血管组织工程中的胚胎干细胞

血管组织工程学是新近兴起的一门学科，其目的是经过胚胎干细胞的体外培养形成血管。其中，种子细胞来源是关键，胚胎干细胞由于不存在异种排斥问题，是理想的选择。现在许多学者进行了由胚胎干细胞向血管内皮细胞的转化研究，取得了初步的进展，这些研究解决了许多理论和实践上的问题，促进了血管组织工程的发展。     

应用脂肪干细胞构建小口径组织工程血管平滑肌层的实验研究

目的 探索利用脂肪干细胞在生物反应器内构建组织工程血管平滑肌层的可行性.方法 用抽吸的脂肪获取脂肪干细胞,在生长因子TGF-β1和BMP4作用下诱导成平滑肌细胞,然后将诱导的平滑肌细胞接种于生物材料PGA上形成细胞-材料复合物,将该复合物置于生物反应器内进行培养,在模拟胚胎发育血流动力学的刺激下(搏动频率75次/min,扩展量<5%)构建小口径的血管平滑肌组织.培养8周后,取材做组织学和生物力学检测并与正常血管对比.结果 脂肪干细胞在TGF-β1和BMP4的诱导下,细胞具有平滑肌细胞特有的"波峰-波谷"样生长特点,并表达平滑肌细胞的特异性标记物:α-SMA、SM22α、calponin、SM-MHC;反应器内培养8周后,构建管样组织胶原分泌旺盛,具有一定的力学强度和弹性.结论 利用脂肪干细胞可在体外生物反应器内构建组织工程化小口径血管,为临床上小血管病变的修复提供了一种新的、有效的途径.     

胚胎干细胞体外诱导分化研究进展

自 198 1年以来 ,英国的Ｅｖａｎｓ等[1] 和美国的Ｍａｒｔｉｎ[2 ] 相继从小鼠囊胚的内细胞团分离建立胚胎干细胞系以来 ,胚胎干细胞体外诱导分化研究就一直是各国学者感兴趣的课题。目前 ,已从胚胎干细胞体外诱导出卵黄囊、血岛、神经细胞、心肌细胞、血管和内皮等结构及细胞。利用胚胎干细胞体外诱导分化的成果可望发展出治疗多种疾病的新方法 ,将在人体早期发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用 ,并成为组织器官移植的新资源。1　ＥＳ细胞的特性胚胎干细胞 (ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＥＳ细…     

利用脱细胞血管基质体外构建小口径组织工程血管

目的 探讨利用犬的间充质干细胞诱导分化种子细胞,以异种脱细胞血管基质为基础体外构建小口径血管移植物.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养的方法从犬骨髓中分离出间充质干细胞并体外培养,诱导分化成内皮样细胞和平滑肌样细胞;采用非离子型去垢剂和胰蛋白酶去除猪颈动脉血管壁结构细胞,对脱细胞基质进行组织学、力学检测及孔隙率评估.在生物反应器内采用旋转种植的方法将犬骨髓间充质干细胞诱导的内皮样细胞种植到脱细胞基质上,体外构建小口径组织工程血管.结果 犬的骨髓间充质干细胞体外能够定向诱导分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞,可以作为血管组织工程的种子细胞.经过脱细胞处理后,光镜和电镜观察证实血管壁的细胞成分完全去除.具有良好的孔径和孔隙率.支架在生物力学、孔隙率等方面符合构建组织工程血管支架的要求.在生物反应器内剪切力条件下可以初步构建出组织工程血管.结论 小口径血管移植物可以将间充质干细胞诱导种子细胞,以异种脱细胞血管支架作为基质,在搏动性生物反应器内培养的方法进行构建.     

利用成体干细胞体外小口径血管的构建

设计了一套血管生物反应器系统,采用有限元的方法对组织工程小血管托架材料进行了分析,从而开发完成了一套用于构建直径为2 mm的小血管托架;通过收集人的原代骨髓基质干细胞（hBMSCs）和脂肪基质干细胞（ADSCs）进行体外扩增和培养,并选用第3代细胞与聚羟基乙酸酯（PGA）复合后置于血管生物反应器中动态培养;在生物反应器中动态培养4周后,对材料复合物进行取材,分别进行大体观察、HE染色和扫描电镜等指标检测。结果表明：血管色泽明亮,有一定的弹性,细胞分泌的胶原基质排列较规则,免疫组化结果表明血管含有平滑肌弹性肌动蛋白的成分。说明改进的血管生物反应器能模拟血管的力学环境,并能利用人骨髓间充质干细胞和脂肪基质干细胞成功构建组织工程小血管组织。     

骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的：探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)和脱细胞天然嚣唾支集体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性。方法：髂嵴穿刺抽取狗骨髓液，Percoll密度梯度离心法获取BMSCs．DMEM培养液体外培养扩增，免疫组化染色及流式细胞术分析鉴定分化细胞表型。采用去污剂和酶消化法制作脱细胞猪主动脉瓣膜支架，将BMSCs分化细胞接种于瓣膜支架上构建TEHV。分别行石蜡包埋切片H-E染色、免疫组化染色、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学结构并鉴定细胞类型。结果：BMSCs分化细胞呈梭形，α-SMA及Vimentin染色阳性，其α-SMA表达与血管壁肌成纤维细胞相近。异种瓣膜支架细胞去除完全，纤维支架结构保留完整。石蜡切片示：BMSCs在脱细胞支架上呈复层生长，α-SMA阳性。扫描电镜示TEHV表面光滑，细胞层完整．透射电镜示其细胞成分为有活性的分泌型细胞．呈梭形，复层生长。结论：BMSCs的自然分化细胞具有肌成纤维细胞的特性，种植于脱细胞瓣膜支架上构建TEHV简便可行。TEHV的在体改建尚需进一步研究。     

人类胚胎干细胞研究及其生物伦理学问题

人类胚胎干细胞研究是20世纪90年代以来生命科学的一大热点，干细胞作为机体内的一种特殊类型的细胞，具有自我复制，自我更新，多向分化的潜能，科学家们预测：随着干细胞研究的不断深入，将为治疗白血病，神经退行性疾病等带来新的希望，然而，人类胚胎干细胞的研究同时引发了世界范围的生物伦理大纷争。     

ES细胞源性表皮干细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤

【目的】以胚胎干细胞（ES细胞）源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤，探讨其对皮肤缺损修复的作用。【方法】胎鼠皮肤成纤维细胞与胶原海绵构建类真皮，植入小鼠全层皮肤缺损创面。以生物膜为载体，把羊膜诱导后带有核标记的ES细胞源性表皮干细胞覆盖在类真皮上，术后1～8周连续取材，HE染色，B1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。【结果】植入后3周，创面完全长合。较厚新生皮完全覆盖创面，基底层细胞增生，形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层，新生表皮中可见核标记的细胞呈B1整合素、CK15、CK19阳性，真皮中的管腔样结构呈核荧光和β1整合素、CEA免疫组化双标阳性，4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性，新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。【结论】ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建的组织工程皮肤可以修复缺损皮肤，在其下真皮层有分化为毛囊样、皮脂腺样和汗腺样的结构，但是是否来源于ES细胞源性表皮干细胞仍需进一步证实。     

胶原蛋白-几丁聚糖三维骨架构建组织工程血管的可行性

目的 研究胶原蛋白——几丁聚糖构建的三维支架在血管组织工程研究中的可行性。方法 以Ⅰ型胶原蛋白和几丁聚糖为生物材料，体外预构具有三维结构的支架，观察支架的空间立体结构；将培养的种子细胞（人平滑肌细胞和纤维细胞）种植于支架，观察材料与细胞的生物相容性和抗收缩性，并测定材料中DNA含量和胶原蛋白含量。结果 应用相分离技术制备的支架，具有均匀的三维结构和丰富的交通孔，种植种子细胞后可以形成良好的细胞黏附和生长，且选用的支架材料可以抵抗细胞收缩引起的材料变形；培养2、4、6周的材料中，DNA含量和胶原蛋白含量随培养时间延长而明显增加。结论构建的胶原蛋白——几丁聚糖三维支架具有结构均匀、细胞生物相容性好的特点，并具有一定的物理强度，可以应用于血管组织工程研究。     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较

目的探讨建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于胚胎干细胞的培养。方法取孕10．5～18．5d的昆明小鼠胚胎，用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，在体外培养体系中，观察细胞在增殖，传代，冻存及复苏等方面的条件；取购买的小鼠胚胎成纤维细胞系制成饲养层，比较两种细胞用于制备饲养层在胚胎干细胞培养方面的优缺点。结果（1）12．5～14．5d的胎鼠最适合于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，所分离的细胞含杂细胞最少，细胞较多，繁也快；（2）在37℃，0．25％胰酶-0．02％EDTA的混合消化液消化时间最好为3～5min，此时消化下的细胞最多，活力最好；（3）原代细胞平均培养4d即可传代，丝裂霉素-C抑制成纤维细胞增殖的合适浓度为10～20μg／mL（4）原代小鼠胚胎成纤维细胞较小鼠胚胎成纤维细胞系更适合于制备饲养层。结论原代小鼠胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞系均可用于制备饲养层。     

