食管癌消减cDNA文库的构建

目的：采用消减抑制杂交技术,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况,分离食管癌相关基因片段,构建食管癌的消减cDNA文库。方法：以食管癌组织为测试子（tester),以正常食管粘膜组织为驱赶子（driver),用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建食管消减cDNA文库。结果：用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段,经蓝白斑筛选,得到220个白色克隆;再用PCR方法快速筛选出100个两分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R 的阳性重组质粒100个,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论：构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆,对于消减文库的构建具有重要意义。     

cDNA文库的构建策略

cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用．近年来，随着分子生物学技术的发展，cDNA文库构建方法有了很大改进和提高．就cDNA文库构建的方法作一综述，     

IgA肾病肾阴虚证cDNA文库的构建

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建汉族人IgA肾病肾阴虚证cDNA消减文库。方法选择IgA肾病且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交。采用TrizolBD法提取总RNA,用SMART技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaⅠ酶切基因组cDNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,然后将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建IgA肾病肾阴虚证消减文库。结果用SSH方法筛选出了IgA肾病肾阴虚证的差异cDNA片段,其中正向消减文库共获得325个阳性克隆,反向消减文库获得306个阳性克隆,从而成功地构建了IgA肾病肾阴虚证的cDNA消减文库。结论SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段,成功构建了IgA肾病肾阴虚证的cDNA文库,为进一步克隆肾阴虚证的相关基因奠定了基础。     

应用抑制消减杂交技术构建肝癌差异表达基因消减cDNA文库

目的 构建肝癌及癌旁肝细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交方法,以肝癌组织及癌旁肝组织作为对比材料,分离肝癌组织中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩半后,随机挑取100个白色克隆及菌落PCR进行鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,95％的克隆中均有100－600bp的插入片段,这些片段可能是肝癌差异表达基因的cDNA片段。结论 用SSH法及T／A克隆技术成功构建了肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选,克隆肝癌差异表达的新基因奠定了基础。     

重症肌无力患者胸腺组织抑制性消减cDNA文库的构建及分析

目的:构建重症肌无力(MG)患者胸腺组织抑制性消减cDNA文库,分析MG胸腺差异表达基因。方法:分别从6例正常和6例MG患者胸腺组织中分离出mRNA,逆转录合成cDNA,行抑制性消减杂交,将得到的差异表达基因进行T-A克隆,构建cDNA文库,并进行序列分析。应用实时荧光定量PCR检测20例MG患者、10例正常对照胸腺组织中GSTM3和KPNA5 mRNA的表达。结果:共获得125个阳性克隆;Blast同源性检索共得到27个差异表达基因;MG患者GSTM3、KPNA5基因表达量(0.671±0.097和0.712±0.080)高于正常对照胸腺(0.582±0.047和0.571±0.018),差异有统计学意义(tGSTM3=5.458,P<0.001;tKPNA5=2.755,P=0.010),与消减文库结果一致。结论:成功建立了MG胸腺组织抑制性消减cDNA文库。     

构建特发性脊柱侧弯椎间盘终板抑制消减cDNA文库的方法和意义

目的：构建青少年特发性脊柱侧弯椎间盘终板抑制消减cDNA文库，以研究特发性脊柱侧弯的基因表达变化间的内在联系及规律。方法：从来源于一位特发性脊柱侧弯患者顶椎椎间盘终板凸凹侧软骨组织分离poly(A)^ RNA，经反转录后，利用抑制消减杂交(SSH)方法，通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果：挑取300个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段，结果显示其中248个克隆有插入片段，片段大小范围为250-750pb。结论：应用消减杂交的方法，再经适当的改进，在去除相同遗传背景的条件下，可以建立较特异性脊柱侧弯椎间盘终板cDNA消减文库，该文库为进一步批量筛选特发性脊柱侧弯发生的相关基因群并克隆特发性脊柱侧弯相关表达基因，研究其特发性脊柱侧弯发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础。     

传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的:构建传代培养前后牛主动脉内皮细胞差异表达基因的消减cDNA文库,筛选动脉粥样硬化相关新基因构建文库. 方法:采用抑制消减杂交技术,以新鲜分离和传代培养的牛主动脉内皮细胞作为对比材料,分离传代培养主动脉内皮细胞中不表达或低表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取64个白色克隆进行酶切鉴定. 结果:扩增消减cDNA文库获得760个克隆,随机挑取的64个阳性克隆经酶切后均有200～600 bp的插入片段. 结论:构建的传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选早期发生改变的动脉粥样硬化相关基因奠定了工作基础.     

