PCR-RFLP技术用于脓肿分枝杆菌群鉴定的初步研究

目的 探讨PCR-RFLP分子鉴定技术对脓肿分枝杆菌群鉴定的应用价值.方法 收集2009-2010年在福建省肺科医院、北京市朝阳区疾病预防控制中心、北京解放军总医院抗酸染色阳性菌株46株.根据2004年分枝杆菌检验手册临床检验常分离菌鉴定程序,用DNA直接测序方法为对照,以hsp65(441 bp)和rpoB(380 bp)基因的特异片段为分子标识,采用PCR-RFLP对脓肿分枝杆菌群临床分离菌株进行菌种鉴定.结果 接种L-J、PNB和TCH培养基,鉴定为结核分枝杆菌30株,非结核分枝杆菌16株.其中10株非结核分枝杆菌的培养特性和主要生化反应同脓肿分枝杆菌( ATCC 19977)结果一致.经hsp65 PCR-RFLP鉴定,9株菌株的指纹图谱为235和200 bp( BstEⅡ)/145、70、60、55、50和40 bp(HaeⅢ),1株菌株的指纹图谱为235和200 bp(BstEⅡ)/200、70、60和50 bp(HaeⅢ).经rpoB PCR-RFLP鉴定,10株临床菌株的指纹图谱是105、95和80 bp(MspⅠ)/130、100 bp和90 bp( HaeⅢ).DNA测序分析,9株分离株与脓肿分枝杆菌群脓肿亚种hsp65和rpoB基因序列匹配度均为100％;1株分离株与脓肿分枝杆菌群马赛分枝杆菌亚种hsp65和rpoB基因序列匹配度均为100％.结论 PCR-RFLP是一种快速、有效鉴定脓肿分枝杆菌的方法,且hsp65 PCR-RFLP的鉴定效果优于rpoB PCR-RFLP.     

多位点PCR技术用于四川267株分枝杆菌临床分离株的鉴定

目的 初步了解四川省肺结核患者分枝杆菌菌种类型。 方法 收集267株分枝杆菌临床菌株,经PNB/TCH鉴别培养基进行培养鉴定后,采用聚合酶链反应(PCR)对16S rRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8和Rv3120 基因位点进行扩增,鉴定至种,再经PRA-rpoB、hsp65基因测序进行验证。 结果 267株分枝杆菌临床分离株多位点PCR结果显示结核分枝杆菌262株,非洲分枝杆菌Ⅰ型3株,非结核分枝杆菌2株。PNB/TCH鉴别培养基培养鉴定结果为结核分枝杆菌复合群266株,非结核分枝杆菌1株。2株非结核分枝杆菌分别为鸟分枝杆菌(M. avium)和脓毒分枝杆菌(M. septicum)。多位点PCR结果与rpoB-PRA、hsp65基因测序结果一致。 结论 多位点PCR技术鉴定分枝杆菌菌种结果准确可靠,且具有简便和快速等优点,有较大的分子流行病学应用价值,且对于临床诊断和治疗都具有重要意义。     

MALDI-TOF MS鉴定分枝杆菌的可靠性及潍坊地区分枝杆菌菌种分布

目的 评估分枝杆菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定与多靶位基因测序结果的一致率，为MALDI-TOF MS鉴定分枝杆菌的临床应用提供理论依据，进一步了解当地的分枝杆菌菌种分布。方法 将潍坊市第二人民医院2016年7月到2017年10月期间经MALDI-TOF MS（生物梅里埃公司）鉴定的751例分枝杆菌菌株进行RNA聚合酶β亚基（rpoB）、热休克蛋白65（hsp65）、16S rRNA 基因的部分序列测序，以3个靶基因联合鉴定的结果作为“金标准”，评估MALDI-TOF MS对分枝杆菌鉴定的准确度，同时分析近5年临床分离的6350株分枝杆菌MALDI-TOF MS鉴定的菌种分布情况。结果 以rpoB、hsp65、16S rRNA测序鉴定结果为参考，MALDI-TOF MS（生物梅里埃公司）对结核分枝杆菌复合群鉴定的准确率为99.66%，对非结核分枝杆菌（non-tuberculosis Mycobacteria，NTM）鉴定的准确率为97.40%。近5年潍坊地区临床分离的分枝杆菌中NTM占15.51%，NTM种类主要为缓慢生长型（90.46%），其中胞内分枝杆菌占比最高（73.20%），其次为堪萨斯分枝杆菌（12.08%）；快生长型分枝杆菌以脓肿分枝杆菌为主（64.90%）。结论 MALDI-TOF MS鉴定分枝杆菌结果可靠，具有重要的临床应用价值；潍坊地区NTM以胞内分枝杆菌为主。     

