端粒酶逆转录酶启动子联合CD自杀基因靶向杀伤人肝癌细胞研究

目的 利用肿瘤特异性人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子介导自杀基因CD表达,检测其促进5-FC对肝癌细胞系的杀伤作用.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术获得hTERT基因的启动子片段,将其连至SV40增强子序列后,并克隆到表达荧光素酶基因的报告质粒上,检测hTERT基因启动子在肝癌细胞系Bel-7402和人成纤维细胞HDF中的转录活性,同时将CD自杀基因连至该调控序列后,转染肝癌细胞Bel-7402,通过逆转录(RT)-PCR、噻唑蓝(MTT)比色法检测其作为肝癌基因治疗中肿瘤特异性靶向杀伤载体的可行性.结果 成功构建pGL3-SV40-hTERT载体和SV40-hTERT-CD-GFP质粒载体,转染ST-CD载体后Bel-7402细胞表达CD基因,转染PGL3-SV40-hTERT质粒后Bel-7402细胞中hTERT启动子高表达,相对活性为354%.与未转染组比较,5-Fc对转染SV40-hTERT-CD-GFP质粒载体的肝癌细胞Bel-7402的杀伤效应明显增强(F=27.831,P<0.01).结论 hTERT启动子在肝癌细胞系中具有较强的转录活性,能有效地诱导CD自杀基因的表达.     

端粒酶启动子调控p53基因表达对T24细胞的影响

目的 探讨端粒酶催化亚基（hTERT）启动子调控p53基因在膀胱肿瘤细胞T24中表达对细胞的影响。方法 将成功构建的phTERT-p53载体，瞬时转染膀胱肿瘤T24细胞；应用流式细胞仪观察细胞凋亡率变化，透射电镜下观察细胞凋亡形态学改变。结果 hTERT启动子调控p53基因表达使细胞凋亡率明显升高[24、48h凋亡率：实验组15．42％、36．57％；转染绿色荧光蛋白基因（GFP）组5．16％、8．19％；阴性对照组4．49％、7．18％]，电镜下观察到典型凋亡改变。凋亡指数达25％。结论 hTERT启动子能够激活phTERT-p53载体表达p53，使肿瘤细胞凋亡增加。     

hTERT启动子驱动TRAIL基因表达载体对结肠癌HT-29细胞的抑制作用研究

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因表达载体,探讨其对结肠癌细胞HT-29增殖的抑制作用。方法构建重组质粒pshuttle-TRAIL和pshuttle-hTERT-TRAIL,通过脂质体转染结肠癌HT-29细胞,采用MTT法检测重组质粒对细胞增殖的影响及流式细胞术检测细胞凋亡的变化。结果 pshuttle-TRAIL和pshuttle-hTERT-TRAIL组细胞增殖率低于空白对照组和空质粒转染组;流式细胞术检测转染后细胞凋亡率升高,并且pshuttlehTERT-TRAIL凋亡率高于pshuttle-TRAIL组。结论 hTERT启动子调控的TRAIL可明显抑制结肠癌细胞增殖以及诱导细胞凋亡,可能是结肠癌靶向治疗的新途径。     

肿瘤特异性结核抗原Ag85A基因慢病毒表达载体构建

目的构建小鼠端粒酶催化亚单位启动子(murine telomerase catalytic subunit promoter,PmTERT)调控的结核杆菌抗原基因Ag85A肿瘤特异性慢病毒表达载体,为肿瘤靶向性免疫基因治疗的研究奠定基础。方法用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法克隆PmTERT用荧光素酶(luciferase)活性检测方法研究PmTERT在小鼠和人肿瘤细胞及正常细胞中的转录活性。通过核酸分子克隆方法分别构建巨细胞病毒(cytomegalo virus,CMV)启动子和PmTERT调控的Ag85A基因慢病毒表达载体并用基因测序和Western blot方法对重组载体进行鉴定。结果本研究克隆的331 bp大小的PmTERT在小鼠Lewis肺癌细胞、人A549肺癌细胞、EC-109食管癌细胞中均有转录活性在小鼠NIH3T3胚胎成纤维细胞和人MRC-5胚肾成纤维细胞中无转录活性;成功构建分别由CMV启动子和PmTERT调控的Ag85A基因慢病毒表达载体pLVX-Ag85A-CMV和pLVXAg85A-PmTERT;感染pLVX-Ag85A-CMV的Lewis细胞和NIH3T3细胞均有Ag85A蛋白表达感染pLVX-Ag85APmTERT的Lewis细胞有Ag85A表达感染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3细胞无g85A表达。结论PmTERT具有肿瘤特异性转录活性,其驱动的结核杆菌抗原基因可以在肿瘤细胞中靶向性表达。     

