胚胎干细胞的研究进展

一、研究现状胚胎干细胞 (ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＥＳ)是从早期胚胎中发现、能在体外培养的一种高度未分化细胞 ,它具有发育成各种细胞的潜能。主要来源于两种组织 :早期胚胎细胞团分离的ＥＳ细胞和胚胎生殖嵴分离的胚胎生殖细胞 (ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｇｅｒｍｃｅｌｌ,ＥＧ) ,两者的形态、标志、体内分化潜能及种系传递功能都相似[1] 。ＥＳ细胞的研究以小鼠拉开序幕 ,扩展至其它动物 ,最终进入人类ＥＳ细胞研究的主题。 1981年Ｅｖａｎｓ等首次在延缓着床的小鼠胚胎中发现了ＥＳ细胞[2 ] ,Ｍａｒｔｉｎ[3] 、Ａｘ ｅｌｅｒｏ…     

不同条件下培养小鼠胚胎干细胞

胚胎干细胞 (ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＥＳ细胞 )是从早期胚胎中分离出来的全能细胞系[1,2 ] 。当将这种细胞注入受体胚胎时 ,能参加各种组织器官的发育 ,形成嵌合体而后杂交至纯合体。通过ＥＳ细胞进行基因打靶[3 ] ,将外源基因定点整合产生基因剔除或基因修复从而制备转基因动物模型 ,故ＥＳ细胞可以用于研究基因的结构、功能及调控、医学疾病模型建立以及生殖细胞基因治疗等研究。利用ＥＳ细胞可以研究哺乳动物的分化和发育等基本问题 ,还可以通过研究ＥＳ细胞在体外定向诱导为特殊组织类型细胞为将来临床提供器官组织的原材…     

无血清培养条件下诱导胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向分化的实验研究

目的 寻求无血清、无饲养层细胞存在的情况下，胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向诱导分化的最佳条件。方法 采用阶段诱导的方法，在不同阶段加入不同的生长因子，对新近分离的胚胎干细胞进行分化培养。首先向无血清培养液中分别加入bFGF和LIF，实现由胚胎干细胞向神经前体细胞的定向分化，通过巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定；在此基础上，撤除bFGF和LIF，加入B27无血清培养基、IL-1后继续培养，实现由神经前体细胞向多巴胺能神经元的定向诱导分化；通过酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色对多巴胺能神经元进行鉴定。结果 有85％的细胞团呈nestin免疫阳性着色，多巴胺能神经元的分化比率为13％，较多巴胺能神经元的自然分化比率(4％)有明显提高。结论 在无血清、无饲养细胞的情况下，我们采用阶段诱导的方法，在不同的阶段加入不同的生长因子，可有效诱导多巴胺能神经元的分化，使胚胎干细胞的诱导分化过程更易于操作。     

人胚胎干细胞研究及其应用

1998年 11月ＳＣＩＥＮＣＥ和ＰＮＡＳ杂志上分别报道了两个实验室以不同手段几乎同时成功地建立起人胚胎干细胞系(ＥＳ) [1,2 ] ,引起科学界的强烈反响。胚胎干细胞研究成了科学界最热门的话题之一。 1999年底ＳＣＥＮＣＥ将此项研究列为当年十大科学进展榜首 ,认为ＥＳ细胞研究和人类基因组计划同样将成为新世纪最具发展和应用前景的领域。本文主要探讨人胚胎于细胞研究的历史、生物学特征及其应用前景。1.人ＥＳ细胞系的建立1884年Ａｎｄｒｅｗｓ和Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等[3 ,4 ] 报道了从人畸胎瘤分离繁殖的细胞系可在体外分化为神经元和其…     

从胚胎干细胞诱导发育为浆细胞的体外实验研究

目的：建立胚胎干细胞体外定向诱导分化为浆细胞的体系,为研究造血发生的基因调控及Ｂ淋巴细胞发育过程奠定基础。方法：分阶段培养,第一、二阶段使用半固体培养,分组加入细胞因子、２－巯基乙醇和胚胎细胞条件培养液,用流式细胞仪、免疫组化及Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ染色鉴定细胞,第三阶段移入骨髓基质细胞滋养层。结果：第一阶段：加入ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、Ｅｐｏ和Ｇ－ＣＳＦ,４ｄ后细胞大片坏死,仅加入２－巯基     

