用多孔微载体Cytopore高密度培养CHO工程细胞和两株杂交瘤细胞

采用Ｃｙｔｏｐｏｒｅ多孔微载体和低血清添加剂，在１．５ＬＣｅｌｉｇｅｎ灌流培养系统中成功地培养了重组ＣＨＯ工程细胞ＣＬ－１１Ｇ和产尿激酶原单抗的杂交瘤细胞。细胞密度均超过１×ｌ０７／ｍｌ，尿激酶原和抗体的产量均随细胞的密度增加而增加。该载体适用于大规模培养工程细胞和杂交瘤细胞     

用多孔微载体Cytopore高密度培养CHO工程细胞和两株杂…

采用Ｃｙｔｏｐｏｒｅ多孔微载体和低血清添加剂，在１．５Ｌ Ｃｅｌｌｉｇｅｎ灌流培养系统中成功地培养了重组ＣＨＯ工程细胞ＣＬ－１１Ｇ和产尿激酶原单抗的杂产瘤细胞。     

用国产SH－2型微载体和低血清培基灌流培养CHO工程细胞

采用国产ＳＨ—２型聚苯乙烯微载体和新研制的低血清培基添加剂ＢＩＧＢＥＦ—２，在改进了的灌流控制系统的控制下灌流培养产尿激酶原ＣＨＯ工程细胞ＣＬ—１１Ｇ，所得细胞密度超过１×１０￣７细胞／ｍｌ，尿激酶原平均活性为４００７ＩＵ／ｍｌ，最高达６６１４ＩＵ／ｍｌ，均高于以前采用５％血清的培基和Ｂｉｏｓｉｌｏｎ微载体培养时的水平，从而更有利于中试和未来的大规模工业化生产。     

5 L生物反应器中长期灌流培养CHO工程细胞生产rt-PA

目的 :利用 5L反应器培养CHO工程细胞生产重组组织型纤溶酶原激活剂 (recombinanttissueplasminogenactivator ,rt PA)。 方法 :在 5L搅拌式生物反应器中采用Cytopore1多孔微载体和无血清培基DF5S连续灌流培养CHO工程细胞株 4B3。结果 :持续培养达 10 3d ,活细胞密度和rt PA生产水平分别达到 6 .52× 10 6 个细胞 /ml和 1716 1U/ml。细胞培养上清经StreamlineSP离子交换层析和Lysine Sepharose 4B亲和层析两步纯化 ,获得纯度达到 98%的rt PA。SDS PAGE分析表明 ,整个培养过程所生产的rt PA具有较好的质量一致性。产品热原检测合格。结论 :实现高密度长期培养 4B3细胞 ,确定 5L培养工艺 ,为进一步扩大生产规模奠定了基础     

抗HBsAg人IgG表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

尝试将一株来源于人源性噬菌体抗体库的抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ,转换成完整的抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ。方法：采用重叠ＰＣＲ方法,在抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ的Ｖｋ和ＶＨ基因的５’端接上合工合成的人ｋ链的前导序列,构建表达完整ＩｇＧ１的真核表达载体,转染ＣＨＯ（ＤＨＦＲ＾－）细胞,用ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ和免疫印迹检测抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ的表达,通过ＤＨＦＲ／ＭＴＸ体系及金属离子诱导提高Ｉｇ表达。结果：获得表达量     

CHO细胞高效表达载体的优化

目的：研究分析中国仓鼠EF1—α基因的转录调控序列，以构建新型高效表达载体。方法：利用常规分子生物学技术，构建了一系列基于CHEF1—α基因的非翻译区调控序列元件的新型真核表达载体。以组织型纤溶酶原激活剂突变体（k2tPA）作为报告基因，利用本室已建立的CHO-dhfr^--Z^＋定点整合表达系统比较载体表达外源基因的能力，挑选表达量高的载体。进一步添加翻译增强子（H213及V163）序列，再进行评价。结果：CHEF1-α5′UTR及启动子＋3′UTR1．65kb、CHEF1-α5′UTR及启动子＋3′UTR2．7kb这2种组合均可有效提高目的基因tPA的表达，表达效率与对照载体相比分别提高了65．9％和54．5％。在添加翻译增强子V163后，载体pMCEdEF53Ⅲ-163frt-k2tPA的表达效率为对照载体的2．65倍。结论：该载体系统在重组蛋白药物的研发方面具有良好的应用前景。     