hTERT|CEA及CMV启动子在人结肠癌细胞株中的转录活性比较

目的：比较人端粒酶催化亚单位（hTERT）,癌胚抗原（CEA）及巨细胞病毒（CMV）启动子在人结肠癌细胞株LoVo和SW480中的转录活性。 方法：设计引物应用PCR法从人结肠癌基因组中克隆hTERT和CEA启动子;用双酶切和PCR法切除原始载体pLVX-EGFP-3FLAG中的CMV启动子后,将hTERT,CEA启动子与该载体重组,构建出重组质粒pLVX-hTERTp-EGFP-3FLAG和pLVX-CEAp-EGFP-3FLAG;将上述两种质粒及原始载体（含CMV启动子）分别瞬时转染人结肠癌细胞株LoVo和SW480后,检测两种细胞株绿色荧光蛋白表达。 结果：经PCR,酶切及测序鉴定,克隆及载体构建完全正确。CMV,hTERT及CEA启动子的转录活性（绿色荧光细胞数/总细胞数）在LoVo细胞中依次为54.7%,33.0%,9.5%;在SW480中依次为16.5%,10.1%,8.5%,差异均有统计学意义（均P<0.05）。 结论：在人结肠癌细胞株中,转录活性以CMV启动子最高,hTERT启动子次之,CEA启动子最低。该结果可为结肠癌的靶向性基因治疗研究提供参考。

     

双靶向调控CDX2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建5个拷贝的HRE和hTERTp双靶向调控表达CDX2基因的慢病毒表达载体,并在结肠癌LoVo细胞中检测其启动活性。方法 设计引物应用PCR法从人结肠癌基因组中克隆获得hTERT启动子,用双酶切和PCR法切除笔者所在课题组已构建的载体pLEGFP-5HRE-CEAp中的CEA启动子后,将hTERT启动子与该载体重组,构建出pLEGFP-5HRE-hTERTp;提取5HRE-hTERTp基因序列,同时双酶切切除pLVX-EGFP-3FLAG载体中的CMV启动子,同源重组构建获得pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体。设计引物应用PCR法从笔者所在课题组已构建的GV230-CDX2-EGFP载体中克隆获得CDX2基因序列,用双酶切和PCR法切除载体pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG中的EGFP后,将CDX2基因序列与该载体重组,构建出pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG。应用pLVX-5HRE-hTERTp- EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,通过观察绿色荧光蛋白EGFP的表达,鉴定hTERTp的启动活性。结果 经PCR和测序分析,pLEGFP-5HRE-hTERTp、pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG和pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG 3组质粒与设计一致,测序正确。将pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,有绿色荧光表达,提示hTERT启动子能够有效启动下游基因的表达。结论 成功构建了pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG及pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG载体,为后续的体外和体内研究打下了基础。     

Ki-67核心启动子在胃癌SCG-991细胞中的转录活性

目的 观察Ki-67核心启动子在人胃癌细胞中的转录活性.方法 使用缺失分析法分别从5'端和3'端对Ki-67基因启动子逐段缺失,得到不同长度的8个和3个截短DNA片段.分别插入pGL3-Basic载体后转染人胃癌SCG-991细胞,使用双荧光素酶检测系统鉴定转录活性,确定Ki-67基因核心启动子.比较Ki-67核心启动子与另2种肿瘤启动子hTERT和Survivin的转录活性.结果 自5'端缺失得到的-223～+771截短片段在SCG-991细胞内转录活性达到病毒SV40启动子活性的56.5%;自3'端缺失的-223～+30截短片段转录活性更强,为-223～+771片段活性的2.1倍,是hTERT启动子的1.7及Survivin启动子和15.3倍.结论 Ki-67核心启动子区域为-223～+30,在胃癌SCG-991细胞中的转录活性超过SV40启动子,以及hTERT启动子及Survivin启动子.     

