中国HIV-1C亚型代表株候选疫苗免疫原性的研究

1981年发现艾滋病至今,艾滋病毒(ＨＩＶ)累积感染了近5000万人,造成近1400万人死亡,其主要感染人群是青壮年[1]。ＨＩＶ的蔓延给国家社会和经济的发展带来严重的挑战,并会对公共财政系统造成巨大的压力。我国ＨＩＶ1的流行自1994年以后进入快速增长期,ＨＩＶ1多种亚型(Ａ、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ)在我国流行[2],如果不尽快控制其流行,到2010年累积感染者有可能突破1000万人[1]。有效的疫苗是控制ＨＩＶ流行的根本手段。我国流行亚型主要以Ｂ’亚型和Ｃ亚型为主,大约占流行亚型的45%和36%。针对这一流行趋势,我们在杆状病毒系统表达了我国…     

表达HIV-1 gag-gp120嵌合基因酵母工程菌的构建及表达条件的优化

目的：构建表达HIV-1gag-gp120嵌合基因的酵母工程菌，并优化表达条件。方法：将gag-gp120嵌合基因插入到酵母表达载体pHILS1中，构建了表达质粒pHILGP。线性化质粒电转化毕赤酵母菌GS115后进行整合，通过PCR及表达产物的SDS-PAGE和ELISA等方法筛选 阳性酵母工程菌，并优化表达条件。结果：成功构建表达融合蛋白的酵母工程菌，表达量为13%左右。表达蛋白能与HIV-1阳性血清发生反应，但其相对分子质量（Mr）比预计计算的值要小。最佳表达条件为：BMMY培养基，85%溶解氧，培养时间3d，1%甲醇诱导浓度。结论：表达的融合蛋白具有很好的抗原特异性，存在于上清中，这有利于目的蛋白的分离纯化。     

中国株HIV-1外膜蛋白基因疫苗诱导免疫小鼠免疫应答的实验研究

目的 :构建中国流行株HIV 1外膜蛋白 (gp12 0 )基因疫苗并接种小鼠 ,评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法 :将HIV 1gp12 0基因插入到真核表达载体pVAX1中 ,构建重组真核表达质粒pVAX1 GP12 0 ,并经EcoRI和PstI双酶切以及测序鉴定。同时以pVAX1 GP12 0和空载体pVAX1分别免疫BALB/c小鼠 ,采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN γ水平 ,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖 ,用乳酸脱氢酶 (LDH)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的应答。结果 :酶切及测序结果表明 ,成功地构建了HIV 1gp12 0基因疫苗。与空载体pVAX1组相比较 ,pVAX1 GP12 0免疫组小鼠血清抗HIV 1gp12 0抗体的滴度和IFN γ的水平均升高 ,两者差异显著 (P <0 .0 1)。pVAX1 GP12 0免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数 (SI)及特异性CTL的杀伤活性 ,均高于空载体pVAX1组 (P <0 .0 1)。结论 :构建了针对我国HIV 1流行株的gp12 0基因疫苗。以其免疫BALB/c小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫应答 ,为进一步将其用于我国的HIV的治疗奠定了基础。     

HIV-1中国株CN54 Gag蛋白在毕赤酵母中的表达纯化和鉴定

目的　利用毕赤酵母表达系统高效表达HIV 1中国株CN5 4的Gag蛋白,初步确立发酵和纯化工艺。方法　PCR扩增CN5 4Gag基因,插入毕赤酵母表达载体pPS1 0 ,电转化毕赤酵母菌株GS115 ,G4 18筛选高表达工程菌,利用5L发酵罐进行高密发酵,通过SPSepharoseFF和DEAESeparoseFF柱层析,用HIV 1阳性血清和p2 4抗原检测试剂盒对纯化后的Gag蛋白进行免疫学性质的鉴定。结果　构建了高效表达CN5 4Gag蛋白的毕赤酵母工程菌株,发酵罐培养的菌体密度吸光度(A6 0 0 值)超过30 0 ,Gag蛋白表达量达到12 0mg L。纯化后的Gag蛋白纯度高于90 % ,p2 4检测强阳性并能够与HIV 1阳性血清发生特异的抗原抗体结合反应。结论　本研究在毕赤酵母中高效表达了HIV 1中国株CN5 4的Gag蛋白,并进行了纯化和鉴定,为针对我国新一代HIV蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

