siRNA抑制DNA-PKcs表达及对HeLa细胞增殖的影响

背景与目的：建立抑制DNA-PKcs表达的细胞模型,以此探讨DNA-PKcs的功能。材料与方法：构建DNA-PKcs的siRNA抑制表达载体,利用Lipofectamine介导,转染HeLa细胞,筛选稳定表达的转化克隆。Western blot检测DNA-PKcs表达。通过细胞生长速度检测细胞辐射敏感性变化。结果：设计了作用于DNA-PKcs不同位点的3条siRNA,并构建表达质粒,转染HeLa细胞,获得了3个稳定转化克隆,Western blot分析表明其DNA-PKcs表达受到明显抑制,细胞对了射线和紫外线的敏感性增加,接种裸鼠后的肿瘤生长速度减慢。结论：成功建立了DNA-PKcs表达抑制细胞模型,并且发现DNA-PKcs表达抑制后除影响细胞的辐射敏感性外,还可能与肿瘤细胞增殖有关。     

腺病毒介导的shRNA沉默hTERT基因表达对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨靶向人端粒酶反转录酶（hTERT)的短发夹RNA（shRNA)对人鼻咽癌细胞株CNE-2 hTERT表达的影响,及其对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的效应。方法构建表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因和靶向hTERT基因短发夹RNA的重组腺病毒质粒,观察其对鼻咽癌细胞株(CNE-2)的转染效果,RT-PCR检测hTERT mRNA表达水平,Western blot检测hTERT蛋白表达水平,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡状况。结果Adv-EGFP-shTERT重组腺病毒质粒转染率可达90%以上,成功转染CNE-2细胞24 h后,hTERT mRNA的表达水平显著下降,转染48 h后,hTERT蛋白表达明显下调,细胞增殖活性受到显著抑制,细胞凋亡率可达23.0%。结论腺病毒载体介导靶向hTERT基因的RNA干扰,能显著抑制端粒酶反转录酶表达,进而抑制端粒酶活性,抑制CNE-2细胞增殖并诱导其凋亡,为鼻咽癌的基因治疗研究提供了理论基础。     

靶向尿激酶受体uPAR基因的shRNA表达载体的构建及鉴定

背景与目的：尿激酶受体（uPAR）与肿瘤的侵袭和转移密切相关,抑制uPAR的表达,可以抑制肿瘤的转移。本研究构建uPAR基因短发夹RNA（shRNA）的表达质粒,为舌鳞状细胞癌RNA干涉（RNAi）介导的基因治疗打下基础。方法：根据GenBank数据库提供的uPAR基因序列,选择设计合成能转录shRNA的DNA序列,将它们插入真核表达载体pWH1构建重组质粒,用酶切的方法进行鉴定;最后将构建成功的特异性表达载体（pWH1-uPAR）转染至舌鳞状细胞癌,通过RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot观察其对舌鳞状细胞癌uPAR mRNA和蛋白水平表达的影响。利用MTT实验检测细胞增殖能力的变化。结果：成功构建了uPAR shRNA表达载体;与Ts细胞和转染空载体pWH1的Ts细胞相比,转染pWH1-uPAR表达载体的Ts细胞uPAR mRNA和蛋白的表达明显降低。MTT结果显示uPAR shRNA对Ts细胞增殖的抑制率为32.9%。结论：设计构建的真核表达载体可以特异性干扰uPAR基因的表达,为进一步研究uPAR基因的功能和舌鳞状细胞癌治疗提供有效的方法和手段。     