小鼠胚胎干细胞植入大鼠脑内存活和增殖

【目的】观察小鼠胚胎干细胞 (ES细胞 )植入大鼠的隔区和海马内后存活和增殖的情况。【方法】以SD大鼠为宿主 ,将BrdU标记的ES细胞植入宿主的隔区和海马内 ,移植后l、2、3、4和 8周后取脑 ,冰冻切片 ,进行尼氏、BrdU、PCNA免疫组织化学染色 ,观察ES细胞存活和增殖的情况。【结果】ES细胞移植入大鼠隔区和海马内后 ,从第l周到第 3周 ,移植物呈团块生长 ,第 4周移植物较第 3周缩小 ,第 8周未发现移植物 ;BrdU和PCNA(核增殖抗原 )免疫染色结果阳性。【结论】小鼠ES细胞移植入大鼠隔区和海马内后 ,可以存活增殖 4周左右     

胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长

目的探讨小鼠胚胎干细胞(mESCs)来源的饲养细胞是否具备支持自体mESCs未分化生长的能力。方法先诱导mESCs形成类胚体(EB),进一步诱导其分化为成纤维细胞(mEB-dFE),以用作饲养细胞。采用形态学、集落形成率、细胞分化率、免疫细胞化学、碱性磷酸酶染色和RT-PCR对生长在mEB-dF上的mESCs的未分化特性进行鉴定。采用RT-PCR和诱导mESCs体内外分化方法鉴定mESCs多分化潜能特性。结果从EB三个发育阶段(EB贴壁10、15、20 d)分离出48个mEB-dF系,其中5个(来自15 d的EB)能维持mESCs未分化生长和多潜能性达10代以上。生长在这种饲养层上的mESCs与生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上一样,其特性无明显差异,均表达碱性磷酸酶和特殊的mESCs标记,包括SSEA-1、OCT-4、NANOG,在体外形成EB和体内形成畸胎瘤;其他43个mEB-dF系则不具有这种能力。结论研究不仅为mESCs体外培养提供了一种新的饲养细胞,避免了MEF作饲养细胞的许多不足;而且还提示mESCs可诱导出不同功能的成纤维样细胞,其差异的分子机制值得进一步研究。     

人类胚胎干细胞研究中的伦理学问题

目的 探讨人类胚胎干细胞研究中的伦理学问题。方法 由人类胚胎干细胞研究所引发的伦理学争论及带来的伦理忧患，导出应注意的医学伦理方面的问题。结果 人类胚胎干细胞研究应遵循一定的伦理原则。结论 医学伦理学应规范和引导人类胚胎干细胞研究。     

小鼠胚胎干细胞培养条件的探索

目的: 探讨小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的培养特点及生物学特性,为ES细胞的应用研究奠定基础.方法: 小鼠胚胎成纤维细胞原代培养,3～5代的细胞作为饲养层细胞培养ES细胞.另在无饲养层细胞、明胶包被培养皿、培养液中含白血病抑制因子条件下培养小鼠ES细胞,观察2种情况下ES细胞的生长情况.结果: 小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,ES细胞在2种条件下均能呈克隆状生长,且保持未分化状态,碱性磷酸酶(AKP)染色呈阳性.结论: 2种条件下ES细胞均能良好生长.     

小鼠胚胎干细胞无饲养层培养及其生物学特性

目的建立小鼠胚胎干（ES）细胞株S8在无饲养层的条件下短期内连续传代体系,获得大量纯的ES细胞。方法ES-S8细胞无饲养层连续传代后,检测其未分化指标以及多分化潜能。结果ES-S8细胞在无饲养层条件下培养5代,AKP染色、SSEA-1免疫荧光、OCT-4均显阳性,以及经拟胚体（EB）途径自发分化后,能形成多种类型的细胞。结论ES-S8细胞能够在无饲养层条件下培养,至少传5代仍能保持未分化特异性指标和多分化潜能。     

人胚胎干细胞源性表皮样干细胞分化潜能

[目的]探讨人胚胎干细胞源性表皮样干细胞的分化潜能,为研究其分化的调控机制及寻找新的人皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将人胚胎干细胞与人羊膜共培养 4 d,定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆,用胰酶消化后移植裸鼠皮下 20 d、 30 d及 50 d.对移植后细胞的分化情况进行了形态学和免疫组织化学观察分析.[结果]人胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠皮下 20～ 30 d后,细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状或泡状结构,它们可分别呈 CEA和 CK18阳性.种植 50 d后,除上述结构外,可见角化复层扁平上皮、毛囊样、汗腺样及皮脂腺样等结构.[结论]研究结果提示人胚胎干细胞源性表皮样干细胞具有分化为角化复层扁平上皮及毛囊样、汗腺样和皮脂腺样等结构的潜能.     