应用膜芯片技术快速鉴定分枝杆菌菌种

目的：利用膜芯片技术建立一种快速、简便的分枝杆菌分子菌种鉴定方法。方法：以DNA直接测序法为对照，通过PCR．SSCP和膜芯片技术分析11种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和199株分枝杆菌临床分离株的菌种。结果：应用膜芯片技术分析11种分枝杆菌标准菌株和7种非分枝杆菌菌株，特异性100％。199株分枝杆菌临床分离株中，经16S rRNA PCR-SSCP初步菌种鉴定，30株为结核分枝杆菌复合群，应用膜芯片分析，显示与分枝杆菌属探针分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群探针a杂交阳性，两种鉴定方法结果一致：169株PCR．SSCP初步鉴定为非结核分枝杆菌的分离株，经芯片分析，58株为龟分枝杆菌，46株为胞内分枝杆菌，33株为堪萨斯、瘰疬、胃和猿猴分枝杆菌复合群，6株为偶然分枝杆菌，15株为戈登分枝杆菌，3株为乌分枝杆菌，2株为海和溃疡分枝杆菌复合群，另6株只与探针分枝杆菌杂交，经测序显示2株为胞内分枝杆菌，但其基因序列与标准菌株不完全相同，1株为土分枝杆菌，1株为迪氏分枝杆菌，1株为草分枝杆菌，1株为新金色分枝杆菌，芯片上无鉴定该菌种的探针。结论：应用膜芯片技术可简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种，指导临床合理治疗。     

54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列分析

目的分析54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列,为临床分离株的鉴定提供参考。方法用16S rRNA序列分析法对54株分枝杆菌国际参考株进行分析,构建系统发育树,计算相似性百分比。结果除11株（共9种4组）分枝杆菌,即产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌;溃疡分枝杆菌与海分枝杆菌;堪萨斯与胃分枝杆菌;3株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌16S rRNA基因序列完全相同无法相互鉴别,其它41株（共41种）分枝杆菌菌种间16S rRNA均不相同可以得到很好的鉴别。结论 16S rRNA基因序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法,国际参考株16S rRNA基因序列的研究弥补了基因数据库的不足。     

采用gyrB基因扩增快速鉴定结核分枝杆菌复合群的初步研究

目的:初步分析gyrB基因扩增用于结核分枝杆菌复合群(MTC)快速鉴定的可行性.方法:采用特异性引物进行分枝杆菌标准株和临床株的gyrB基因扩增,再通过琼脂糖凝胶电泳观察聚合酶链反应(PCR)结果.结果:15株各种分枝杆菌标准株中,结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌均扩增出1 184bp目的片段,而其余分枝杆菌PCR结果为阴性;94株分枝杆菌临床株中,60株MTB和10株牛分枝杆菌扩增阳性.而其他分枝杆菌(包括6株脓肿分枝杆菌、5株偶发分枝杆菌、4株龟分枝杆菌、3株鸟分枝杆菌、3株胞内分枝杆菌、2株耻垢分枝杆菌、1株堪萨斯分枝杆菌)均扩增阴性.结论:采用针对MTC的特异性引物进行gyrB基因扩增能快速、准确地鉴别MTC和非结核分枝杆菌.     

54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列分析

目的分析54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列,为临床分离株的鉴定提供参考。方法用16S rRNA序列分析法对54株分枝杆菌国际参考株进行分析,构建系统发育树,计算相似性百分比。结果除11株(共9种4组)分枝杆菌,即产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌;溃疡分枝杆菌与海分枝杆菌;堪萨斯与胃分枝杆菌;3株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌16S rRNA基因序列完全相同无法相互鉴别,其它41株(共41种)分枝杆菌菌种间16S rRNA均不相同可以得到很好的鉴别。结论 16S rRNA基因序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法,国际参考株16S rRNA基因序列的研究弥补了基因数据库的不足。     