5-氮-2′-脱氧胞苷对RKO结肠癌细胞株maspin基因去甲基化的转录调节作用

目的探讨 DNA5′ CpG岛去甲基化对 RKO结肠癌细胞株 maspin基因的转录调控作用及对细胞株生长增殖的生物学影响 ,寻找抗癌治疗的新靶点.方法应用甲基化特异性 PCR(methylation specific PCR, MSP)检测 RKO结肠癌细胞株 maspin基因核心启动子区 CpG岛甲基化情况;用特异性 DNA甲基转移酶抑制剂 5-氮- 2′-脱氧胞苷 (5- aza- 2′- deoxycytidine, 5- aza- CdR)作用结肠癌细胞株 72 h后 ,逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)检测 maspin mRNA表达,四唑盐 (MTT)比色、流式细胞仪检测用药前后 RKO细胞株生长存活率和细胞周期的变化.结果 RKO结肠癌细胞株 maspin基因核心启动子区存在 CpG岛甲基化.与对照组相比, 3组不同浓度 5- aza- CdR作用后, maspin基因 mRNA表达分别增加了 10.89、 16.91和 23.97倍,明显抑制肿瘤细胞生长,阻滞细胞周期于 G0/G1期, 诱导细胞凋亡, 凋亡率分别为 5.17%、 8.71%和 11.23%.结论 RKO结肠癌细胞株 maspin基因 5′端核心启动子甲基化可能是导致该基因表达沉默的主要原因;特异性甲基转移酶抑制剂 5- aza- CdR能较好地逆转 RKO细胞 DNA异常甲基化,并有效地激活因高甲基化所致 maspin基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡.     

体外构建双H1启动子SECs及其对HepG2细胞端粒酶活性的干扰作用

目的 构建针对端粒酶hTERT的双H1启动子SECs,并探讨其转录生成的siRNA对HepG2细胞端粒酶活性的抑制作用.方法 利用融合PCR技术,构建2个针对人端粒酶hTERT基因外显子不同片断的双H1启动子SECs,分别转染人肝癌细胞HepG2,转录生成siRNAs.用TRAP法和PCR-EIA法检测端粒酶活性,分析双H1启动子SECs对HepG2细胞端粒酶表达的干扰作用.结果 成功构建针对hTERT的双H1启动子SECs,其转录产物siRNA可明显抑制HepG2细胞端粒酶的活性.结论 siRNA SECs对HepG2细胞端粒酶hTERT基因表达有明显的干扰作用,为临床开展对肿瘤端粒酶基因干扰抑制的实验研究奠定了基础.     

5-氮-2''''-脱氧胞苷对RKO结肠癌细胞株maspin基因去甲基化的转录调节作用

目的探讨DNA5'CpG岛去甲基化对RKO结肠癌细胞株maspin基因的转录调控作用及对细胞株生长增殖的生物学影响,寻找抗癌治疗的新靶点。方法应用甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR,MSP)检测RKO结肠癌细胞株maspin基因核心启动子区CpG岛甲基化情况;用特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-CdR)作用结肠癌细胞株72h后,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测maspinmRNA表达,四唑盐(MTT)比色、流式细胞仪检测用药前后RKO细胞株生长存活率和细胞周期的变化。结果RKO结肠癌细胞株maspin基因核心启动子区存在CpG岛甲基化。与对照组相比,3组不同浓度5-aza-CdR作用后,maspin基因mRNA表达分别增加了10.89、16.91和23.97倍,明显抑制肿瘤细胞生长,阻滞细胞周期于G0/G1期,诱导细胞凋亡,凋亡率分别为5.17%、8.71%和11.23%。结论RKO结肠癌细胞株maspin基因5'端核心启动子甲基化可能是导致该基因表达沉默的主要原因;特异性甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR能较好地逆转RKO细胞DNA异常甲基化,并有效地激活因高甲基化所致maspin基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡。     

