Caspase-3在大鼠中枢神经系统的表达研究

目的研究caspase-3在大鼠中枢神经系统的表达及其意义。方法用western-blot方法对出生1天和3个月SD大鼠的大脑皮质、中脑和小脑组织的caspase-3进行半定量测定。结果出生1天大鼠脑的caspase-3表达较高,出生3个月大鼠脑的caspase-3表达较低。结论caspase-3在中枢神经系统的发育成熟过程中对神经元的凋亡起着关键性作用。     

地塞米松影响小鼠胸腺细胞c-Myc表达以及凋亡研究

目的: 研究在地塞米松(DEX)诱导的小鼠胸腺细胞凋亡过程中c-Myc信号变化特点及其与下游caspase-3变化的相关性,以进一步探讨c-Myc在小鼠胸腺细胞凋亡过程中的作用机制。方法:以终浓度1 μmol/L地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡,通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定30 min、3 h、6 h和9 h凋亡和坏死细胞比率,在6 h时点电镜观察细胞形态,利用SDS-PAGE及Western blot检测0 min、30 min、1 h和3 h细胞内c-Myc和caspase-3信号变化特点。结果:在1μmol/L DEX诱导下,小鼠胸腺细胞在30 min、3 h、6 h和9 h凋亡比率分别为(5.70±0.46)%、(35.79±1.13)%、(50.61±2.15)%和(35.52±1.66)%,对照组分别为(5.97±0.25)%、(10.20±0.71)%、(12.10±0.66)%和(15.45±0.51)%,组间差异显著(P＜0.01)。相应DEX组坏死比率分别为(4.58±0.51)%、(4.66±0.67)%、(25.36±1.64)%和(46.99±2.67)%,对照组分别为(4.38±0.39)%、(4.19±0.73)%、(9.63±1.25)%和(13.38±0.72)%,组间差异显著(P＜0.01);电镜观察结果显示DEX处理6 h见较多典型凋亡细胞。对照组在0 min即可检测到c-Myc的明显表达,30 min略见增多,1 h和3 h呈微弱的下降趋势;DEX组c-Myc在0 min表达强于对照组,30 min最强,而在1 h和3 h显著减弱;对照组caspase-3随培养时间延长而逐渐增多,而DEX组caspase-3在0 min表达增多,30 min最多,而在1 h和3 h显著减少。结论:本研究结果提示DEX诱导的小鼠胸腺细胞凋亡呈现c-Myc介导的细胞凋亡模式,而且在该过程中c-Myc和caspase-3信号存在着反馈抑制调节的可能性。     

臭灵丹中黄酮类化合物对人喉癌细胞Hep-2凋亡的影响及机制

目的:探讨中药臭灵丹中黄酮类化合物诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡的机制。方法:MTT法检测分离自臭灵丹的黄酮类化合物3,5-二羟基-6,7,3',4'-四甲氧基黄酮(HTMF)对2种正常细胞的毒性和对3种肿瘤细胞株的增殖抑制作用;采用流式细胞仪检测化合物对Hep-2细胞凋亡率的影响;Western blotting法检测凋亡蛋白caspase-3和caspase-9的变化。结果:HTMF显著抑制Hep-2细胞的增殖并呈浓度、时间双重依赖性关系,但对正常细胞Vero和EVC304的毒性较小,对A549和HepG2细胞抑制作用小。流式细胞仪检测结果显示HTMF对Hep-2细胞有促凋亡作用并呈明显的量效、时效关系。Western blotting结果显示HTMF可诱导Hep-2细胞中caspase-3和caspase-9蛋白的活化,并呈时间依赖性关系。结论:HTMF对人喉癌细胞Hep-2的生长有显著的抑制作用,其机制可能通过激活caspase-9进而活化caspase-3诱导Hep-2细胞凋亡。     

