与基因分型关系的研究

目的 探讨白色念珠菌临床分离株体外生物膜形成与基因分型的可能关系.方法 选取52株呼吸道白色念珠菌分离株体外黏附生长24 h,用XTT减低法测定其增殖情况.采用重复序列PCR指纹技术分析白色念珠菌菌株基因类型,并进行聚类分析.结果 根据黏附生长的白色念珠菌增殖情况,有26株临床株形成生物膜能力"高",其余菌株形成生物膜能力"低".实验菌株的遗传相似系数为0.79±0.13,生物膜形成能力"高"及生物膜形成能力"低"的菌株间相似系数分别为0.8±0.14和0.81±0.12.结论 呼吸道白色念珠菌分离株的亲缘关系较近,但生物膜形成能力形似的菌株间未出现基因型聚集.     

微卫星多态性和重复序列PCR分析技术在热带假丝酵母菌基因分型中的应用

目的:评估微卫星多态性分析技术和重复序列PCR分析技术在临床热带假丝酵母菌基因分型中的应用。方法:收集2014年8月到2015年11月来自上海4家医院临床分离的热带假丝酵母菌共50株,分别以Ca21、Ca22、Com21两两组合为引物,选用最合适的引物组合进行重复序列聚合酶链反应(repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction,REP-PCR)后电泳获得REP-PCR分型。采用Ctrm1、Ctrm10、Ctrm12这3种微卫星标记进行微卫星多态性分析。比较2种基因分型方法的结果和分辨力。结果:REP-PCR以Ca21-Com21引物组合的分型效果最好,50株热带假丝酵母菌经REP-PCR分型得到共7种REP-PCR型,鉴别力指数(index of discriminatory power, DP)为0.75。经多态性分型得30种基因型,DP为0.97。结论:微卫星多态性分析简便、快捷,分辨力高于REP-PCR检测,可作为实验室基因分型的首选方法。     

耐氟康唑光滑念珠菌耐药机制研究

目的探讨ERG11、CDRI和CDR2基因差异表达在耐氟康唑光滑念珠菌耐药性形成中的作用。方法采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（PCR）对临床分离的耐氟康唑药物株、剂量依赖性敏感株和敏感株共22株光滑念珠菌的ERG11、CDR1和CDR2基因表达的mRNA进行相对定量,以2-△△Ct表示试验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。所有数据采用R（2．15．2）软件进行统计学分析。结果耐药株及剂量依赖性敏感株CDR1、CDR2以及ERG11基因的mRNA表达量均高于敏感株（P〈0．05）,且随着对氟康唑耐药程度增加而增加。结论CDR1、CDR2及ERG11基因表达上调是光滑念珠菌临床分离株对氟康唑耐药的主要分子机制。     

医院感染光滑念珠菌耐药性及流行病学分析

目的分析仁济医院光滑念珠菌的基因分型以及不同基因型光滑念珠菌的药物敏感性结果,以了解仁济医院光滑念珠菌的耐药性和流行情况,并探讨两者间是否存在相关性。方法运用多位点序列分型(MLST)技术,对34株光滑念珠菌的6个管家基因进行测序分析,利用Clustalx软件与MLST数据库进行序列比对,确定其等位基因谱型及菌株序列型(ST)。利用Clustalx软件绘制进化树,同时通过eBURST程序将菌株分为各个克隆系,以比较不同基因型之间亲缘关系的远近。采用ATB FUNGUS半自动真菌鉴定和药物敏感性分析系统进行药物敏感性试验,结合基因分型结果,运用Ridit分析方法探究两者的联系。结果 34株光滑念珠菌经MLST分型,得到6个ST,其中ST-7 27株,占总数的79.4%(27/34);ST-10 3株,占总数的8.8%(3/34),其余4型(ST-3、ST-15、ST-43、ST-55)各1株。34株光滑念珠菌对氟胞嘧啶、两性霉素B 100.0%敏感,对伏立康唑和氟康唑的敏感率分别为97.1%和91.2%,伊曲康唑抑菌效果差,敏感率仅11.8%。以ST-7为标准组,氟康唑、伏立康唑及伊曲康唑药物组中ST-10组及其他ST组均包含标准组的平均Ridit值。结论 ST-7为仁济医院光滑念珠菌中优势菌株;光滑念珠菌的耐药谱与基因型相关性差。     