Desert Hedgehog诱导大鼠胚胎中脑神经前体细胞定向分化为多巴胺能神经元

目的 研究Desert Hedgehog(DHH)对胚胎中脑神经前体细胞(NPCs)向多巴胺能神经元分化的诱导作用。方法 大鼠DHH病毒上清感染COS7、NIH/3T3和9L细胞, 用免疫荧光、实时定量PCR和Western blot方法检测DHH表达。分离培养大鼠胚胎中脑神经前体细胞，免疫荧光鉴定神经前体细胞的增殖分化特性。条件细胞表达DHH成功后分别与上述NPCs共培养10d，免疫荧光检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果 DHH在COS7、NIH/3T3和9L细胞中成功表达；同时，分离培养的大鼠胚胎中脑神经前体细胞具有良好的增殖分化特性，但两者共培养10d后偶见TH阳性的细胞。结论 DHH编码的蛋白不能或不能单独诱导与其共培养的NPCs定向分化为多巴胺能神经元。     

诱导性多能干细胞体外定向诱导分化的研究进展

胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究已成为发育生物学和细胞移植治疗学的研究热点,但伦理及免疫排斥问题一直阻碍胚胎干细胞（ES）的研究和临床应用。近两年,科学家成功地从多种成体细胞获得了诱导性多能干细胞（iPS细胞）,iPS细胞具有和胚胎干细胞相似的特性,由于其可来自自体成体细胞,因而可避开伦理及免疫排斥问题,是胚胎干细胞良好的替代材料,具有广阔的应用前景。iPS只有诱导分化为成熟的功能细胞才能用于疾病的治疗。主要介绍iPS细胞向成熟细胞分化的研究现状及目前存在的一些问题。     

造血干细胞的可塑性及临床应用

干细胞是一类具有自我复制和多分化潜能的细胞 ,根据其发育阶段不同 ,分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞具有多分化潜能 ;而成体干细胞的分化潜能则较为局限 ,只能定向分化为特化细胞。但新近的研究表明 ,成体干细胞在一定条件下可分化为与其所在组织不同的其他组织类型细胞 ,这种干细胞的可塑性被称为成体干细胞的横向分化(ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ)。其中造血干细胞 (ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＨＳＣ)作为人们认识最深入 ,其临床应用也最为广泛的一类成体干细胞 ,目前已成为成体干细胞可塑性…     

胰岛素样生长因子对神经干细胞增殖分化的影响

神经干细胞 (ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ ,ＮＳＣｓ)能增殖成恰当数量的细胞 ,在脑部各个区域按正确顺序排列组合 ,分化为神经元 ,星形胶质细胞、少突胶质细胞 ,这是发育过程中必不可少的过程。众多研究提示细胞外因子参与此过程的调控并影响ＮＳＣｓ的分化启动和分化方向。在这些细胞外因子中有着显著影响作用的是众多的生长因子 ,如ＥＧＦ (表皮生长因子 )、ＦＧＦ (成纤维细胞生长因子 )、ＩＧＦ(胰岛素样生长因子Ｉｎｓｕｌｉｎ -ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ)等。深入了解生长因子对神经发生的作用有助于进一步认识细胞增殖…     

胚胎干细胞移植治疗脑血管疾病

背景：胚胎干细胞移植是否能够成为脑血管疾病治疗有效的方法已成为目前研究的热点。 目的：探讨胚胎干细胞分化神经前体细胞移植治疗脑血管疾病的效果及可行性。 方法：分别建立帕金森病、缺血性脑损伤以及血管性痴呆大鼠模型,并进行胚胎干细胞体外培养,诱导分化为神经前体细胞,将胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入相应脑血管疾病模型大鼠脑内,观察脑血管病变大鼠的旋转行为学变化、脑组织病理变化以及海马结构的变化和神经细胞数目的变化。 结果与结论：胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入帕金森病大鼠脑内后,阿朴吗啡诱发的旋转次数逐渐减少,呈下降趋势,纹状体多巴胺的含量明显增高。胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入缺血性脑损伤大鼠脑内后,能够长期存在于脑内,并迁移、分布于受损的海马,构成海马结构,进一步分化为神经元,并且受损海马内的神经细胞数量明显增加。说明移植的胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的胚胎干细胞可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆功能,增强神经的可塑性,诱导自身定向迁移并分化为成熟神经元。     

