共查询到20条相似文献,搜索用时 156 毫秒
1.
为构建血浆前白蛋白的真核表达载体,采用逆转录PCR(RT-PCR)从水囊引产的胎儿肝组织中得到PAcDNA。将该序列克隆到pGEM-T Easy载体中,再转入真核表达载体pCDNA3.1(+)。限制性内切酶消化筛选正向插入重组体。重组体经过序列分析证实,pCDNA3-PA中正向插入PA全长cDNA。 相似文献
2.
目的: 为了进行中国人视黄醇结合蛋白(hum an retinol-binding pro-tein, hRBP)的原核表达,克隆出hRBP的cDNA。 方法: 利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法获得hRBP的cDNA,克隆入pGEM-T载体后,在美国ABIDNA 自动测序仪上以双脱氧法进行核苷酸序列测定。结果: 扩增出了约0.58kb的特异片段,并筛选出阳性重组克隆质粒pGEM-RBP,核苷酸序列测定表明其含有一段580 个碱基的插入片段,与文献报道的一致。结论: 我们已获得了中国人RBP的cDNA,可用于进行原核表达。 相似文献
3.
乙型肝炎病毒X基因在大肠杆菌中亚克隆与鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
用HpaⅠ和Bg1Ⅱ双酶切32kbHBVDNA,得到近11kb大小的完整HBx基因,利用绿豆芽核酸酶将HBx基因、载体pBR322的BamHⅠ酶切粘性末端切成平末端,在T4DNA连接酶作用下进行体外重组后转化到大肠杆菌中,获得亚克隆E.coliJM109pBR322HBx,并经药物平板筛选、电泳分析和DIG标记的探针做Southern印迹杂交实验证实。E.coliJM109pBR322HBx亚克隆的建立对进一步研究HBx基因的功能、肝癌发生的机理以及乙型肝炎病毒感染的诊断等均有重要意义 相似文献
4.
5.
用聚合酶链式反应(PCR)技术,从B型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了930bp的β-毒素基因。用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI对PCR产物进行双酶切处理,然后,通过T4DNA连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的载体质粒pET-28C(+)的多克隆位点,转化至受体菌BL21(DE3)中。经BamHI和EcoRI双酶切分析和PCR扩增检测。证明重组质粒pECB2中含有产气荚膜梭菌的β-毒素基因。经核苷酸序列分析,明确了克隆的β-毒素基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的。利用已构建的另一重组质粒pXST1(带有肠毒素性大肠杆菌的耐热性肠毒素ST基因),通过EcoRI和SalI双酶切处理,将切下的ST基因片段定向连接到pECB2重组质粒中CPB基因的下游。经特定酶切分析鉴定,得到了理想重组子质粒pECBST1,CPB-ST融合基因在重组质粒pECT-ST1中的连接向位是正确的 相似文献
6.
有机氯农药多残留GC-MS分析方法研究 总被引:18,自引:3,他引:15
应用Maslab的定量软件,以选择离子扫描方式,建立了有机氯农药多残留的GC-MS定量测定方法。经方法的线性试验、精密度试验、检测限试验,验证了有机氯农药多残留GC-MS分析方法的可行性。PCNB和pp'-DDT在0.0025~0.50ng,α-HCH、β-HCH、γ-HCH、δ-HCH、op'-DDT、pp'-DDD、pp'-DDE、HCB在0.0020~0.40ng范围内呈现良好的线性关系;方法的最低检出量:PCNB和pp'-DDT为0.0025ng,α-HCH、β-HCH、γ-HCH、δ-HCH、op'-DDT、pp'-DDD、pp'-DDE、HCB为0.0020ng.精密度试验的变异系数满足了农药多残留痕量分析的要 相似文献
7.