Molecular typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: Comparison of PCR-based open reading frame typing,multilocus sequence typing,and Staphylococcus protein A gene typing

The recently developed PCR-based open reading frame typing (POT) method is a useful molecular typing tool. Here, we evaluated the performance of POT for molecular typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolates and compared its performance to those of multilocus sequence typing (MLST) and Staphylococcus protein A gene typing (spa typing). Thirty-seven MRSA isolates were collected between July 2012 and May 2015. MLST, spa typing, and POT were performed, and their discriminatory powers were evaluated using Simpson's index analysis. The MRSA isolates were classified into 11, 18, and 33 types by MLST, spa typing, and POT, respectively. The predominant strains identified by MLST, spa typing, and POT were ST8 and ST764, t002, and 93-191-127, respectively. The discriminatory power of MLST, spa typing, and POT was 0.853, 0.875, and 0.992, respectively, indicating that POT had the highest discriminatory power.Moreover, the results of MLST and spa were available after 2 days, whereas that of POT was available in 5 h. Furthermore, POT is rapid and easy to perform and interpret. Therefore, POT is a superior molecular typing tool for monitoring nosocomial transmission of MRSA.     

Clonality investigation of clinical Escherichia coli isolates by polymerase chain reaction-based open-reading frame typing method

Escherichia coli (E. coli) causes urinary tract infections, pneumonia, surgical site infections, and bloodstream infections and is the important pathogen for both community-acquired and healthcare-associated infections. To investigate the clonality of E. coli is important for infection control and prevention. We aimed to investigate the clonality of clinical E. coli isolates using Cica Geneus E. coli polymerase chain reaction (PCR)-based open-reading frame typing (POT) KIT and clarify the clinical usefulness of this kit. About 124 E. coli isolates obtained from inpatients at Sapporo Medical University Hospital were used. The POT method was used to classify 124 clinical isolates into 87 POT numbers. In addition to the clonality, it was possible to obtain additional information that 20 of the 124 isolates were extended-spectrum β-lactamase (ESBL) producing E. coli (5 isolates of CTX-M-1 group and 15 isolates of CTX-M-9 group) and 13 were sequence type (ST) 131 clone. Furthermore, when these ESBL-producing 20 isolates were compared with pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) or multilocus sequence typing (MLST), Simpson's index of diversity was 0.968 in POT method, 0.979 in PFGE, and 0.584 in MLST. POT method had an analytical power similar to that of PFGE. In conclusion, attention should be paid to the difference in the interpretation of the results between the POT method and the PFGE, but POT method may be useful to timely monitor the spread of E. coli in medical facilities.     

聚合酶链反应反向斑点杂交快速检测及鉴定念珠菌

目的　研究以非培养为基础的快速检测与鉴定念珠菌的方法。方法　将白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌种特异探针加尾后固定在硝酸纤维素膜上;用氯化苄法提取念珠菌ＤＮＡ,采用真菌特异通用引物ＰＣＲ 扩增ＤＮＡ,在扩增过程中用Ｂｉｏ１１ｄＵＴＰ 标记扩增产物,然后分别与白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌特异探针杂交。结果　对１４ 种念珠菌扩增均为阳性,对３ 种常见细菌扩增均为阴性。３ 种念珠菌只与其对应探针杂交。结论　该方法简便、快速、准确,适于临床实验室快速检测与鉴定念珠菌。     

聚合酶链反应检测革兰阴性细菌16S rRNA

[目的]寻找诊断细菌感染病原更为敏感和有效的方法.[方法]根据细菌16S rRNA基因的高度保守性,设计合成革兰阴性细菌的共同引物,采用聚合酶链反应检测已知的革兰阴性细菌9株,革兰阳性菌4株.[结果]革兰阴性菌检测阳性率为100%,(检测革兰阳性细菌4株结果均为阴性).采用倍比稀释法检出大肠杆菌的最低浓度为4 CFU/ml.[结论]所用引物具有良好的特异性和敏感性,能达到初步鉴定细菌种属的目的.