中国株HIV-1 gp120核酸疫苗的实验免疫研究

目的　探讨表达中国株HIV 1gp12 0基因的核酸疫苗在小鼠体内的免疫反应。方法　将表达HIV 1gp12 0的核酸疫苗质粒pVAXP经肌肉注射免疫Balb c小鼠 ,检测免疫小鼠脾CD4 +、CD8+T细胞亚群的数量 ,脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果　重组质粒pVAXP免疫组小鼠脾CD4 +、CD8+T细胞亚群的数值均比对照组高 (P <0 .0 5 ) ;免疫组脾特异性CTL杀伤活性与对照组相比差异极显著 (P <0 .0 1) ;血清抗体滴度显著高于对照组 (P <0 .0 5 )。结论　表达HIV 1gp12 0基因的核酸疫苗质粒pVAXP能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫。     

含中国流行株HIV—1Gag—gp120融合蛋白的重组鸡痘病毒的构建

目的用重组鸡痘病毒表达中国流行株HIV-1Gag-gp120融合蛋白.方法在以鸡痘病毒282E4株为基础构建的重组表达质粒pUTAL的ATI-P7.5复合启动子下游,插入编码中国流行株HIV-1Gag-gp120嵌合基因,构建了重组表达质粒pUTALGP.重组质粒与FPV共转染CEF细胞,进行了同源重组.通过PUdR加压筛选,X-gal染色,获得重组鸡痘病毒vUTALGP.结果经Westernblot检测表明,重组病毒表达了Gap-gp120融合蛋白,其分子量分别为110×103、69×103、48×103、24×103.电镜观察可见Gag蛋白在CEF细胞中形成的反转录病毒样粒子.重组病毒免疫小鼠,能够诱导HIV-1特异的血清抗体反应.结论重组鸡痘病毒成功的表达了Gag-gp120融合蛋白,并进行了正确的加工.     

中国株HIV-1结构蛋白基因gag与gp120在巴斯德毕赤酵母中的融合表达

目的：将中国流行株B亚型HIV－1结构蛋白基因gag和gp120的巴斯德毕赤酵母中进行融合表达。方法：以酵母分泌型表达质粒pPIC9为载体，构建含HIV－1 gag和gp120嵌合基因的重组酵母表达质粒pPICGP。用Sac I将pPICGP线性化后，电转化巴斯德毕赤酵母GS115，用PCR的方法鉴定阳性酵母转化子。阳性转化子在巴斯德毕赤酵母中用甲醇进行诱导表达，表达产物以SDS－PAGE和Western blot进行分析，并对阳性菌株的遗传稳定性进行研究。结果：12个酵母转化子中共筛选到了8个阳性酵母转化子，其整合率为66．7％。SDS－PAGE和Western blot分析显示，在相对分子质量（Mr）为57000处有1条特异蛋白带，且能与抗p24单抗（mAb)和抗gp120mAb发生反应。酵母转化子在YPD培养基上传代10次后，其外源基因未丢失。结论：在巴斯德毕赤酵母中成功地表达了HIV－1 gag-gp120嵌合基因，且表达蛋白具有特异性，但其Mr较预计计算的值要小，说明嵌合基因中的gp120基因只有部分进行了表达。     

酵母表达的HIV-1中国株CN54 Gag蛋白的免疫原性研究

目的评价毕赤酵母表达的HIV-1中国株CN54 Gag蛋白在Balb／c小鼠诱导体液和细胞免疫的能力。方法利用重组Gag蛋白单独及与重组DNA或痘苗联合免疫Balb／c小鼠，检测小鼠产生的特异性结合抗体和IgG1／IgG2a，同时检测T淋巴细胞增殖反应和CTL反应。结果3个蛋白单独免疫组均能诱导小鼠产生抗体和T淋巴细胞增殖反应，其中不加佐剂的免疫组诱导免疫反应低于其它两组。但3组的CTL杀伤活性均不明显。重组蛋白和重组DNA及痘苗联合免疫均诱导产生了较好的体液和细胞免疫反应，而且重组痘苗初始免疫一蛋白加强免疫组还诱导产生了较强的CrL反应。结论酵母表达的HIV-1 Gag蛋白具有良好的免疫原性，在与重组DNA和痘苗疫苗联合使用时具有协同作用，能刺激动物产生更强的HIV-1特异性体液和细胞免疫反应。本研究为构建HIV-1蛋白疫苗和探讨各类疫苗的联合免疫方式提供了有价值的参考数据。     