STI571及As2O3诱导K562细胞凋亡机制的研究

目的：探讨比较STI571和As₂O₃诱导K562细胞凋亡及抑制其生长的可能机制，为进一步揭示慢性粒细胞白血病（CML）的发病机制及STI571和As₂O₃的临床应用提供理论依据。方法：采用细胞培养、台盼蓝染色、DNA琼脂糖凝胶电泳、Western blot等方法研究STI571和As₂O₃分别对K562细胞的生长抑制和诱导凋亡的作用，检测两种药物在诱导K562细胞凋亡的过程中某些凋亡相关蛋白的表达。结果：STI571和As₂O₃均可抑制K562细胞的增殖、诱导其凋亡。两种药物均可下调Bcl-XL的表达，并裂解caspase-3。As₂O₃作用浓度为2 μmol/L时其下调Bcl-XL的作用与1 μmol/L时没有明显的差别，但是其裂解caspase-3的作用较后者更加明显。结论：STI571作为凋亡诱导剂，可通过抑制Bcl-XL的表达从而激活caspase-3，诱导K562细胞凋亡；As₂O₃诱导K562细胞凋亡过程中伴有caspase-3的激活，但其作用并非完全是通过下调Bcl-XL蛋白水平而实现的。     

胆红素对大鼠急性肺损伤形成过程中氧自由基以及caspase-3表达的影响

目的： 探讨胆红素对抗急性肺损伤（ALI）形成的可能机制。方法: 健康雌性Wistar大鼠(190-210 g) 30只，随机分为生理盐水对照组、脂多糖（LPS）致ALI模型组、胆红素干预组。检测肺组织匀浆中羟自由基（OH^-）、过氧化氢(H₂O₂)和超氧阴离子自由基（O₂^·）含量以及肺组织中caspase-3表达的变化。结果: ①ALI模型组肺组织匀浆OH^-、H₂O₂、O₂^·含量及肺组织中caspase-3表达显著高于生理盐水对照组（均P<0.05）。②胆红素干预组肺组织匀浆OH^-、H₂O₂、O₂^·及肺组织中caspase-3表达明显高于ALI正常大鼠（均P<0.05），但少于ALI模型组（均P<0.05）。结论: ①胆红素能在一定程度上减少肺内凋亡细胞数量。②胆红素能减少ALI大鼠肺组织OH^-、H₂O₂、O₂^·水平。③ Caspase-3表达的变化有促脂多糖性肺损伤细胞凋亡作用。     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞凋亡及半胱天冬酶-3表达的影响

目的：观察同型半胱氨酸(Hcy)对人血管平滑肌细胞（VSMCs）凋亡以及半胱天冬酶-3（caspases-3）表达的影响。 方法： 采用组织贴块法体外培养人VSMCs，流式细胞术检测人VSMCs细胞凋亡，逆转录-聚合酶链反应法检测caspases-3 mRNA的表达。 结果： 体外培养的人VSMCs在终浓度为500 μmol/L Hcy的培养液中孵育0 h、6 h、12 h、24 h、48 h后的细胞凋亡率分别为2.39％±0.47％、2.45％±0.64％、7.58％±1.02％、13.37％±4.71％、17.69％±3.13％，caspases-3 mRNA与GAPDH扩增条带吸光度(A)比值分别为0.24±0.08、0.29±0.10、0.89±0.26、1.37±0.24、1.82±0.53，表明Hcy呈时间依赖性诱导人VSMCs细胞凋亡和 caspases-3 mRNA的表达上调；在终浓度为0、100、200、500、1 000 μmol/L Hcy的培养液中孵育24 h后的细胞凋亡率分别为2.68％±0.23％、2.79％±0.12％、8.45％±2.41％、13.37％±4.71％、23.75％±5.56％，表明Hcy呈浓度依赖性诱导人VSMCs细胞凋亡。 结论： Hcy诱导人VSMCs凋亡可能是由caspase-3参与的死亡信号通路介导的，诱导人VSMCs凋亡可能是Hcy致动脉粥样硬化作用的机制之一。     

c-Jun氨基末端激酶与caspase在细胞凋亡中的作用及相互关系

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者.在真核细胞中,已确定出4条MAPK信号转导通路[1],即细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK) 通路、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路、P38通路及ERK5通路.JNK也称为应激蛋白激酶,参与应激反应和细胞死亡[2].     