人胚胎干细胞神经分化的方法探讨

【目的】 利用新建系的人胚胎干细胞株SYSU-7,运用胚体形成的方法,探讨不同的分化条件对胚胎干细胞神经分化的影响。【方法】 首先检测人胚胎干细胞株SYSU-7的Oct4、SSEA4(stage-specific embryonic antigen-4)、TRA-1-60和AKP(Alkaline phosphatase)等胚胎干细胞特异性标志物的表达及体内外三胚层分化的能力;之后,应用含20% Knockout Serum Replacement (KSR)的培养液和神经干细胞培养液(neural progenitor medium, NPM)分别诱导细胞形成悬浮的拟胚体(悬浮时间为4 d或7 d),然后将拟胚体贴壁于多聚鸟氨酸(Polyornithine, PO)和纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)包被的培养皿中继续培养4 ~ 10 d。在分化的不同时间点利用免疫荧光染色的方法检测胚胎干细胞和神经细胞相关的标志性抗原。【结果】 SYSU-7胚胎干细胞表达未分化细胞特异性标志Oct4、SSEA4,TRA-1-60,AKP染色呈强阳性,在体内外具有向三胚层分化的潜能;在体外诱导其向神经分化,结果发现KSR培养液比神经干细胞培养液更有利于胚胎干细胞的神经分化,悬浮生长7 d的拟胚体贴壁后出现特征性的玫瑰花环样结构(rosette structure)的时间更早。数量更多。【结论】 SYSU-7细胞系具有自我更新及多向分化潜能等胚胎干细胞特性。本实验为研究人胚胎干细胞的神经分化提供了新的细胞模型和研究思路。     

用密度梯度离心法富集源于小鼠胚胎干细胞的运动神经元样细胞前体（英文）

目的：我们的目标是从源于胚胎体（EBs）的小鼠胚胎干细胞（mESCs）中分离运动神经元样细胞前体（MNLCPs）,以用于发展针对运动神经元疾病的药物筛选试验和移植疗法。天然Shh蛋白（或Shh通路激动剂）和维甲酸诱导的胚胎体中,MNLCPs和未分化细胞的含量是不确定的。如果不把未分化的细胞从细胞培养中充分去除,其可能会干涉药物筛选试验或在移植后增生。我们开发了一种以密度梯度离心法为基础的富集MNLCPs的方法。方法：我们用Wichterle等人2008年改进的方法,将mESCs（HBG3：eGFP：HB9）扩大和分化。通过化学和酶学的无研磨处理,含有绿色荧光蛋白的MNLCPs和未分化细胞的胚胎体被小心轻轻地离解成单细胞。利用OptiprepTM8%~20%逐步梯度离心技术将MNLCPs回收。拥有绿色荧光蛋白的MNLCPs的含量由流式细胞仪检测。结果：我们的结果表明,在胚胎体形成前,mESCs在明胶包被的培养板上生长,其分化为MNLCPs的能力减少。比较mESCs在明胶,明胶与PMEFs,及PMEFs包被的培养板上的生长发现,mESCs在PMEFs包被的培养板上产生含绿色荧光蛋白的MNLCPs的得率为（54.1±11.0）%（x±s;n=12）,在明胶包被的培养板上的得率为（2.8±1.1）%（x±s;n=9）。用密度梯度离心法获得的含绿色荧光蛋白的MNLCPs的平均含量为（87.7±5.5）%（x±s;n=3）。结论：我们的数据表明,不使用细胞分选器,无研磨解离和密度梯度离心法也能用于富集具有高存活率的MNLCPs。有必要对MNLCPs在体外、体内和表型上进行进一步的生理学意义（如神经轴突的生长及形成神经肌肉接头的能力）上的鉴定。     

蛋白激酶C亚型在小鼠胚胎干细胞中的表达研究

[目的]研究5种蛋白激酶C(PKC)亚型PKC_α、PKC_β、PKC_γ、PKC_δ和PKC_ε在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)株ES-BALB/c的表达情况。[方法]ES-BALB/c细胞株用普通ES细胞培养液培养,分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿,培养2d和4d后分别进行PKC亚型免疫组织化学和Western印迹检测。[结果]免疫组化发现PKC_α在ES-BALB/c细胞有广泛的棕黄色的阳性表达,以细胞浆和细胞核最甚,而PKC_β、PKC_γ、PKC_δ和PKC_ε4种亚型无明显表达;Western印迹发现PKC_α出现一条蛋白印迹条带,分子质量约为84ku,而PKC_β、PKC_γ、PKC_δ和PKC_ε4种亚型无蛋白印迹条带。[结论]PKC_α在ES细胞阶段即有表达,在将来的细胞分化阶段可能有非常重要的作用,而PKC_β、PKC_γ、PKC_δ和PKC_ε4种亚型在ES细胞阶段没有表达。