反义人端粒酶逆转录酶基因转染对人胃癌细胞系的影响

目的探讨反义人端粒酶(hTERT)基因治疗的可行性。方法构建hTERT基因的反义表达载体,经脂质体介导转染人未分化胃癌细胞系HGC-27,通过Southernblot检测外源反义基因的整合;RT-PCR及DNA测序法检测反义基因的转录;RT-PCR半定量方法检测被封闭目的基因mRNA的转录水平;TRAP及PCRELISA方法检测细胞的端粒酶活性;流式细胞仪检测细胞周期变化。结果外源反义hTERT基因已整合入细胞并获稳定转录,且能显著封闭目的基因转录的mRNA,并显著抑制HGC-27细胞的端粒酶活性,抑制HGC-27细胞的增殖并促进其凋亡。结论端粒酶反义hTERT基因可有效地应用于胃癌的基因治疗。     

两种端粒酶逆转录酶启动子真核表达载体的构建

目的：构建hTERT启动子和保留HBV同源序列的缺失点变hTERT启动子（pGL3-del445）的真核表达载体，为进一步研究HBV与hTERT启动子的关系奠定实验基础。方法：通过双酶切及PCR方法从pCR-TRTP载体上将全长及含有HBV同源序列的hTERT启动子的基因序列克隆到pPL-basic多克隆位点上，构建真核表达载体pGL-3-TRTP与pGL3B-del445，将该两质粒与pRL-tk共转染不同细胞系，评估其端粒酶启动子活性。结果：经测序证明成功构建了全长及含有HBV同源序列曲hTERT启动子的真核表达载体pGL3-TRTP和pGL3B-del445，共转染实验中，证实在永生细胞系中重组子高效表达，在非永生正常细胞中重组子不表达。结论：构建的两种重组表达载体具有端粒酶启动子活性，在不同端粒酶表型的细胞系中其表达具有选择性。     

靶向hTERT、hTR新型RNAi表达框架的构建及应用效果观察

目的:构建靶向hTERT、hTR的新型RNAi表达框架,探讨单独及联合干扰hTERT、hTR基因对肿瘤细胞端粒酶活性、细胞凋亡及周期的影响,以期找到肿瘤基因治疗的新策略。方法:融合PCR构建靶向hTERT、hTR的RNAi表达框架。各表达框架经鉴定后分别或联合转染A549细胞,TRAP-银染法及TRAP-q PCR法检测端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞凋亡及周期。结果:靶向hTERT、hTR的新型RNAi表达框架构建成功。与空白对照组或阴性对照组比较,无论转染靶向hTERT或靶向hTR的RNAi表达框架后,A549细胞的端粒酶活性均明显降低,细胞凋亡率均明显增加,细胞G1阻滞明显增加,而联合转染靶向hTERT与靶向hTR的RNAi表达框架后,A549细胞的上述改变较各自单独转染更为明显(均P0.05)。结论:靶向hTERT、hTR的新型RNAi表达框架能够有效抑制A549细胞的端粒酶活性,诱导细胞凋亡,改变细胞周期。以人工mi RNA表达框架为基础的新型RNAi技术有望成为肿瘤基因治疗的新工具。     

瞬时转染HBx基因到人正常胆管上皮细胞并观测其对hTERTmRNA的表达影响

目的通过研究HBx基因转染到人正常胆管上皮(HBECs)后对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的转录调节作用，以阐明HBV感染在胆管癌发生中的作用机制。方法瞬时转染HBx基因到体外培养的HBECs，同时转染含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的克隆载体以判定转染率；RT-PCR分析转染后HBECs内hTERT mRNA的表达变化；并通过细胞免疫组化技术了解转染细胞内HBx蛋白的表达。结果经EGFP判定的转染率约为15％；未经转染或转染空载体的HBECs不表达hTERT mRNA，而转染HBx基因的HBECs可表达明显的hTERT mRNA；只有在转染了HBx基因的HBECs可检测到HBx蛋白表达。结论HBx基因转染能激活hTERT mRNA的转录表达，这种顺式调节作用可能是胆管上皮增殖、分化并恶化的主要机制。     