RNAi抑制Akt2基因表达对卵巢癌细胞系A2780放射敏感性的影响

背景与目的:许多研究已经表明蛋白激酶B(P13K/Akt)在肿瘤细胞恶性增殖及肿瘤对放化疗的拮抗中起着重要作用,Akt2是Akt家族成员之一.本研究应用RNAi(RNA interference,RNAi)技术抑制Akt2基因的表达,观察其对肿瘤细胞生长和放射敏感性的影响.方法:构建Akt2基因的短发卡状RNA质粒转染人卵巢癌细胞A2780,同时以转染空载体和未转染组作为对照,3组细胞命名为pAkt2-shRNA/A2780,pEGFP/A2780和A2780)运用RT-PCR、蛋白质免疫印迹方法比较转染前后Akt2表达的差异;四甲基偶氮唑蓝实验绘制细胞生长曲线;克隆形成实验观察细胞的放射敏感性变化,以克隆形成率表示;6 MV X线10 Gy照射后48 h收集细胞,流式细胞仪(FACS)分析细胞凋亡情况.结果:与对照相比,shRNA可抑制Akt2 mRNA转录和蛋白的表达,差异显著(P＜0.05);pAkt2-shRNA/A2780细胞生长明显慢于pEGFP/A2780和A2780细胞;pAkt2-shRNA/A2780细胞克隆形成率明显低于pEGFP/A2780细胞和A2780细胞(P＜0.05);pAkt2-shRNA/A2780,pEGFP/A2780和A2780细胞凋亡率分别为(78.3±2.2)%、(41.2±1.8)%和(40.4±2.0)%,差异有显著性(P＜0.05).结论:转染针对Akt2基因shRNA真核表达载体,抑制卵巢癌细胞中Akt2基因表达,能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,增强其对放射治疗的敏感性.     

RNA干扰技术抑制smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：探讨用RNA干扰技术下调smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响。方法：用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的三对短发夹状RNA（shorthairpinRNA，shRNA）序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中，构建smad4shRNA表达载体pGenesil—smad4一shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa，经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测抑制smad4基因对宫颈癌细胞增殖的影响。结果：成功构建分别携带三段shRNA及空载体对照的重组质粒pGenesil—smad4-shRNA1、2、3和pGenesil-con，三种shRNA重组质粒中pGenesil—smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA及smad4蛋白表达，筛选出的HeLa／shRNA2细胞增殖能力明显增强。结论：应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断smad4基因表达及功能的shRNA，smad4基因表达下调能明显促进宫颈癌细胞生长。     

重组人血管内皮生长因子165对K562白血病细胞生物学活性的影响

目的：探讨人重组血管内皮生长的因子165对人K562白血病细胞生物学活性的影响。方法：利用pcDNA3.1（＋）质粒构建人重组含VEGF165的真核表达载体,脂质体转染至K562白血病细胞,并用G418筛选阳性克隆;以RT-PCR测定重组质粒载体VEGF165基因的表达;MTT法测定K562白血病细胞的生长;建立裸鼠皮下移植人K562肿瘤模型,测定肿瘤体积的大小;免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）。结果：成功构建pcDNA3.1（＋）-VEGF165表达质粒。K562白血病细胞转染重组质粒后,明显增加K562细胞中VEGF165 mRNA的表达,转染重组质粒的K562细胞增殖明显快于对照组;移植重组pcDNA3.1（＋）-VEGF165质粒转染的K562细胞之后,荷瘤鼠移植瘤生长明显快于对照组;并且移植瘤组织微血管密度明显高于对照组（P〈0.05）。结论：利用pc DNA3.1（＋）真核表达质粒可成功构建含人VEGF165的重组质粒,重组质粒转染K562细胞后,体内外均明显促进K562细胞增殖。     

STAT5A基因表达对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡影响的观察

目的:研究抑制STAT5A基因的表达对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响,为其作为肝癌基因治疗的新分子靶点提供实验依据,并对RNAi实验方法的优化进行探讨.方法:构建2个针对STAT5A基因不同位点的RNA干扰(RNAi)真核表达载体,为减少脱靶效应和细胞毒性,采用两载体共转染的方法转染人肝癌细胞HepG2,分别采用半定量RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染前后细胞中STAT5A mRNA和蛋白表达的变化;采用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:酶切及测序结果显示,STAT5A基因两位点的shRNA表达载体均构建成功;两载体共转染HepG2细胞48 h后,与对照组相比,RT-PCR结果显示实验组细胞中STAT5A mRNA的抑制率约为66％,P＜0.05;蛋白质印迹法检测结果显示,STAT5A蛋白的抑制率约为58％,P＜0.05;同时MTT法显示实验组较对照组在转染后24～96 h内细胞生长速度减慢、增殖抑制明显(P＜0.05),流式细胞仪检测实验组细胞凋亡率为(34.68±0.78)％,明显高于阴性对照组(5.12±1.09)％和空白组(4.75±1.65)％,P＜0.05.结论:成功构建了针对STAT5A基因的RNA干扰真核表达载体,两载体共转染可有效抑制STAT5A基因的表达,并能抑制细胞生长、诱导细胞凋亡.     