Cast-3与survivin在子宫肌瘤中的表达

目的：探讨caspase-3与生存素survivin在子宫肌瘤中的表达及与子宫肌瘤发生的相关性。方法：采用免疫组化S—P法及图像分析技术检测40例子宫肌瘤组织及40例子宫肌肉组织中caspase-3与survivin的表达。结果：子宫肌瘤组织及子宫肌肉组织中均显示caspase-3及survivin的表达，但各自的表达强度不同；在子宫肌瘤组织中caspase-3表达的阳性单位是3．61&#177;2．36，而在子宫肌肉组织中为11．30&#177;4．98（P〈0．05）；survivin在子宫肌瘤组织中表达的阳性单位是9．41&#177;3．52，在子宫肌肉组织中表达的阳性单位是5．35&#177;3．63（P〈0．05）。结论：Caspase-3与survivin在子宫肌瘤组织中共同表达，survivin呈现高表达，而caspase-3的表达下调，两者可能共同参与了子宫肌瘤的发生。     

半胱天冬酶天然抑制剂与细胞凋亡

在生物体内,细胞增殖与细胞凋亡总是处于动态平衡状态,从而保证了多细胞生物维系其结构稳定和内环境功能平衡及正常生长发育。正常的细胞凋亡可清除体内衰老的、磨损的或已完成功能的细胞,如胚胎细胞、胸腺细胞等;并能清除具有潜在危险的畸变细胞,如自身反应性淋巴细胞、突变细     

细菌氧化还原蛋白azurin诱导U2OS细胞凋亡过程中caspase-3的活化

目的:探讨细菌氧化还原蛋白azurin 诱导人骨肉瘤细胞U2OS凋亡过程中是否有caspase-3 的活化。方法:Annexin-V/PI FCM 检测细胞凋亡情况,用Western blot 分析caspase-3 酶原的变化,半定量RT-PCR 检测caspase-3 mRNA 水平的改变,比色法测定caspase-3 的相对活性。结果:用0、25、50、100、200 mg/L azurin处理U2OS细胞24 h,随药物浓度的增加,caspase-3 酶原的蛋白水平减少,caspase-3 的mRNA 水平增加(P<0.01) 。用100 mg/L azurin分别处理细胞3、6、12、24、48 h,caspase-3活性于6 h开始升高,24 h 达高峰(为对照组的7.2倍,P<0.01),48 h 仍高于对照组(P<0.01);用不同浓度的azurin 处理细胞,caspase-3 活性呈浓度依赖性升高。结论:Azurin诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡过程中有caspase-3 的活化,caspase-3在azurin诱导的骨肉瘤细胞凋亡机制中发挥了重要的作用。     

破伤风毒素C片段的基因克隆、表达、纯化及免疫原性分析

目的　对破伤风毒素C片段进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。方法　应用PCR技术直接从破伤风梭状芽孢杆菌的质粒DNA中扩增出 1370bp的破伤风毒素C片段(简称TTC)基因 ,将此基因片段插入到表达载体pET 2 2b( )中 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达。用阴离子交换层析和金属离子螯合亲和层析方法进行蛋白纯化后 ,参照《中国生物制品规程 2 0 0 0年版》的免疫攻击实验方法测定其效价。结果　经SDS PAGE分析 ,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的15 %。免疫印迹实验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。纯化得到纯度为 96 .5 %的重组蛋白 ,纯化回收率达 4 0 %。免疫攻击实验测定其效价为 18.70 6IU/mg,ED50 为 2 0 μg。经加强免疫 ,1μg免疫剂量即能产生足够的抗体保护动物免受破伤风毒素的攻击。结论　所获得的重组蛋白具有良好的免疫原性 ,为开发基因工程疫苗奠定了基础     

克隆、表达及测序一体化的原核表达载体pLCM182的构建及在细胞因子表达中的应用

Objective　To simplify the steps of cloning, sequencing and expressing of heterogeneous genes,a new integral plasmid pLCM182 has been designed and constructed. Methods　This new plasmid is characterized with the pL promoter and RBS of phage T7 gene 10 for high expression of the inserted gene,the universal sequencing primer sites for directly sequencing the inserted gene,and a multiple cloning site specified for fitting the optimizing of translation.Thus once cloning of a PCR product into this plasmid,the gene expression and sequencing can be done without the need of subcloning, and much more time can be saved. Results　By use of this plasmid,several genes obtained by PCR,including human IL-17,human IL-4,and human IL-1RA have been cloned,sequenced,and highly expressed. Conclusion　The integrative plasmid is applicable and convenient for cytokines expression.     