非结核分枝杆菌菌种ITS-PCR测序鉴定法与表型鉴定法对比观察

目的评价16S～23S rRNA基因转录间隔区聚合酶链反应(ITS-PCR)在非结核分枝杆菌(NTM)菌种鉴定中的临床价值。方法采用ITS-PCR鉴定随机抽取的80株NTM,应用生长特性鉴定试验及鉴定性药物敏感性试验鉴定其表型特征,将3种鉴定方法所示结果进行对比分析。结果 80株NTM中,鸟-胞分枝杆菌复合群(MAC)与脓肿分枝杆菌共占85%,运用ITS-PCR可将脓肿分枝杆菌、堪萨分枝杆菌、偶发分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌准确鉴定,与生长特性鉴定试验及鉴定性药物敏感性试验结果基本符合;MAC采用3种方法鉴定其结果符合率存在偏差。结论 NTM ITS-PCR鉴定法与表型鉴定法相结合更适合临床应用。     

非结核分枝杆菌的药物敏感试验探讨

随着非结核分枝杆菌的不断检出，由非结核分枝杆菌所致的肺病越来越引起临床关注。为了探讨有效的治疗药物，本室对13株非结核分枝杆菌进行了11种药物的药敏试验，以结核分枝杆菌H37RV参照苗株为药敏质控。材料和方法一、参照菌株结核分枝杆菌H37RV，非结核分枝杆菌；堪萨斯、瘰病、偶发、胞内、龟型各1株。二、临床菌株从病人疾标本中分离得到8株非结核分枝杆菌，其中初治病人3株（堪萨斯2株、偶发1株），复治病人5株（偶发和龟型各2株、鸟－胞1株）。三、药物种类除抗结核常用药物INH（异烟肼）、RFP（利福平）、EMB（乙胺丁醇）、…     

变色液体培养基系统快速鉴定结核分枝杆菌和耐药性测定

由于固体培养基鉴定结核分枝杆菌(结核菌)及药敏试验均需28 d,其制作过程需加热,且培养基中蛋白质对药物有吸附作用,故仅用于常规抗结核药敏试验,不适合用于分枝杆菌最低抑菌浓度(MIC)测定.多耐药结核菌和非结核菌对常用抗结核药物耐药,因此急需一种快速测定分枝杆菌药敏的方法,筛选新的药物.尽管Bactec系统可用于分枝杆菌药敏试验和MIC测定[1],但试剂和仪器昂贵.因此,我们采用快速变色液体培养基系统鉴定结核与非结核分枝杆菌,并测定了结核菌常规药物的敏感性和非结核分枝杆菌对9种药物的MIC,结果如下. 一、材料和方法 1.标本来源:128株结核菌,34株非结核分枝杆菌(其中15株龟分枝杆菌脓肿亚种、4株龟分枝杆菌龟亚种、14株偶发分枝杆菌和1株胞内分枝杆菌).上述菌株为深圳地区和广州地区分离株. 2.结核菌快速鉴定及药敏试剂、分枝杆菌MIC测定试剂和菌株鉴定试剂:对硝基苯甲酸(PNB)培养基、5%氯化钠耐受试验、芳香硫酸酯酶(3、14     

自贡市非结核分枝杆菌临床分离株的菌种鉴定结果分析

目的 对自贡市35株疑似非结核分枝杆菌（NTM）临床分离株进行菌种鉴定。方法 从自贡市各区（县）及市结核病防治获得的临床分枝杆菌分离株,通过罗氏培养基（L-J）、对硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧酸肼（TCH）鉴别培养基初步鉴定为NTM,再经多位点PCR方法确定为NTM后,对rpoB、hsp64及its基因进行测序及分析鉴定。结果 35株疑似NTM临床分离株,通过初步鉴别,多位点PCR,rpoB、hsp64及its基因测序及分析鉴别出32株NTM,分别为脓肿分枝杆菌（M. abscessus）11株、胞内分枝杆菌（M. intracellulare）7株、堪萨斯分枝杆菌（M. kansasii）5株、鸟分枝杆菌（M. avium）3株、脓毒分枝杆菌（M. septicum）1株、马赛分枝杆菌（M. masseillense）1株、戈登分枝杆菌（M. gordonae）2株、副瘰疬分枝杆菌（M. parascrofulaceum）1株和Mycobacterium peregrinum 1株。结论 抗酸染色阳性、PNB/TCH鉴定为NTM的临床分离株中包含不同种类的NTM,自贡市NTM肺病的病原种类较多,以快生长脓肿分枝杆菌为主,其次为慢生长不产色菌的胞内分枝杆菌和缓慢生长光产色菌的堪萨斯分枝杆菌。实验室应开展进一步菌种鉴定,以指导临床正确诊断和合理治疗。     

