反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮细胞迁移的影响

目的探讨脂质体介导表皮生长因子(epidermal growthfactor receptor,EGFR)反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞迁移的影响。方法采用Murphy细胞计数方法评价反义寡核苷酸对人RPE细胞体外迁移的影响;分别应用ELISA法和半定量PCR检测反义寡核苷酸对RPE细胞EGFR蛋白和mRNA的抑制作用。结果脂质体介导EGFR反义寡核苷酸组与对照组比较,细胞迁移活性受到明显抑制(P<0.05),24h后抑制率75.27%.转染24h后EGFR蛋白和mRNA表达的抑制率分别为67.60%和35.20%.结论脂质体介导EGFR反义寡核苷酸可抑制EGFR蛋白表达和mRNA的表达,并可抑制人RPE细胞体外迁移,脂质体介导的反义寡核苷酸可能是针对RPE的一种有希望的基因治疗方法。     

荧光标记的反义寡核苷酸在人视网膜色素上皮细胞中的分布研究

目的 观察表皮生长因子受体（EGFR）反义寡核苷酸（ASO）转染人视网膜色素上皮细胞（RPF）后的分布。方法 将荧光素标记的硫代修饰型及修饰型EGFRASO直接或在脂质体介导下转染入RPE,荧光显微镜观察细胞内的分布。结果 非修饰型ASO在直接转染或脂质体介导下均发现荧光在4h后消失。修饰型直接转染8h后消失。脂质体介导下,细胞内荧光数目明显增加,细胞核内荧光强度增强,14－16h后细胞荧光消失。结论 脂质体增加修饰型ASO与RPE结合的数量,延长在细胞内停留时间,同时使其在细胞核内分布聚积明显;硫代修饰ASO具有更好的稳定性。     

反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮细胞EGFR表达和增生抑制作用的研究

目的 研究反义寡核苷酸(ODN)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞，表皮生长因子受体(EGFR)表达和增生的影响。方法 采用人工合成反义ODN经阳性脂质体包裹后转染人RPE细胞。用MTT和细胞周期分析检测转染ODN后对细胞的生长抑制作用，采用半定量RT-PCR法与ELISA法检测EGFR mRNA及蛋白的表达水平。结果 显示转染反义ODN 24 h后，EGFR mRNA的表达抑制率为35．2％，EGFR蛋白抑制率为66．45％。48 h后．反义EGFR ODNS对EGFR蛋白的抑制作用消失。EGFR反义ODN对RPE细胞生长增生的抑制率约为40％。细胞周期分析EGFR反义ODN作用于细胞后，细胞G0／G1期细胞数明显增多，S期细胞数相应减少，而G2 M期细胞数亦明显减少。结论 EGFR反义SON可抑制人RPE细胞的生长和EGFR mRNA及其蛋白的表达。     

端粒酶编码区的反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮细胞增生的影响

目的探讨不同浓度端粒酶编码区的反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮细胞增生活性的影响。方法用不同浓度(0μmol·L-1、5μmol·L-1、10μmol·L-1、15μmol·L-1)端粒酶编码区的反义寡核苷酸处理人视网膜色素上皮细胞24h后,使用MTT法测定视网膜色素上皮细胞增生的抑制率,使用流式细胞仪检测其对视网膜色素上皮细胞周期的影响。结果不同浓度端粒酶编码区反义寡核苷酸处理过的视网膜色素上皮细胞的抑制率随反义寡核苷酸浓度的增高而升高,并将视网膜色素上皮细胞阻滞在G0/G1期。结论端粒酶编码区的反义寡核苷酸对视网膜色素上皮细胞有抑制作用且呈浓度依赖性,这一结论可能成为增生性玻璃体视网膜疾病基因治疗的一个新靶点。     