含HIV-1核心蛋白基因的重组质粒的构建及其免疫应答的研究

目的构建含有HIV-1核心蛋白gag基因的真核表达质粒,并研究其免疫应答反应。方法采用PCR方法从1例HIV感染者中扩增出gag基因,构建重组质粒pcDNA-GAG。接种小鼠后,检测其抗体及抗体亚类,并对小鼠的淋巴细胞亚群进行分析,采用3H-TdR法、ELISPOT方法和51Cr释放法分别检测T淋巴细胞的增殖反应性、特异性分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞以及特异性CTL杀伤活性。结果重组质粒体外表达目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为55×103。免疫小鼠后可诱导产生特异性抗体,其中IgG2a与IgG的比例显著高于IgG1与IgG的比例;T淋巴细胞体外经ConA刺激后SI达到160.67,显著高于对照组(14.04,P<0.05);产生IFN-γ的CD8+T淋巴细胞数目以及特异杀伤率均显著高于对照组小鼠(P<0.05)。结论重组质粒pcDNA-GAG可诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答反应,而且ELISPOT方法检测特异性细胞免疫应答反应的结果与51Cr释放法一致,提示可用此法对DNA疫苗诱导的细胞免疫进行评价。     

HIV-1型中国株E、B亚型gag基因的克隆与表达

目的 克隆和表达人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）Ⅰ型中国株Ｅ、Ｂ亚型代表株的结构基因ｇａｇ。方法 在分子流行病学调查的基础上，选择１份经部分ｇｐ１２０基因测序判定为Ｅ亚型和１份经部分ｇｐ１２０基因测序判定为Ｂ亚型的代表性样品。利用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ），扩增外周血中的前病毒。获得了结构基因ｇａｇ全长片断，并先后克隆到ｐｌｉｎ８Ｐｒ５５和ｐＦａｓｔＢａｃｌ载体中，我们首次克隆到全长的中国株Ｅ亚型ｇａｇ基     

Ⅰ型人免疫缺陷病毒gag-gp120嵌合基因核酸疫苗的构建与鉴定

目的：构建含Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)gag—gp120嵌合基因核酸疫苗的表达质粒。方法：将gag和gp120连接后的嵌合基因插入到真核表达载体pVAX1中，构建真核表达质粒pVAXGE。用脂质体法将构建的重组质粒转染Hela细胞72h后，取转染的Hela细胞进行RT—PCR检测和和Dot—ELISA分析。结果：重组质粒转染细胞的总RNA中，可扩增出目的基因的转录产物。Dot-ELISA的结果显示，目的基因在Hela细胞内得到表达。结论：成功地构建了表达gag—gp120嵌合基因的核酸疫苗质粒，为HIV—1核酸疫苗的制备奠定基础。     

Adjuvant effect of Ubenimex on a DNA vaccine for HIV-1

Enhancement of DNA vaccine immunogenicity is a current topic of high priority in the field of applied immunology, especially as a means of controlling HIV infection. The adjuvant effect of Ubenimex (UBX), an anti-cancer immunomodulator, on a DNA AIDS vaccine which we developed was examined in a murine model. UBX was formulated into a preparation containing DNA plasmids encoding env and rev genes of HIV-1 strain III_B, and was inoculated intramuscularly into BALB/c mice. The sera obtained with this mixture had 2³–2⁵ times higher specific IgG titres than those obtained without the use of the adjuvant. UBX also elicited both a stronger HIV-1-specific DTH reaction, as measured by the footpad swelling test, and stronger cytotoxic T lymphocyte activity, as assayed by the ⁵¹Cr-release method, compared with responses using DNA alone. The cytokine secretion profile of restimulated immune lymphoid cells showed that UBX raised IL-2 and interferon-gamma levels and decreased IL-4 production. HIV-1-specific immunoglobulin subtype analysis demonstrated that UBX stimulated IgG2a production but suppressed synthesis of IgG1 and IgE. These results indicate that activation of the T-helper type 1 subset was induced by UBX, suggesting a mechanism of immunomodulation mediated by this agent. We conclude that UBX acts as an immunologic adjuvant for DNA vaccination against HIV-1. UBX may be a suitable adjuvant for clinical use because of its lack of antigenicity and low toxicity.     