RA诱导小鼠胚胎干细胞株MESPU35神经定向分化的研究

ES细胞 (Embryonic Stem Cells,胚胎干细胞 )是一种胚胎时期具有多项分化潜能的细胞 ,能够分化为来源于三个胚层的组织 ,体外培养时有高度未分化的特征。 1995年 Fraichard等发现培养 ES细胞加入 RA能够使之分化为神经元前体细胞、功能性神经元和胶质细胞。本实验对来源于 C5 7BL /6 J品系小鼠的 MESPU35胚胎干细胞系 ,用系列浓度的维甲酸 (retinoic acid,RA)利用 4- / 4 法诱导其神经定向分化。于不同的分化时相点 ,NF2 0 0 ,GFAP和 Gal- c免疫组织化学染色鉴定分化细胞的种类 ,并进行图象分析和统计学数据处理。得出以下结论 …     

神经前体细胞不是胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的必经途径

探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的途径,对胰腺组织工程的临床运用有重要意义。将胚胎干细胞在有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和白血病抑制因子的条件下培养扩增后,再将扩增后的胚胎干细胞不经过神经前体细胞阶段直接诱导为胰岛素分泌细胞,并与传统的多阶段诱导(经过神经前体细胞阶段)进行比较。结果发现,胚胎干细胞脱离饲养层细胞后,经过9~10d的分化诱导,可以分化为具有胰岛β-细胞特征的胰岛素分泌细胞。与传统的多阶段诱导方法相比,诱导过程简化,诱导时间缩短,所得到的胰岛素分泌细胞数量无明显差异。说明胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化存在多条途径。神经前体细胞阶段不是胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的必须途径。用传统的多阶段分化诱导法和直接诱导法都可以将胚胎干细胞诱导成胰岛素分泌细胞。     

人胚胎海马发育的形态学研究──Ⅱ．神经细胞与神经胶质细胞的分化

利用Ｈ－Ｅ和Ｎｉｓｓｌ染色法、免疫细胞化学法、Ｇｏｌｇｉ镀银法及透射电镜技术，对６０例６周至足月人胚胎海马神经细胞及神经胶质细胞的分化、发育进行了观察。结果表明；神经细胞及神经胶质细胞均由未分化细胞转化而来。未分化细胞、神经细胞和神经胶质细胞在对硝酸银的嗜染性、免疫细胞化学特征及超微结构特征等方面都有显著差别。神经细胞为神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）阳性细胞，主要有锥体细胞、颗粒细胞和篮状细胞等。星形胶质细胞和放射状胶质细胞为胶质原纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）阳性细胞。未分化细胞体积小、球形、胞质少，为ＮＳＥ及ＧＦＡＰ阴性，硝酸银镀染也不着色；透射电镜下未分化细胞核异染色质丰富，胞质内缺乏特化的细胞器，但糖原含量丰富。胚胎早期室管膜神经上皮细胞及由此迁徙而来的中间层细胞均由未分化细胞构成。星状胶质细胞和放射状胶质细胞出现较早，第１１周开始出现于室管膜下的室床及海马伞部；随胎龄增加，单位面积垦状胶质细胞数量增加，１７周后维持在相对稳定状态，并且均匀分布于海马各个部位与区域。１５周后中间层细胞陆续开始分化为锥体细胞和颗粒细胞，到足月胚胎锥体层及颗粒层不再有未分化细胞。     