Molecular identification of nontuberculous mycobacteria isolates in a Brazilian mycobacteria reference laboratory

This study utilized the hsp65 polymerase chain reaction restriction analysis (PRA) method in the identification of nontuberculous mycobacteria (NTMs) isolated in a Brazilian mycobacteria laboratory. NTM isolates from clinical specimens collected from 192 patients were characterized using the hsp65 PRA method and analyzed using both 16S rRNA and hsp65 gene sequencing. Only 30% of the NTM strains were correctly identified through PRA, though the suggested inclusion of an additional restriction enzyme could increase the resolution to roughly 90%. A total of 17 NTM strains were not identified to species level and may represent a new taxonomic entity classified as belonging to the Mycobacterium simiae complex. This study demonstrates the applicability of hsp65 PRA in the identification of several NTM strains in a reference laboratory, though the results suggest that some modifications to the original PRA method could increase its resolution substantially.     

海南省肺部感染患者非结核分枝杆菌的菌种鉴定分析

目的 通过对海南省肺部感染患者非结核分枝杆菌（NTM）进行菌种鉴定,探讨海南省NTM肺部感染菌种的类型及人群分布情况。方法 收集2016年7月至2021年6月期间就诊于海南医学院第二附属医院疑似肺结核患者的呼吸道标本进行分枝杆菌培养,对培养阳性标本进行对硝基苯甲酸（PNB）/噻吩-2-羧酸肼（TCH）培养菌型初步鉴定,采用DNA微阵列芯片技术进行分枝杆菌菌种鉴定,无法确定菌种的菌株进一步采用基因测序法鉴定。结果 共收集8 507例疑似肺结核患者的呼吸道标本,剔除重复病例后,有318例经PNB/TCH培养初步鉴定为NTM,315例经DNA微阵列芯片技术和热休克蛋白65(hsp65)基因测序鉴定为NTM。其中308例患者为单一感染模式,6例MTB+NTM和1例2种不同NTM的混合感染模式。快速生长分枝杆菌128株占40.5%,以龟/脓肿分枝杆菌为主（占32.9%）;缓慢生长分枝杆菌188株占59.5%,以胞内分枝杆菌为主（占39.6%）。女性患者多于男性且好发于中老年人,男女性别比为0.79∶1。男女性患者年龄分布差异有统计学意义（Z=2.200,P<0.05）,>40岁的患者...     

2019年北京地区某医院非结核分枝杆菌菌种鉴定结果分析

目的研究该院2019年收治人群检出非结核分枝杆菌(NTM)菌种分布情况,以指导临床诊断。方法收集该院2019年咳出痰、肺泡灌洗液等样本分离出来的NTM,菌种鉴定统一采用16S rRNA和hsp65基因片段测序。同时,收集患者γ-干扰素释放试验(IGRA)结果,对IGRA在不同NTM感染中的水平变化进行分析。结果研究期间检出NTM样本183份,同一患者多次检出同一种NTM按1份统计。患者中男性47.0%(86/183),女性53.0%(97/183);青年组(20~<45岁)19人,中年组(45~<65岁)67人,老年组(≥65岁)97人;菌种鉴定结果显示共检出17种NTM,菌种分布构成比前4位为胞内分枝杆菌54.6%(100/183)、脓肿分枝杆菌12.0%(22/183)、鸟分枝杆菌9.3%(17/183)、堪萨斯分枝杆菌4.4%(8/183)。老年组检出NTM 97人(53.0%),其中男性占43.3%,女性占56.7%。183人中有120人进行IGRA检测,阳性率27.5%(33/120)。快生长分枝杆菌组与慢生长分枝杆菌组的IGRA结果阴、阳性比较,差异无统计学意义(χ2=0.252,P=0.616)。结论NTM所致感染中,以胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌为主要致病菌,尤其好发于年龄大于或等于65岁的老年人,IGRA检测结果对于NTM感染无明确诊断价值。     

Identification of mycobacteria by nonradioisotopic single-strand conformation polymorphism analysis

Clinical isolates of mycobacteria were identified to species levels using nonradioisotopic single-strand conformation polymorphism (non-RI SSCP) analysis of 16s rRNA gene fragments amplified by polymerase chain reaction with primers common to all of mycobacterial species. The method is based on a hypervariable region within the 16s rRNA in mycobacteria, which is characterized by species-specific nucleotide sequences. A total of 92 mycobacterial strains (Mycobacterium tuberculosis, M. avium, M. gordonae, M. intracellulare, M. kansasii, M. chelonae, M. nonchromogenicum, M. xenopi, and unidentified strain) were studied. They were classified into nine types of pattern showing single-strand DNA bands having different mobilities. Each strain was shown in the species-specific mobility by non-RI SSCP analysis. The results of non-RI SSCP analysis were identical to those of standard biochemical methods and 16S rRNA sequencing.     