食管癌相关基因片段的筛选与鉴定

目的：从已构建的中国人食管癌特异的消减cDNA文库中，初步筛选与鉴定食管癌相关基因片段。方法：随机挑选48个片段作反Northern印迹杂交分析，将杂交信号有差别 的15个片段送测序公司进行测序，用GenBank Blast程序检索，以同源性很小的cDNA片段作为新基因的候选基因，观察其在食管癌组织和正常食管粘膜组织中的表达情况。结果：所获得 的7个序列中：3y59与已知基因同源性很小，且3y59在30例食管癌及其配对正常食管粘膜组织中，19例（63．3％）表达有差别，11例（36．7％）表达无差别（P＜0．05）。3y88与已知基因geminin基因部分同源。另外5个片段3y20,3y14,3y90,3y91和3y92分别与核糖体蛋白RpL7a,TLH29蛋白驱动子，Hsp70/Hsp90-organizing protein,Keratin6(KRT6C) 和内膜蛋白等已知基因序列高度同源。结论：3y59可能是与食管癌的发生、发展有关的新的候选基因。首次发现，geminin基因，核糖体蛋白Rp17a,TLH29蛋白驱动子，Hsp70/Hsp90-organizing protein,Keratin6(KRT6C),内膜蛋白等已知基因可能与食管癌的发生发展有关。     

猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的:构建猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库.方法:15只成年家猫随机分为正常对照组、视神经压迫4周组和视神经压迫8周组(n=5),压迫4周组和压迫8周组猫利用球囊植入法建立慢性视神经损伤模型.取各组动物视神经,TRIzol法提取总RNA,SMART技术合成cDNA,随后利用抑制消减杂交方法分离受压4周和8周视神经中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取300个白色克隆进行菌落PCR鉴定.结果:菌落PCR扩增显示每个文库80%的克隆中均有200～800 bp的插入片段.结论:成功构建猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆慢性视神经损伤相关差异表达基因奠定了基础.     

牦牛肾脏cDNA文库的构建

目的 :构建牦牛肾脏的cDNA文库 ,为进一步筛选、克隆和表达有益基因做准备。方法 :从牦牛肾脏中提取总mRNA ,经逆转录合成cDNA后 ,以pSPORT1质粒为载体构建cDNA文库。结果 :牦牛肾脏cDNA文库库容量为1×106转化子/μgcDNA ,经E.coliDH5α菌株平板测定 ,重组率为93 %。结论 :经平板鉴定和PCR鉴定表明 ,所构建cDNA文库达到建库要求 ,能够用于目的基因筛选和克隆表达     

慢性间歇缺氧兔模型肝组织cDNA文库构建

目的:构建抑制性差减cDNA文库筛选鉴定慢性间歇性缺氧兔模型肝脏相关基因.方法:选取24只兔随机分成4组,分别为普通饲料喂饲组,高脂饲料喂饲组,间歇性缺氧组和高脂并间歇性缺氧组.提取高脂组和高脂并间歇性缺氧组兔肝脏组织mRNA,酶切cDNA,分别与不同的接头连接,经过两轮差减杂交和两次抑制性PCR后得到两者之间差异表达的cDNA.将PCR产物与T/A载体连接构建差减cDNA文库.挑选克隆进行PCR扩增鉴定.结果:基于高脂组和高脂并间歇性缺氧组兔腹主动脉和肝病理改变的基础,构建的差减cDNA文库包含500个克隆,其中462个有插入片段,大小为250～700 bp.鉴定获得1个新基因Cthrc1,GenBank登录号XM_418373.结论:对Cthrc1基因的研究有助于进一步阐明慢性间歇性缺氧促进动脉粥样硬化形成的分子机制.     

抑制性消减杂交构建乙型肝炎病毒X蛋白羧基端缺失40个氨基酸cDNA文库

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白羧基端缺失40个氨基酸(HBx3'-40)反式激活基因,克隆其反式激活的相关靶基因.方法:以HBx3'-40蛋白表达质粒pcDNA3(-)-HBx3'-40 转染Huh-7细胞,以转染pcDNA3(-)-HBx为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取总RNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与pUCm-T载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌JM109进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建了HBx3'-40反式激活基因差异表达的cDNA文库,文库扩增后得到154个白色克隆,经菌落PCR分析,克隆包含有200～800 bp的插入片段,部分片段编码蛋白涉及原癌基因、信号转导相关基因、细胞生长因子相关基因、细胞凋亡、代谢和蛋白合成等相关基因.结论:应用抑制性消减杂交技术成功构建了HBx和HBx3'-40差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HBx3'-40在HBV感染相关的肝细胞癌发生中的分子生物学机制提供理论依据.     