Sertoli细胞诱导大鼠胚胎中脑神经干细胞定向分化的研究

目的研究Sertoli细胞对胚胎中脑神经干细胞的营养及向多巴胺能神经元分化的诱导作用。方法将大鼠Sertoli细胞与胚胎13d大鼠中脑神经前体细胞体外共培养5、7、10、14d后,免疫荧光检测神经干细胞标记物Nestin、神经元前体细胞标记物β-Ⅲ tubulin、多巴胺能神经元标记物酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况。结果随着共培养时间的延长,神经干细胞中nestin阳性细胞数量逐渐减少,β-Ⅲ tubulin阳性细胞数在共培养7d时较多,TH阳性的神经元在共培养10d时数量最多。而且在各时间段TH阳性细胞数均多于单独培养的神经前体细胞。结论Sertoli细胞能够诱导与其共培养的胚胎中脑神经干细胞定向分化为多巴胺能神经元。     

分子影像学方法示踪胚胎干细胞移植治疗急性肝损伤

背景：胚胎干细胞具有多向分化潜能,已被用于急性肝损伤的治疗,但其在体内治疗过程中的增殖迁移情况尚不清楚。 目的：利用分子影像技术监测移植胚胎干细胞在急性肝损伤修复过程中的行为。 方法：利用慢病毒载体,将萤火虫荧光素酶、红色荧光蛋白以及单纯疱疹病毒胸苷激酶三融合基因转入小鼠胚胎干细胞(D3)中,筛选得到稳定整合3个报告基因的D3胚胎干细胞系。将上述胚胎干细胞或分化了6 d的拟胚体细胞通过脾脏注射到急性肝损伤SV129模型小鼠体内,利用生物发光成像技术监测移植的细胞。 结果与结论：RT-PCR结果显示,三融合基因的转入并未影响胚胎干细胞Oct-4和Nanog的表达。利用小动物活体成像系统可以观察到移植细胞从脾脏迁移到肝脏的过程。移植的胚胎干细胞和拟胚体细胞都在肝脏处形成畸胎瘤,由于单纯疱疹病毒胸苷激酶同时也是自杀基因,可以与更昔洛韦作用诱导转基因细胞死亡,通过注射更昔洛韦来抑制畸胎瘤的生长并逐步将其杀死。组织学分析显示,畸胎瘤里包含来自于3个胚层的组织。提示三融合基因的转入并未影响胚胎干细胞的多向分化潜能,且胚胎干细胞用于细胞治疗有潜在的成瘤风险,影响了对肝损伤的修复,治疗策略有待进一步改进,并需要实时监控其在体内的行为。     

大鼠胚胎神经干细胞与永生化神经干细胞系C17.2定向分化为神经元潜能的差异

目的 对比大鼠早期胚胎神经干细胞( NSCs)与永生化神经干细胞系C17.2(C17.2-NSC)定向分化为神经元潜能的差异,确立适用于诱导NSCs定向分化为神经元高内涵药物筛选的NSCs筛选模型. 方法 C17.2-NSC、17d胚胎海马NSCs(E17-NSC)及11d胚胎大脑皮层NSCs(E11-NSC)均设定对照组和实验组,对照组与实验组的细胞在含有2％ (v/v) B27的DMEM/F12培养液中,分别经0μmol/L和1μmol/L维甲酸(RA)在37℃、5％CO2常规培养条件下诱导分化5d,通过免疫组织化学技术检测对照组与实验组中NSCs或前体细胞特异性标志蛋白巢蛋白(Nestin)及神经元特异性标志蛋白βⅢ微管蛋白(Tuj1)表达量的差异. 结果 与对照组相比,C17.2-NSC经1μμmol/L RA诱导后未定向分化为神经元,而E17-NSC及E11-NSC经1μmol/L RA诱导后可有效定向分化为神经元. 结论 相对于C17.2-NSC,大鼠早期胚胎NSCs定向分化为神经元的潜能更强,适用于诱导NSCs定向分化为神经元的高内涵药物筛选.     