Different molecular methods for the identification of rarely isolated non-tuberculous mycobacteria and description of new hsp65 restriction fragment length polymorphism patterns

Analysis of heat shock protein 65 (hsp65) gene restriction fragment length polymorphism (RFLP) is done frequently to identify non-tuberculous mycobacteria (NTM) on a genetic basis. Here we report the results of analysing the hsp65 patterns of some rarely isolated NTM for which patterns have not been published before (Mycobacterium bohemicum, Mycobacterium hassiacum, Mycobacterium heckeshornense, Mycobacterium monacense, and Mycobacterium triplex). Furthermore new hsp65-variants for Mycobacterium interjectum (type II), Mycobacterium mucogenicum (type V), Mycobacterium gordonae (type VIII) and Mycobacterium paraffinicum (perhaps synonymous to Mycobacterium scrofulaceum) are described. All species were characterised by hsp65-RFLP, sequencing a 441-bp fragment of the hsp65 gene and sequencing the hypervariable region of the 16S rDNA. Additional data for less frequently isolated mycobacteria are provided and the hitherto described data for the Mycobacterium gordonae complex are summarised. Although the hsp65-RFLP analysis turned out to be a useful method a number of restraints (lack of standardisation, slight variability in fragment length) limits its broader use. Reliable identification of NTM needs, however, more than one molecular method. Identification results obtained by applying different methods yielded conflicting results. Confusion may be caused by older data base entries which are not updated and not longer reflect the actual systematic and taxonomy of the genus Mycobacterium.     

甘肃省53株非结核分枝杆菌对9种常用抗结核药物的敏感性分析

目的 初步了解2012－2014年甘肃省临床分离的非结核分枝杆菌（NTM）对常用抗结核药物的耐药情况。方法 收集临床分枝杆菌分离株,用PNB/TCH生长试验和基于16S rRNA基因的序列分析法鉴定NTM。采用传统固体罗氏培养基绝对浓度法对NTM进行9种常用抗结核药物链霉素（SM）、利福平（RFP）、丙硫异烟胺（TH₁₃₂₁）、异烟肼（INH）、对氨基水杨酸钠（PAS）、左氧氟沙星（LVFX）、乙胺丁醇（EMB）、卡那霉素（KAN）和吡嗪酰胺（PZA）的敏感性测试。结果 共收集到分枝杆菌1 081株,经鉴定53株为NTM,分离率为4.90%。其中胞内分枝杆菌最多,为36株;其次是堪萨斯分枝杆菌,为8株;其他依次是鸟分枝杆菌4株、戈登分枝杆菌2株、脓肿分枝杆菌2株和偶然分枝杆菌1株。药敏结果显示,耐药率从高到低依次为RFP（73.58%）、TH₁₃₂₁（69.81%）、INH（67.92%）、SM（62.26%）、PAS（60.38%）、PZA（47.17%）、EMB（28.30%）、LVFX（26.41%）、KAN（15.09%）,其中耐药株49株,耐药率为92.45%,NTM对9种抗结核药物的耐药程度有差异。结论 NTM对抗结核药物敏感性差,应参照NTM药敏结果选择合理的药物,提高治愈率,减少耐药发生。     

Rapid differentiation between clinically relevant mycobacteria in microscopy positive clinical specimens and mycobacterial isolates by line probe assay

The Inno LiPA Mycobacteria assay, based on PCR amplification of the 16-23S rRNA spacer region of Mycobacterium species, has been designed for identification of mycobacteria grown in culture media and discrimination between Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae, M. xenopi, scrofulaceum and M. chelonae group including M. abscessus. In order to evaluate the system as a fast diagnostic tool, the assay was for the first time used directly on 14 microscopy positive clinical specimens and 71 isolates and the results were compared to those of conventional identification using 16S rDNA analysis and biochemical properties. The assay only misidentified one strain, which was found to be M. avium complex instead of M. intracellulare as found by the conventional tests. The assay allows rapid discrimination of the eight most clinically relevant mycobacteria in microscopy positive clinical specimens and isolates within 6 h in the same procedural run.