人PD-L2基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人PD-L2基因并构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法 以RT-PCR方法从活化的人外周血单个核细胞总RNA中克隆PD-L2基因的cDNA，构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果 克隆到PD-L2基因cDNA编码区全长序列，经DNA测序证明其与已报道的序列一致。进而构建了PD-L2胞外区的原核表达载体，并在大肠杆菌表达，免疫印迹分析表明在IPTG诱导后表达PD-L2胞外区蛋白，相对分子质量Mr为22000，与理论值大小相符。结论 成功克隆PD-L2基因，其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究PD-L2功能提供了条件。     

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌表达

目的 构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 利用Kpn1和Xho1位点酶切pcDNA3.1-RUNX3质粒,将获得的1300bp RUNX3编码序列插入到pGEX-4T-2中,构建pGEX-4T-2-RUNX3质粒,并转化Ecoli DH5α,筛选阳性重组子,酶切鉴定和...     

Immunohistochemical expression of activated caspase-3 in human myocardial infarction

There is mounting evidence that apoptosis is important in the pathogenesis of myocardial infarction (MI). One of the key events in the process of apoptosis is activation of caspase-3. Much attention has been recently paid to caspase inhibition as a potential treatment for ischemic cardiac disease. To predict the long-term effect of such treatment, it is essential to understand the significance of caspase-3 in the evolution of MI. Our aim was therefore to analyze immunohistochemical expression of activated caspase-3 in MI. Our study included autopsy samples of infarcted heart tissue from 50 patients with MI. Immunohistochemistry was performed by a sensitive peroxidase–streptavidin method on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, using monoclonal antibodies against activated (cleaved) caspase-3. We found caspase-3-positive myocytes in 18 MI less than 24 h old and in 3 MI that were presumably 48 h old. Their density (number of labeled myocytes/mm²) was greater in patients who received reperfusion treatment (mean 0.160±0.373 vs 0.025±0.037, p=0.06). In MI older than 48 h, positive reaction was observed in neutrophil granulocytes in the interstitium and, in subacute MI, it was observed in mononuclear inflammatory cells, myofibroblasts, and vascular endothelial cells. Our results suggest that apoptosis of myocytes is an important mode of cell death in the early MI, being enhanced in patients who received reperfusion treatment. After 48 h, apoptosis is an important mechanism of the clearance of neutrophil granulocytes and other inflammatory cells and of scar formation. Treatment with caspase inhibitors therefore will not only affect myocyte loss but will also interfere with the clearance of neutrophils and with the transformation of granulation tissue into a scar. The study complies with the current laws of the country in which they were performed.     

大鼠白细胞介素10(IL-10)cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:克隆大鼠白细胞介素10（IL-10）cDNA的全长序列,并使其在大肠杆菌中表达,为其分子生物学利用奠定基础。方法:无菌条件下切取大鼠的脾脏,收获脾细胞,用LPS刺激培养4h;提取细胞的总RNA,用RT-PCR技术克隆IL-10cDNA的全长序列;经测序后将IL-10cDNA插入表达载体 pJW2,转染 DH5α细胞后进行热诱导表达并对表达蛋白进行测定。结果:脾细胞经LPS刺激后IL-10转录水平增加,从提取的RNA易反转录并扩增出期望的PCR产物,测序结果表明得到的IL-10CDNA序列与基因库报告的序列完全一致。将其插入表达载体pJW2后经热诱导顺利表达出蛋白分子量与文献报道一致。Western-blot分析表明表达的条带可与小鼠抗大鼠IL-10抗体特异性结合。结论:大鼠的IL-10cDNA全长序列被成功克隆,克隆序列能够在大肠杆菌中表达。     