小鼠胚胎心脏心外膜细胞体外培养模型的建立

背景：胚胎心脏心外膜细胞是最近被发现的具有分化为心肌细胞和血管平滑肌细胞潜能的心脏干细胞,可分化为心脏三系细胞,为心脏损伤的再生提供了新的细胞来源,但其定向分化机制及调控因素仍不清楚。目的：体外建立小鼠胚胎心脏心外膜细胞培养模型。方法：解剖显微镜下分离11.5-12.5 d小鼠胚胎心脏,剪除肺静脉血管、心房组织及左心室,移至6孔板(或35 mm培养皿)培养,24 h后移走胚胎心脏组织继续培养。相差显微镜观察胚胎心外膜细胞生长特点;使用免疫荧光技术对细胞进行胚胎心外膜细胞特异性抗体Wt-1、Tbx18染色。结果与结论：胚胎心外膜单层细胞从组织块边缘长出,呈鹅卵石样,并围绕组织块向外延伸。移去胚胎心脏后细胞继续生长,且增殖迅速,三四天后长至融合。所有细胞均强阳性表达胚胎心脏心外膜细胞特异性抗体Wt-1及Tbx18。结果表明,胚胎心脏心外膜细胞生长迅速、形态单一,均表达心外膜细胞特异因子,细胞纯度高,成功构建了体外胚胎心脏心外膜细胞培养模型,为研究其定向分化的分子机制提供了新的 思路。     

人胚胎脑海马神经前体细胞的分离培养及形态学研究

目的 :从人胚胎脑海马区分离、培养并鉴定神经前体细胞 ,观察其形态学变化。方法 :取胎龄 8～ 12周人胚胎脑海马区细胞 ,用含人表皮生长因子 (h -EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子 (h -bFGF)以及人白细胞抑制因子 (h -LIF)的DMEM F12培养液离体培养 ,以 1%胎牛血清 (FBS)和多聚赖氨酸诱导分化 ,倒置显微镜下测量形态指标 ,免疫细胞化学反应分析其神经化学性质。结果 :原代培养中 ,可见许多悬浮生长并渐增大的细胞球 ,以及很少数贴壁生长的成簇或单个细胞。将球吹打传代后 ,又有许多新的细胞球生成。取细胞球诱导分化 ,则见细胞从球迁出、伸出突起并渐分支 ,细胞分别 β -Ⅲtubulin、NF - 2 0 0、GFAP、Galc等免疫细胞化学反应阳性。 结论 :人胚胎脑海马区有神经前体细胞存在 ,离体培养时能分裂增殖和自我更新 ,并能被诱导分化为神经元前体细胞、神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞     

小鼠iPS细胞体外自发性分化及神经定向分化中基因表达谱的研究

目的:研究小鼠诱导多能干细胞(i PS细胞)在体外自发性分化和神经定向分化过程中的基因表达谱的特性。方法:在体外将i PS细胞分别进行形成类胚胎小体后自发性分化及成骨蛋白抑制剂Noggin诱导神经定向分化后,通过实时荧光定量PCR(q PCR)测定在分化过程中i PS细胞分化相关基因表达的变化。结果:i PS细胞形成类胚胎小体后胚胎外胚层标志基因(GFAP,Map2和Tu J1)及内胚层标记基因(Foxa2,GATA4和Sox17)的表达随分化而迅速增加,但中胚层标记基因(Bmp4,BRA,FGF5)表达水平变化不明显。在神经定向分化过程中,i PS细胞的神经标志物基因(Map2,Neu N,Tu J1和Sox1)及线粒体相关基因(12s,ND3,ND5,ND6、Cytb和Cox1)的表达都逐渐增加,且两者具有相同的增长趋势。结论:在自发性分化过程中小鼠i PS细胞具有自发向外胚层和内胚层分化的趋势;在神经定向分化过程中,i PS细胞的线粒体相关基因表达随着分化表达逐渐增加,并与神经细胞标记基因具有正相关性,表明线粒体的功能在i PS细胞神经定向分化中发挥重要作用。     

胚胎干细胞的定向心肌分化及其调控机制

胚胎干细胞是具有分化为各种类型组织细胞潜能的全能干细胞,可在体外大量扩增,细胞因子、激素、诱导剂和细胞内转录因子等可诱导和调控胚胎干细胞进行心肌细胞定向分化,这将使干细胞移植治疗心肌损伤性疾病成为可能。探讨胚胎干细胞向心肌细胞的定向分化及其调控机制,进而可在体内外调控干细胞向心肌细胞的定向分化,这将为临床应用干细胞分化新生心肌细胞以治疗心肌损伤性疾病提供理想的细胞来源和可靠的理论依据。