IIn-UK融合基因在CHO细胞中的高表达研究

目的 :构建新型高效真核表达载体 ,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶 (IIn UK)在CHO细胞中的高表达。方法 :利用常规分子生物学方法 ,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化 ,构建了一系列新型真核表达载体 ,以IIn UK融合基因为目的基因 ,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力 ,然后挑选高表达的克隆 ,通过MTX加压扩增 ,以提高IIn UK融合基因的拷贝数及表达水平。结果与讨论 :构建了 5种新型真核表达载体 ,并筛选出优化的真核表达载体 ,通过MTX加压扩增 ,实现了IIn UK融合基因在CHO细胞中的高表达 ,表达量达到 10 μg/ (10 6细胞·2 4h )。     

软骨细胞在微载体中的培养和快速扩增

目的：探索在短期内获得大量成活率高、分化良好的兔关节软骨细胞的方法,方法：应用胰蛋白酶、胶酶消化的方法从新生新西兰兔关节软骨处分离、培养软骨细胞,并将获得的软骨细胞在旋转生物反应应（RCCS）内应用Cytodex-3微载体进行培养。应用倒置显微镜和扫描电镜对微载体表面的软骨细胞进行动态观察,并对收获的软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原的细胞免疫化学染色分析。结果：并节软骨细胞可快速贴附于Cytodex-3微载体表面,细胞伸展后生长加速,到培养后期,细胞密度可达最初接种的20倍。在微载体上收获的软骨细胞Ⅰ型胶原的免疫细胞化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。结论：微载体细胞培养技术是一种简便、快速的体外细胞扩增方法,可为构体建组织工程化人工软骨提供大量软骨软件。     

8—MOP联合ATRA对腺样囊性癌细胞系SAcc83细胞的抑制作用

为研究8—MOP联合ATRA对人涎腺腺样囊性癌细胞系SAcc83细胞的抑制作用特点,应用MTT法测试并绘制药物抑制曲线,用倒置显微镜观察细胞形态变化。30％细胞生长抑制时,最佳联合用药合并指数(CI_(30))为0.66;50％细胞生长抑制时,最佳联合用药合并指数(CI_(50))为0.37,表明适当浓度的8—MOP与ATRA联合应用对SAcc83细胞可以呈现协同效应。单独应用8-MOP、ATRA或二者联合应用,SAcc83细胞出现退行性病变改变及类似凋亡小体样结构。合适浓度的8—MOP与A-TRA联合应用的临床价值有待进一步研究。     

表皮干细胞体外分离与培养

探索和建立表皮干细胞体外分离与培养的技术方法。通过酶消化法获得幼鼠表皮 ,并制成单表皮细胞悬液 ,以表皮干细胞培养基 ,即无钙EMEM培养基 (添加 9%FBS ,0 0 5mmol/LCaCl2 ,4ng/mlEGF ,0 5ng/ml硫酸庆大霉素及 5 0 %成纤维细胞条件培养基 )置细胞培养箱内培养。成纤维细胞条件培养基为无钙EMEM培养基(添加 9%FBS、0 0 5mmol/LCaCl2 、0 5 μg/ml硫酸庆大霉素 )培养幼鼠皮肤块 4 8h后所得培养液。将 1×10 6/ml上述培养的角质形成细胞经TGG细胞消化液 37℃下振荡消化后 ,接种至鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶内 ,37℃下静置 10～ 15min,留用快速贴壁细胞继续培养 ,所得细胞分别以能否呈克隆状生长和透射电镜观察其超微结构及β1整合素、K19免疫细胞化学染色进行鉴定。结果显示 ,鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶内快速贴壁细胞经继续培养 ,可见细胞呈克隆状生长。电镜观察其超微结构示非成熟细胞特征 ,β1整合素、K19免疫细胞化学染色阳性。研究表明 ,表皮干细胞可在体外分离与培养 ,本实验方法为较好方法之一。     

HA表位标记的人Axud1基因的构建及在肺腺癌SPC-A1细胞中的表达

构建在哺乳动物细胞中表达的血凝素HA表位标记的人Axud1融合蛋白表达载体。RT PCR从人外周血淋巴细胞中扩增Axud1全长cDNA ,用含HA序列的特异引物PCR扩增HA Axud1,经BamHⅠ、XbaⅠ酶切后插入到经BamHⅠ、XbaⅠ酶切的真核表达载体pcDNA3 .1( ) 中 ,重组质粒PCR、酶切和测序鉴定正确 ,最后将该质粒转染入肺腺癌SPC A1细胞中 ,Westernblot检测HA Axud1融合蛋白的表达。结果显示 ,筛选的G418抗性克隆SPC A1细胞中均有HA Axud1融合蛋白的表达 ,为进一步研究Axud1蛋白在肿瘤细胞中的功能提供了一个重要工具     

熊胆对HL-60细胞系的分化诱导作用

本文首次报道熊胆对人早幼粒白血病细胞系HL-60的分化诱导作用.HL-60细胞(1.6×10~5/ml)在含有熊胆(400μg/ml)的RPMI 1640培养液中37℃孵育5天左右,80%以上的细胞分化为具有单核-巨噬细胞特征的细胞.细胞增殖明显受到抑制.分化的细胞具有还原硝基蓝四唑和贴壁能力,显示吞噬乳胶颗粒的功能,并基本失去自发形成集落的能力.细胞的α-萘酚醋酸酯酶(α-NAE)和酸性磷酸酶(ACP)活性显著增加.     