胰高血糖素衍生物在大肠杆菌的克隆表达和纯化

 目的 通过基因工程途径获得胰高血糖素衍生物。 方法 根据胰高血糖素基因及凝血酶酶切位点序列，分段合成引物行 PCR 扩增，以 PCR 扩增得到的胰高血糖素-甘氨酸基因序列和 pET-30a 质粒转化 E.coli DH5α，获得重组质粒 pET-G。将重组质粒 pET-G 转化至 E.coli BL21(DE3)，重组菌株命名为 E.coli BL21[pET-G]。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，对表达产物进行SDS-Tricine- PAGE[十二烷基硫酸钠-三（羟甲基）甲基甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳]分析和蛋白质印迹分析。对表达产物行Ni2+-NTA亲和层析纯化、凝血酶酶切和高效液相色谱（HPLC）纯化后，行 SDS-Tricine-PAGE分析和飞行质谱分析，并以 ELISA 方法检测其免疫活性。 结果 PCR 扩增获得的条带与预期的DNA表达片段大小一致，重组质粒 pET-G 测序结果与预期完全一致。SDS- Tricine-PAGE 和蛋白质印迹分析显示 E.coli BL21（DE3）的表达产物相对分子质量与预期相符。经亲和层析纯化、凝血酶酶切和 HPLC 纯化后得到了完整的重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物，SDS-Tricine-PAGE 分析显示其相对分子质量约为 3500，飞行质谱分析相对分子质量为 3531，二者基本一致。ELISA 检测表明重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物具有胰高血糖素免疫活性。 结论 采用基因工程技术在大肠杆菌中成功表达了胰高血糖素-甘氨酸衍生物，为通过体外酰胺化途径研制酰胺化胰高血糖素奠定了基础。     

EHEC O157:H7志贺样毒素Ⅱ(Stx2)的克隆表达与活性研究

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7志贺样毒素Ⅱ(Shiga like toxinⅡ,Stx2),并鉴定其生物学活性。方法采用PCR法自EHEC O157：H7基因组扩增志贺样毒素Ⅱ的编码基因stx2,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11c(+)-six2,经测序鉴定后转化E．coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDS-PAGE、Western blot分析目的蛋白的表达。以EHEC O157：H7野生菌株作对照,通过对HeLa细胞的细胞毒作用及对小鼠攻毒实验,鉴定重组蛋白的生物学活性。结果扩增的stx2基因约1230bp；原核表达质粒pET-11c(+)-stx2经酶切和测序鉴定与预期序列一致；并在E．coli BL21 (DE3)中得到表达,蛋白表达率约25％；PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(M_r)约72×10~3；重组蛋白Stx2对HeLa细胞具有细胞毒作用,CD_(50)为35pg/ml；Stx2对小鼠致死剂量LD_(100)为10μg。结论成功克隆并表达了Stx2重组蛋白,为探讨O157：H7菌的感染机制及其防治研究奠定了一定的基础。     

重组小鼠白细胞介素4在大肠杆菌中的高效表达

应用多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)及 DNA 重组技术,我们成功地构建了重组小鼠 IL-4表达克隆,命名为 pBV-mIL4.该质粒含有 P_RP_L 串联启动子,合成 SD 序列和温度敏感的CIts857基因,并且去除了完整小鼠 IL—4 cDNA 中3′侧翼非编码区,以原核系统高频使用的强终止密码子TAA 代替了原小鼠 IL-4基因的终止密码子 TAG,经 SDS-PAGE 及凝胶密度扫描分析,表达的重组小鼠 IL-4分子量约为14.2KDa,占总菌体蛋白量的25～30%.用 HT-2细胞株的~3H-TdR 掺入法测定表明:表达的重组小鼠 IL-4具有 TCGF 样活性,约每升细菌培养物可获1x10~7单位重组小鼠 IL-4,且这种 TCGF 样活性可被抗小鼠 IL-4单克隆抗体特异性中和.在大肠杆菌中表达具有生物活性的重组小鼠 IL-4,为其实验室研究及应用以及批量生产提供了可能.     

人抗菌肽hCAP18全长cDNA克隆及原核表达

目前发现，人体主要的抗菌肽有两大类；防御素（defensins）和cathelicidins。cathelicidins 家族成员中人类只有一个，即human cathelicidin antimicrobial peptide 简称hCAP18或LL-37。