中国流行株HIV—1gag和hIL—2／hIL—6核酸疫苗构建与实验免疫研究

目的 探讨中国流行株ＨＩＶ－１ｇａｇ与ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６共表达重组核酸疫苗闰的免疫效果。方法 以核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ为表达载体,构建重组核酸疫苗质料ｐＩＲＥＳ１－ｇａｇ、ｐＩＲＥＳ１－ｇａｇ－ｈＩＬ－２、ｐＩＲＥＳ１－ｇａｇ－ｈＩＬ－６,通过间接免疫荧光试验、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测ｇａｇ／ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,进行淋巴细胞转化试验、ＣＤ４＾＋、ＣＤ８＾＋Ｔ淋巴细胞数量测定、细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）特异性杀伤作用检测及血清抗体检测,结果 构建的重组质粒转染ＢＨＫ细胞后可表达目的基因,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖、诱导特异性ＣＴＬ反应,当和ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６共表达时免疫效果更加显著。讨论 与Ｇａｇ蛋白共表达的ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－     

HIV-1 B''亚型gag-env融合基因的DNA疫苗构建和免疫原性分析

目的 构建HIV-1 B′亚型中国流行株gag和env融合基因的DNA疫苗，对其免疫原性进行研究。方法 根据已报道的HIV-1 B′亚型RIA2分离株gag和env基因的氨基酸序列按哺乳动物密码子使用频率进行优化并人工合成基因，插入真核表达载体pDRVISV1．0中，构建表达RL42 gag-env，融合蛋白的DNA疫苗，pSVRL／GE。用Western blot和抗gag p55抗体细胞内染色的方法体外检测pSVRUGE的表达效率。DNA疫苗pSVRL/GE免疫BALB／c小鼠后，用ELISPOT检测小鼠的细胞免疫反应。结果 限制性内切酶鉴定表明融合基因已成功插入pDRVISV1．0载体中，Western blot证实融合基因可有效表达融合蛋白；细胞内染色结果表明，pSVRL/GE转染的293T细胞中49．8％表达gag p55，荧光强度均值为924；而空载体pDRVISV1．0转染的293T细胞中非特异背景染色只有0．5％。经免疫的小鼠脾细胞体外用H-2^d限制性表位肽AMQMIKET刺激后，ELISPOT检测显示，pSVRUGE免疫小鼠每10^6脾细胞形成226个斑点（SD=140），而空载对照组每1驴脾细胞形成29个斑点（SD=16）（P〈0．05）。结论 所构建的DNA疫苗pSVRL/GE可高效表达相应抗原蛋白，并可有效激活机体的细胞免疫反应。     

登革病毒2型NS1蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果观察

目的　以登革病毒 2型 (denguevirus2 ,DV2 )非结构蛋白 (non structrulprotein 1,NS1)为靶基因 ,构建DV2 NS1的候选DNA疫苗 ;并探讨其在小鼠体内诱导特异性体液免疫和细胞免疫的作用。方法　将登革病毒 2型NS1 NS2a基因片段克隆至含AG强启动子的真核表达载体pCXN2上 ,构建成重组体pCXN2 NS1 NS2a。在体外将重组质粒转染Cos 7细胞 ,间接免疫荧光检测其在真核细胞中的表达。大量提取空质粒和重组质粒 ,进行动物免疫实验。结果　重组质粒可在真核细胞中有效地表达NS1蛋白。免疫接种小鼠后可诱发机体产生针对NS1蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫。末次免疫前已有抗体产生 ,4周后达高峰。抗体依赖补体介导的溶细胞作用 (antibody dependentcomple ment mediatedcytolysis,ADCC)试验结果显示产生的抗体在体外具有特异的杀细胞作用。淋巴细胞增殖实验结果显示 ,实验组小鼠的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异有显著性。流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞变化情况 ,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比 ,CD4 + 、CD8+ 细胞水平有较大升高 (P <0 .0 1)。动物保护性实验结果显示 ,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时 ,有 6 6 .6 %的免疫鼠受到保护。结论　NS1 NS2a基因重组质粒免疫小鼠可以诱     

人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gag基因疫苗的免疫原性

目的 :检测人免疫缺陷病毒 1型 (HIV 1)gag基因疫苗的免疫原性。方法 :分别以ELISA、荧光抗体染色和乳酸脱氢酶释放法 ,检测免疫小鼠血清抗体滴度、脾T细胞亚群的数量和淋巴细胞杀伤效应。结果 :血清抗体滴度、脾T细胞亚群的数量及淋巴细胞杀伤效应 ,重组质粒pVAXGAG免疫组与空载体pVAX1对照组相比较差异显著(分别为P <0 .0 5和P <0 .0 1)。结论 :HIV 1DNA疫苗质粒pVAXGAG在BALB/c小鼠中不仅可诱导特异性体液免疫 ,而且可诱导特异性细胞免疫。