目的了解HBV感染孕妇血清HBVM与TORCH抗体阳性率。方法应用ELISA法筛查出93例HBV感染孕妇,并用PCR检测HBV-DNA。分娩时取脐血测弓形体(Tox)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)四种病原血清特异性IgM和风疹病毒IgG抗体。结果93例HBV感染孕妇中TORCH总感染率47.31%。单项抗体阳性率25.81%,7例为2项抗体阳性,2例3项抗体阳性。原发宫内感染以Tox最高(12.90%),CMV次之(6.45%),随后HSV-Ⅱ(5.38%),RV最低(3.23%)。孕妇HBsAg阳性组,PCRHBV-DNA阳性率76.92%,TORCH感染率61.54%。HBsAg阴性组,PCRHBV-DNA阳性率38.89%,TORCH感染率37.04%。结论脐血TORCH感染率与母血HBsAg、HBeAg、HBV-DNA相关(相关系数分别为0.14、0.29、0.15)。乙肝感染孕妇TORCH的抗体筛查对优生优育是非常有用的指标。 相似文献
8.
戊型肝炎病毒PCR产物直接测定序法的建立及应用 总被引:2,自引:0,他引:2
以γ-^32P-ATP标记的PCR引物为测序引物,Taq DNA聚合酶为测序酶,PCR产物为测序模板,建立了戊型肝炎病毒cDNA序列分析方法。应用本法测定1株新疆流行性HCV和株散发性HEV cDNA序列,呈清晰的序列梯,其序列与用荧光法测定的另一株散发性HEV序列有高度同源性,以上结果说明,PCR产物直接测序法可用于HEV核酸序列分析。 相似文献
9.
10.
为检测用EB病毒转化建立的永生性人B淋巴细胞株中N^5,N^10-亚甲基甲氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的表达及其cDNA序列,用EB病毒转化人外周血B淋巴细胞,建立永生性细胞株后,从培养细胞中提取总RNA,用RT-PCR法扩增MTHFR基因cDNA的不同片段,进行PAGE电泳分析和cDNA序列测定。结果显示永生性人B淋巴母细胞中有MTHFR基因表达,其cDNA序列与文献报道的人肝脏MTAHFR基 相似文献
11.
TTV DNA实时荧光定量PCR参照品的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
目的构建适用于TTV DNA实时荧光定量PCR(FQ—PCR)的参照品。方法采用经典的A-T克隆法,将TTV基因序列非转录区(ORF2)中的一段保守序列经PCR扩增后将特异性产物片段连接于PUCm-T载体,形成重组质粒。并对所制备的质粒参照品在普通冷冻条件下的稳定性等指标进行分析;并通过测序验证重组序列的特异性。结果所制备的质粒标准品敏感度高,所采用的扩增子与各TTV亚型同源性在96%—100%;且在普通实验室条件下的稳定好,-20℃保存在20天内无显著变化;线性范围宽,当稀释度在10~109copies/ml之间时相关系数r=-0.97。结论该重组质粒参照品适用于TTV DNA实时荧光定量PCR分析。 相似文献
12.
目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3.1-mye/PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA,该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3.1-myc—his(-)B上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标:(1)PINK1基因cDNA扩增产物检测。(2)pcDNA3.1-myc/PINK1重组体酶切鉴定。(3)Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3.1-myc/CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。 相似文献
13.
用DNA microarray快速检测淋球菌耐喹诺酮类药物基因突变 总被引:1,自引:0,他引:1
研究DNA microarray的制备及其检测淋球菌耐喹诺酮类药物基因突变的准确性。方法根据淋球菌药敏及测序结果分别对淋球菌gyrA和parC基因的序列设计特异引物和探针并制作DNA microarray。对淋球菌临床拭子进行PcR扩增并荧光标记包含gyrA和parC基因的目的DNA片段,与芯片杂交,同时以测序法进行双盲淋球菌耐喹诺酮类药物基因突变的检测。结果87份泌尿生殖道试子全部可用DNA microarray检测出来,芯片检测结果与药敏结果符合率为100%,与测序结果符合率为97.7%。结论用DNA microarray来检测淋球菌gyrA和parC基因突变快速、特异性高和灵敏度高,可以应用于临床耐药性检测。 相似文献
14.