化脓性链球菌高毒力株特异基因文库的构建和分析

目的构建化脓性链球菌高毒力株特异基因文库,克隆和筛选化脓性链球菌高毒力株特异表达基因。方法采用抑制消减杂交技术(SSH),以从患者体内所分离链球菌为毒力菌株,分离特异表达基因,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10进行文库扩增后,转化菌液涂布于LB固体平板,构建化脓性链球菌毒力株特异基因消减文库,用斑点杂交初步筛选消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析。结果酶切产物为100～2 000bp,连接效率大于50%,消减组与非消减组差异明显,成功构建了化脓性链球菌毒力株特异基因消减文库,所得阳性克隆经斑点杂交筛选后测序,与Genebank数据库进行同源性比对,5个未知序列可能为新基因,7个与已知基因有高度的同源性。结论用SSH及T/A克隆技术成功构建了人源化脓性链球菌高毒力株基因文库,5个未知的新序列有待于进一步的研究。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法采用新近建立的抑制消减杂交方法,哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料,分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取100个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,90％的克隆中均有200～600bp的插入片段,这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

抑制性消减杂交技术在研究热适应机制中的应用

目的探索热适应动物体内在常温静息状态下是否存在与热适应相关的基因差异表达,评估从基因差异表达角度研究热适应机理的可行性。方法在大鼠肝组织标本上提取mRNA,反转录成双链cDNA,应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)比较热适应组与常温对照组基因的差异,构建差异表达基因消减文库。采用PCR-Select Differential Screening技术鉴定是否存在差异表达的基因。结果初期实验证实6个cDNA片段为差异表达。结论热适应大鼠在常温静息状态下肝脏组织中存在热适应相关基因的差异表达,推测可能与大鼠保持热适应能力有关。提示通过分离热适应相关的差异表达基因研究热适应机制是一种可行的思路。     

高脂血症敏感兔肝组织差减cDNA文库的构建

目的：构建高脂血症敏感兔肝组织表达基因的抑制差减cDNA文库。方法：分别从兔高脂血症敏感组和非敏感组肝组织分离mRNA，合成双链cDNA，酶切后将敏感组cDNA分成两组，分别与不同的接头连接，再通过再轮差杂交和两次抑制PCR得到两者之间差异表达的cDNA，将PCR产物与T／A载体连接构建差减cDNA文库，挑取克隆进行PCR扩增鉴定，结果：建的差减cDNA文库包含500个克隆，其中463个有插入片段，大小范围在250－700bp之间。结论：用抑制性差减杂交及T／A克隆技术成功构建了高脂血症敏感免疫差异表达基因差减cDNA文库。     

PCR在消减文库构建中的应用

目的 :消减文库构建过程中 ,用PCR技术快速筛选重组阳性克隆。方法 :将白色单菌落加入氨苄抗性LB培养液中 ,37℃摇振培养过夜 ,取细菌悬液作PCR模板。结果和结论 :以PCR方法筛查重组阳性克隆 ,可以简便快速鉴定重组阳性克隆 ,不需提取质粒。筛选重组阳性克隆可直接用细菌悬液作PCR模板 ,在消减文库构建时 ,能大大提高工作效率。     

用抑制性消减杂交方法筛选人肾癌相关基因

目的 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌差异表达基因文库并进行差异表达基因筛选.方法 以肾癌细胞株RLC-310和肾近曲小管细胞株HK-2互为实验组和对照组,提取mRNA,应用抑制性消减杂交技术进行正反两向消减杂交,获得人肾癌细胞差异表达基因文库,结合反向Northern斑点印迹杂交,筛选差异基因克隆,并进行测序分析.结果 正向和反向文库共包含1200多个阳性克隆,经斑点杂交筛选后,对213个差异克隆进行测序并经BLAST分析,得到144个差异表达基因,与肾癌相关的高表达基因67个,低表达基因77个,其中新EST 14个,未知功能基因21个;对测序基因进行聚类分析发现与细胞生长、黏附、凋亡等肿瘤细胞生物学行为相关.结论 该文库质量可靠,所筛选出的差异基因和新的基因为进一步筛选肾癌特异性相关基因,绘制肾癌差异基因表达谱,最终阐明肾癌发生、发展、转移机制提供了实验材料和研究靶点.     

抑制消减杂交技术分析牙龈卟啉单胞菌基因差异初探

目的:对比牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)低毒力株标准参考菌ATCC 33277与高毒力株W83之间的差异核苷酸序列,查找高毒力株W83缺失基因。方法:抑制消减杂交技术对比牙龈卟啉单胞菌低毒力株标准参考菌ATCC 33277与高毒力株W83的基因差异。以低毒力株ATCC 33277为tester,高毒力株W83株为driver,将提取的基因组DNA用内切酶RsaⅠ酶切,连接特殊设计的adaptor进行两次消减杂交和PCR扩增,并与TA克隆载体连接,转化到JM109中,建立差异消减文库,经PCR筛选鉴定阳性克隆,进而对部分片段进行测序和同源分析。结果:经SSH筛选鉴定得到62个片段大小为125～632bp的阳性克隆基因片段。结论:这些差异基因为研究牙周病的发生和发展提供重要线索。