PDGF-α受体反义寡核苷酸对体外视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨血小板源性生长因子-α受体反义寡核苷酸(PDGFR-αASODN)对体外人视网膜色素上皮(humanretinal pigment epithelium,HRPE)细胞增殖和凋亡的作用。方法:使用阳离子脂质体lipofectamineTM2000将靶向PDGFR-α基因的ASODN转染至细胞株HRPE细胞,MTT法检测对HRPE细胞增殖的影响;Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞;流式细胞仪检测HRPE细胞的周期和凋亡率。结果:PDGFR-αASODN转染组细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于对照组(P<0.05)。结论:沉默PDGFR-α基因表达可显著抑制HRPE细胞的增殖,并能诱导其凋亡。     

EGFR反义寡核苷酸对人视网膜神经胶质细胞增生的影响

目的 观察表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR)反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN)对人视网膜神经胶质（retinal glial,RG)细胞增生的影响。方法 人视网膜神经胶质细胞的原代培养，用脂质体（Lipofectin)作为载体将修饰型EGFR ASODN转染RG细胞后，MTT法测细胞增生活性（吸光度A值）的变化。流式细胞仪观察细胞周期的变化。结果 EGFRASODN转染RG细胞后，细胞的增生活性降低，对RG细胞生长增生的抑制率约为46.5%，进入S期的细胞减少。结论 EGFRA-SODN能够抑制人RG细胞增生。     

增生细胞核抗原在视网膜色素上皮细胞表达及其反义寡核苷酸的抑制作用

目的 研究视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中增生细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达及其反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,AS ODN)对其表达和细胞增生的抑制作用，为增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)治疗探索基因治疗新途径。 方法 (1)体外培养兔眼RPE细胞，在不同时间采用链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(streptoavidin-biotin enzyme complex,SABC)免疫组织化学法检测PCNA的表达;(2)脂质体介导下不同浓度的PCNA AS-ODN和正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,S-ODN)分别作用于体外培养的RPE细胞，采用免疫组织化学方法检测PCNA的表达;(3)四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测在不同浓度的PCNA AS-ODN和S-ODN作用下RPE细胞生长活性及其生长抑制率。 结果 (1)体外培养兔眼RPE细胞表达PCNA，表达高峰为培养后48 h ;(2)在0.28、1.12 μmol/L AS-ODN 作用下，PCNA的表达明显受抑制;(3)0.28、1.12 μmol/L的PCNA AS-ODN 能明显抑制RPE细胞增生活性，并呈剂量依赖性，其生长抑制率分别达53%、81%。 结论 一定浓度PCNA AS-ODN能序列特异性地抑制RPE细胞PCNA表达和增生活性，有望进一步用于PVR的治疗实验研究。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 231-233)     

表皮生长因子通过EGFR/AKT信号通路对视网膜色素上皮细胞增殖和迁徙的影响

目的：探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞增殖和迁徙的影响。

方法：体外培养人RPE细胞株(ARPE-19细胞),给予不同浓度EGF处理ARPE-19细胞,通过噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)实验、5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)吸收实验和细胞划痕实验检测EGF对ARPE-19细胞活力、增殖和迁徙的影响; 通过Western blot法检测EGF对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)蛋白表达的影响。

结果：MTT实验显示50、100ng/mL EGF处理12h诱导ARPE-19细胞活力增加; BrdU吸收实验显示100ng/mL EGF处理24h诱导BrdU染色阳性ARPE-19细胞数增加; 细胞划痕实验显示100ng/mL EGF处理24h可以诱导ARPE-19细胞迁徙能力增加。Western blot检测显示使用10～100ng/mL EGF 处理细胞 12h或者100ng/mL EGF 处理细胞15～180min均可以诱导磷酸化EGFR(pEGFR)表达升高和总EGFR表达降低,同时也可以诱导磷酸化AKT(pAKT)表达升高,但是对总AKT表达无显著影响。