乙型肝炎病毒X基因转染人胆管癌细胞系及对端粒酶逆转录酶mRNA表达的影响

目的了解乙型肝炎病毒X(HBx)基因转染对胆管癌细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达影响,阐明HBx基因调节hTERT基因转录表达在胆管癌发生中的意义。方法体外培养胆管癌细胞QBC939,应用脂质体介导的基因转染技术,将含HBx基因的真核表达载体转染到胆管癌细胞中;转染36h后以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达判定转染成功率,流式细胞仪检测转染率;收集细胞提取总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析转染后细胞内hTERT mRNA的表达变化,并通过细胞免疫化学和Western Blotting了解转染后胆管癌细胞内有无HBx蛋白的表达。结果转染含HBx基因表达载体和空载体的QBC939转染率为29．6％;转染HBx基因后hTERT mRNA表达量比未经转染或转染空载体的hTERT mRNA表达量明显增加;细胞免疫组化和Western Blotting也证实只在转染了HBx基因的胆管癌细胞有HBx蛋白表达。结论HBx基因转染能上调胆管癌细胞hTERT mRNA的转录表达。     

Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响

目的:构建Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl,并检测其对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响.方法:将经同源重组产生的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度.用Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl分别感染人膀胱癌细胞BIU87及人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1,MTT法评估Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl对BIU87细胞生长的抑制作用.结果:当感染复数(MOI)=25时,Ad-Surp-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为74.56%,在SV-HUC-1细胞中转染率为0,差异有统计学意义(χ2=58.64,P<0.05);Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为68.27%,在SV-HUC-1细胞中转染率为72.52%,差异无统计学意义(χ2=0.075,P>0.05).Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率相比,差异无统计学意义(χ2=0.016,P>0.05).与PBS相比,Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl均能明显抑制BIU87细胞的生长,转染后第4天这一差异显著(F=15.96,P<0.05),而Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞生长速度无明显差异.结论:成功构建了含有Survivin启动子驱动LRIG1基因的重组复制腺病毒Ad-Surp-LRIGl并鉴定正确,Ad-Surp-LRIGl能选择性转染人膀胱癌细胞BIU87,在体外能明显抑制膀胱癌细胞BIU87的生长.     

抑癌基因RUNX3在膀胱癌T24细胞株中的表达以及对凋亡的影响

目的 明确RUNX3抑癌基因在正常膀胱组织和膀胱癌T24细胞株的甲基化状态,并将野生型RUNX3基因转染T24细胞,探讨RUNX3基因恢复表达后对膀胱癌细胞凋亡的影响. 方法应用RT-PCR、甲基化特异性PCR和非甲基化PCR检测正常膀胱组织、膀胱癌T24细胞中RUNX3基因的表达以及基因启动子区域CpG岛的甲基化状态.构建真核载体的RUNX3-EGFP-pDest质粒,在LipefectamineTM2000介导下转染膀胱癌T24细胞,转染实验设立3组:空白对照组、空质粒EGFP-pDest转染组以及RUNX3-EGFP-pDest转染组.Western blot检测RUNX3蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡情况. 结果正常膀胱组织RT-PCR可检测出1248bp的RUNX3基因条带,而膀胱癌T24细胞中无法检测出RUNX3基因的表达.正常膀胱组织RUNX3基因甲基化PCR检测阴性,非甲基化PCR阳性;T24细胞反之.正常膀胱粘膜组和RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组Western blot检测,均表达RUNX3蛋白,而膀胱癌T24细胞未表达RUNX3蛋白.流式细胞仪检测,空白对照组的凋亡率为(3.1±0.46)%,而EGFP-pDest转染组和RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组的凋亡率分别为(10.1±1.62)%、(41.20±1.53)%,应用方差分析的LSD法和SNK法进行均数的多重两两比较,RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组与EGFP-pDest转染组、空白对照组凋亡率之间的差异均具有显著性,P<0.01.结论 正常膀胱组织RUNX3基因正常表达,未发生启动子区域CpG岛甲基化,而膀胱癌T24细胞可能因RUNX3基因启动子区域CpG岛发生甲基化,致RUNX3基因无法表达.转染野生型RUNX3抑癌基因后促进了膀胱癌T24细胞的凋亡.