子宫内膜细胞的培养和侵袭性研究

为探讨不同子宫内膜细胞在子宫内膜异位症(EM）发病机制中的作用，体外分离培养EM患者和对照组子宫内膜共49例。观察间质和上皮细胞的形态学特点，并采用Transwell—Col Insert细胞培养板，比较不同细胞的侵袭行为。结果显示，间质细胞侵袭能力强于上皮细胞；EM组子宫内膜细胞侵袭力强于对照组。提示在子宫内膜异位种植过程中，间质和上皮细胞可能具有不同的功能；EM患者子宫内膜本身具有不同于对照组的特性，使其更易于异位种植生长。     

SD大鼠神经干细胞培养鉴定实验研究

为探讨从SD胎鼠室管膜、皮质以及SD成年大鼠脑室下区、皮质分离并鉴定神经干细胞的可行性 ,以从上述部位分离的细胞作为种子细胞来源 ,在本实验室特制“CYTOKINE·神经干细胞培养基”中进行了神经干细胞培养诱导 ,单细胞连续传代培养 ,并分别以Nestin、NSE及GFAP免疫抗体鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。结果发现 ,4种来源的组织细胞在相应培养条件下均有神经干细胞快速增殖 ,并有由多细胞组成的神经球形成 ,经鉴定 ,该细胞球表达特殊的胚胎神经干细胞Nestin抗原 ;进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度进行培养 ,单个的细胞又很快形成神经球。对神经干细胞进行连续培养或加血清传代培养可使其进一步分裂增殖 ,有小芽形成并发育成突起、建立神经纤维联系 ,其中有的胞体增大 ,逐渐发育为较成熟的长突起细胞 ,长突起相互连接 ,交织成网 ,经鉴定为神经元及神经胶质细胞。 4种组织来源的细胞中所含有的干细胞数量不同 ,胎鼠较成年鼠更富含神经干细胞 ,室管膜或脑室下区所含神经干细胞较皮质更丰富 ,皮质来源的神经干细胞和室管膜来源的神经干细胞在形态学和分化程度上无特殊区别。该结果提示 ,SD胎鼠室管膜、皮质以及SD成年大鼠脑室下区、皮质 4种组织来源的细胞均含有神经干细胞 ;神经干     

外照射对体外培养的小细胞肺癌细胞系药物敏感性的影响

观察分次外照射对小细胞肺癌NCI H44 6细胞系药物敏感的影响并探讨其机制。采用GWGP80型远距离6 0 Co治疗机对进入指数生长期的NCI H44 6细胞进行分次外照射 ,每次 2Gy,总剂量为 5 0Gy。通过不同浓度丝裂霉素的干扰来观察外照射前后NCI H44 6细胞存活率的变化。结果显示 ,在相同浓度丝裂霉素的干扰下 ,照射组细胞的存活率均明显高于未照射组 (P <0 0 1)。提示对小细胞肺癌细胞系NCI H44 6进行外照射可抑制其总RNA的生物合成 ,提高其MDR1mRNA的表达水平 ;同时明显降低其对化疗药物的敏感性     

茯苓素对人白血病细胞系HL—60增殖的影响

本文报告了茯苓素对人急性早幼粒白血病细胞系HL-60增殖的抑制作用.经25～100μg/ml茯苓素处理1天,HL-60细胞DNA合成能力明显减弱.药物作用2天后,细胞计数明显少于对照组.这种效应随药物浓度的加大及作用时间的延长而增强.半数抑制浓度为58.4μg/ml.抑制作用为不可逆性.茯苓素处理4天后,HL-60细胞自发形成集落的能力明显减弱.细胞周期分析结果,加药后G_0/G_1期细胞明显增多,S和G_2+M期细胞减少.     

肝叶部分切除术后肝细胞DNA合成及细胞周期变化的实验研究

肝叶部分切除术后肝细胞ＤＮＡ合成及细胞周期变化的实验研究６３００３８重庆第三军医大学西南医院陈平，韩本立，陈娟，段恒春关键词肝再生；肝叶切除术；ＤＮＡ；细胞周期中国图书资料分类号Ｒ６５７．３肝脏再生是肝叶部分切除术后最基本的病理过程。但目前对再生肝细...