结论：EGF通过EGFR/AKT信号通路增加RPE细胞的活力、增殖和迁徙能力,可能对增殖性玻璃体视网膜病变中RPE细胞的异常增殖和迁徙起到重要作用。     

EGFR反义寡核苷酸对人视网膜神经胶质细胞迁移的影响

目的:观察表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对人视网膜神经胶质(retinal glial,RG)细胞迁移的影响。方法:人视网膜神经胶质细胞的原代培养,用脂质体(Li-pofectin)作为载体将修饰型EGFR ASODN转染RG细胞后,采用Murphy细胞计数方法评价反义寡核苷酸对人RPE细胞体外迁移的影响。结果:脂质体介导EGFR反义寡核苷酸组与对照组比较,细胞迁移活性受到明显抑制(P<0.05),转染24h后抑制率63.27%。结论:EGFR ASODN能够抑制人RG细胞迁移。     

脂质体介导的C-myc反义寡核苷酸在视网膜色素上皮细胞中分布和稳定性的观察

目的；在体外培养的人视网膜色素上皮（RPE）细胞中，观察脂质体（Lipofectamine)介导的C-myc反义寡核苷酸转染效果，为进一步研究增生性玻璃体视网膜病变（PVR）的防治提供实验依据。方法：将人工合成带有FAM荧光标记的反义寡核苷酸（AS－ODN）用脂质体包裹转染体外培养的RPE细胞，同时用无脂质体介导的裸AS－ODN作对比，在荧光显微镜下动态观察AS－ODN在RPE细胞内的分布和存留时间。结果：与无脂质体介导的裸AS－ODN相比，脂质体介导的AS－ODN在细胞内，尤其在胞核的分布明显加强；不仅转染速度快，而且在细胞的存留时间延长1倍以上。结论：脂质体能明显增强AS－ODN在RPE细胞内的转染效率，有望进一步用于防治PVR的研究。     

生长因子与视网膜色素上皮细胞

目前 研究认为视网膜色素上皮(RPE)细胞是构成增生性视网膜疾病中增生膜的主要细胞成分。RPE细胞的增生和移行，使得增生组织长人玻璃体内，最终导致牵拉性视网膜脱离和失明。新近研究的某些生长因子在RPE细胞的增生和移行中发挥了重要作用。介绍几种主要的生长因子对RPE细胞的作用，为RPE细胞的实验研究和临床研究提供理论基础。     

YM155 inhibits retinal pigment epithelium cell survival through EGFR/MAPK signaling pathway

AIM:To investigate YM155’s effect on retinal pigment epithelium(RPE)cells’viability and the potential regulatory mechanisms.METHODS:Human immortalized RPE cell lines(ARPE-19 cell line)were processed with YM155 and epidermal growth factor(EGF).ARPE-19 cell viability was detected by methyl thiazolyl tetrazolium assay,and apoptosis was tested by flow cytometry assay.ARPE-19 cell proliferation was assessed with bromodeoxyuridine tagged incorporation assay,and migration ability was evaluated via a wound-healing assay.Epidermal growth factor receptor(EGFR)/MAPK pathway proteins were tested via immunoblotting.EGFR localization was examined by immunofluorescence assay.RESULTS:YM155 suppressed ARPE-19 cells’viability in a time and concentration-dependent manner.A high dose of YM155 caused a small amount of ARPE-19 cell death.YM155 significantly diminished the ARPE-19 cells’proliferative and migrative capacity.YM155 downregulated total EGFR and phosphorylated external signalregulated protein kinase(ERK),and it up-regulated the phosphorylation of P38 MAPK and c-Jun N-terminal kinase(JNK).YM155 induced endocytosis of EGFR in ARPE-19 cell.YM155 also attenuated EGF-induced ARPE-19 cells’proliferative and migrative capacity.Moreover,YM155 significantly decreased the expression of phosphorylated EGFR and ERK after treated by EGF.CONCLUSION:YM155 inhibits RPE cell survival,the cell proliferative and migrative capacity,and it effectuates a small amount of cell death through the EGFR/MAPK signaling pathway.YM155 might,therefore,be an agent to prevent and treat abnormal RPE cell survival in proliferative vitreoretinopathy.     

Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway

AIM: To investigate the cross-talk between oxidative stress and the epidermal growth factor receptor (EGFR)/AKT signaling pathway in retinal pigment epithelial (RPE) cells. METHODS: Human RPE cell lines (ARPE-19 cell) were treated with different doses of epidermal growth factor (EGF) and hydrogen peroxide (H2O2). Cell viability was determined by a methyl thiazolyl tetrazolium assay. Cell proliferation was examined by a bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation assay. EGFR/AKT signaling was detected by Western blot. EGFR localization was also detected by immunofluorescence. In addition, EGFR/AKT signaling was intervened upon by EGFR inhibitor (erlotinib), PI3K inhibitor (A66) and AKT inhibitor (MK-2206), respectively. H2O2-induced oxidative stress was blocked by antioxidant N-acetylcysteine (NAC). RESULTS: EGF treatment increased ARPE-19 cell viability and proliferation through inducing phosphorylation of EGFR and AKT. H2O2 inhibited ARPE-19 cell viability and proliferation and also suppressed EGF-stimulated increase of RPE cell viability and proliferation by affecting the EGFR/AKT signaling pathway. EGFR inhibitor erlotinib blocked EGF-induced phosphorylation of EGFR and AKT, while A66 and MK-2206 only blocked EGF-induced phosphorylation of AKT. EGF-induced phosphorylation and endocytosis of EGFR were also affected by H2O2 treatment. In addition, antioxidant NAC attenuated H2O2-induced inhibition of ARPE-19 cell viability through alleviating reduction of EGFR, and phosphorylated and total AKT proteins. CONCLUSION: Oxidative stress affects RPE cell viability and proliferation through interfering with the EGFR/AKT signaling pathway. The EGFR/AKT signaling pathway may be an important target in oxidative stress-induced RPE cell dysfunction.     

生存素(Survivin)抑制剂YM155对视网膜色素上皮细胞活力和迁徙能力的影响

目的　探讨生存素(Survivin)抑制剂YM155对视网膜色素上皮细胞活力和迁徙能力的影响。方法　将ARPE-19细胞分为对照组（不作任何处理）,10 nmol?L^-1、20 nmol?L^-1、50 nmol?L^-1 YM155组（用相应浓度YM155处理细胞24 h）,MTT检测各组细胞活力,Western blot检测各组细胞表皮生长因子受体（EGFR）、AKT、Survivin蛋白的表达情况;采用细胞迁徙实验和免疫荧光染色实验检测对照组与20 nmol?L^-1 YM155组细胞迁徙能力和EGFR表达情况。结果　MTT检测结果显示,与对照组相比,10 nmol?L^-1、20 nmol?L^-1和50 nmol?L^-1YM155组ARPE-19细胞的相对细胞活力平均降低约42.3%、55.6%、73.0%,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。使用20 nmol?L^-1YM155处理ARPE-19细胞24 h会降低细胞迁徙能力。YM155处理细胞24 h后,10 nmol?L^-1 YM155组细胞EGFR和AKT蛋白表达,与对照组相比无明显差异（均为P<0.05）,但Survivin蛋白表达下调（P<0.05）;20 nmol?L^-1YM155组细胞AKT蛋白表达,与对照组相比亦无明显差异（P>0.05）,EGFR和Survivin蛋白表达均下调（均为P<0.05）;50 nmol?L^-1组细胞EGFR、AKT和Survivin三种蛋白表达均下调,与对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。免疫荧光染色检测结果显示,对照组ARPE-19细胞EGFR均匀表达于细胞膜,20 nmol?L^-1YM155组表达于细胞膜的EGFR被内吞转移到细胞质内,在细胞核周围呈颗粒状分布;YM155可以诱导细胞骨架损害、F-肌动蛋白纤维排列紊乱,细胞核增大。结论　YM155能抑制ARPE-19细胞活力和迁徙能力,YM155对视网膜色素上皮细胞活力和迁徙能力的影响与Survivin、EGFR和AKT的蛋白表达下调有关。