目的:构建淋病奈瑟菌孔蛋白PIA(Porin IA)基因的真核表达系统,为淋病DNA疫苗的研究提供材料。方法:PCR技术扩增淋病奈瑟菌捷克标准株的PIA基因片段,将其定向插入真核表达载体pC I-neo多克隆位点中,构建重组表达载体。并用酶切分析、PCR扩增及序列测定方法,对重组载体进行鉴定。结果:淋病奈瑟菌PIA基因被正确克隆到真核表达载体pC I-neo中,测序结果与Genebank中AF090819等菌株序列有99.99%同源性。结论:真核表达系统(pC I-PIA)构建成功。 相似文献
15.
16.
目的:从感染人乳头瘤病毒(HPV)的新鲜宫颈癌组织中扩增HPV16型晚期蛋白L1基因全长,构建原核表达载体,表达并纯化蛋白用于ELISA检测。方法:根据基因序列设计一对特异引物,用PCR的方法从宫颈癌组织DNA中获得L1基因,以pet28a为载体构建表达质粒,IPTG诱导表达蛋白,DEAE及葡聚糖凝胶分离纯化目的蛋白,将蛋白包被平底96孔板用于ELISA检测。结果:从宫颈癌临床标本克隆到HPV16型L1蛋白编码序列,其原核表达产物纯化后可用于ELISA检测。结论:成功获得人有抗原性的HPV16 L1蛋白,可用于ELISA检测。 相似文献
17.
目的 获取淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因(porB)并构建其重组表达质粒。方法 根据porB已知序列,设计合成一对引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出porB基因片段,克隆到原核表达质粒pQE30中,转化大肠埃希菌M15感受态细胞,经酶切和PCR鉴定,然后进行测序。结果 porB基因体外扩增产物大小约为911bp。重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明为正确重组子,测序结果与已知序列基本吻合。结论 成功克隆了淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因,为下一步PorB蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌蛋白质疫苗的研制提供了基本的物质基础: 相似文献
18.
目的构建pcDNA3.1( )淋病奈瑟菌外膜蛋白—奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface Protein A,NspA)基因真核表达载体,为研制淋病奈瑟菌核酸疫苗奠定基础。方法根据淋病奈瑟菌NspA基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出NspA基因片段,将扩增的产物连接于测序载体pUCm-T上,并构建重组体pcDNA3.1( )/NspA,进行酶切、PCR及测序鉴定。结果NspA基因体外扩增产物大小约为525 bp。所构建的pcDNA3.1( )/NspA重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片断的大小相符;测序结果与GenBank中收录的NspA全长序列一致,表明pcDNA3.1( )/NspA真核表达载体构建正确。结论成功地构建了淋病奈瑟菌真核重组表达载体pcD-NA3.1( )/NspA,为NspA蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌核酸疫苗的研制提供了物质基础。 相似文献
19.
目的构建miR-145的真核表达载体,为研究miR-145在结肠癌中的生物学功能奠定基础。方法设计并应用PCR扩增miR-145基因片段,将其导入真核表达载体pCMV-myc中构建重组质粒pCMV-miR-145后,将重组质粒转染入结肠癌细胞系HCT116中,运用RT-PCR检测miR-145的表达情况。结果酶切及DNA测序证实miR-145被正确克隆入真核表达载体pCMV-myc中,该重组质粒能在HCT-116细胞中高效表达miR-145。结论成功构建了miR-145的真核表达载体pCMV-miR-145,该载体能有效高表达miR-145。 相似文献
20.
A quantitative polymerase chain reaction method for the detection in avian faeces of salmonellas carrying the spvR gene. 总被引:1,自引:0,他引:1
A quick, semi-quantitative method of detecting Salmonella species which contain the virulence plasmid has been developed using the polymerase chain reaction (PCR). A pair of primers have been synthesized encompassing a 500 bp fragment of the spvR virulence gene. Competitor DNA consisting of the spvR gene with a 94 bp deletion situated between the primer recognition sequences, was cloned into a plasmid vector. Co-amplification of the ''unknown'' target salmonella DNA with known quantities of competitor DNA in the same reaction tube gave PCR products of 500 and 406 bp respectively. Visual assessment of the ratio of the two products on ethidium bromide stained agarose gels provided an estimate of the approximate number of salmonella cells present in avian faeces. The technique could be applied to detect quantifiably any non-host DNA in clinical samples if a suitable DNA sequence for primer construction is available. 相似文献