黏附诱导卵巢癌细胞基质金属

目的 观察黏附纤黏连蛋白后肿瘤细胞基质金属蛋白酶（MMP）基因的表达,揭示细胞侵袭发生的机理。方法 纤黏连蛋白与A2780人卵巢癌细胞相互作用后,用反转录PCR观察MMP mRNA的表达;从HT1080细胞基因组DNA克隆MMP9启动子区基因,构建MMP－9－gGL2报告基因载体,瞬时转染A2780细胞,通过测定萤火虫酶活性,观察纤黏连蛋白对MMP9启动子活性的影响。结果 A2780细胞不表达MMP基因,,黏附后细胞内MMP－9mRNA含量明显增加,这一作用与黏附时间有关。克隆MMP－9基因启动子并转染细胞,黏附后转染细胞内MMP－9基因启动子活性明显增强。结论 细胞－细胞外基质黏附可刺激MMP基因转录活性,诱导MMP基因表达,进而促进细胞侵袭。     

RNA干扰CTSL表达抑制卵巢癌细胞的侵袭和转移

目的：构建组织蛋白酶L基因(cathepsin L, CTSL)RNAi的真核表达载体,探讨干扰CTSL基因表达对卵巢癌细胞侵袭和转移的影响。方法：设计并合成4对CTSL小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染卵巢癌A2780细胞,RT-PCR检测各转染细胞CTSL的表达,筛选沉默效果最好的siRNA序列。设计并合成CTSL-shRNA序列,与psilence4.1-CMV-neo载体连接,构建psilence4.1-CTSL表达载体。psilence4.1-CTSL转染A2780细胞,获得稳定转染克隆A2780-CTSL。RT-PCR和Western blotting验证CTSL基因干扰效果,MTT法和集落形成实验检测A2780细胞的增殖,流式细胞术检测A2780细胞周期,Transwell侵袭小室实验检测A2780细胞体外侵袭和迁移能力。结果：筛选出干扰效果最好的siRNA-CTSL-1202序列,并成功构建相应的CTSL-shRNA表达载体psilence4.1-CTSL。稳定转染psilence4.1-CTSL能沉默A2780细胞中CTSL的表达。沉默CTSL基因后可抑制A2780细胞的侵袭和转移,但不影响A2780细胞的增殖、细胞周期和黏附活性。结论：成功构建CTSL基因siRNA的真核表达载体,RNA干扰CTSL基因表达可抑制卵巢癌细胞的侵袭和转移。     

EZH2基因在人卵巢癌顺铂耐药株中的表达及其对细胞耐药性的影响

目的:检测果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)基因在人卵巢癌顺铂(cisplatin, DDP)耐药细胞株A2780/DDP及其亲本细胞株A2780中的表达差异,探讨以EZH2基因为靶向的RNA干扰能否有效逆转A2780/DDP细胞对DDP的耐药性.方法:采用实时荧光定量PCR(real-time fluorogenic quantitative PCR,RFQ-PCR)和Western印迹法检测EZH2 mRNA和蛋白在A2780/DDP及A2780细胞中的表达差异.人工构建4个靶向沉默EZH2基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)质粒表达载体,脂质体法瞬时转染至A2780/DDP细胞,RFQ-PCR检测EZH2基因的沉默水平并挑选沉默效果最佳的质粒载体,G418加压筛选得到转染稳定的细胞株.RFQ-PCR和Western印迹法检测稳定转染后A2780/DDP细胞中EZH2基因的表达,MTT法检测转染细胞对DDP的耐药性.结果:A2780/DDP细胞中EZH2 mRNA和蛋白的表达量分别是A2780细胞表达量的(3.50±1.06)和(2.10±0.29)倍,差异有统计学意义(P<0.01).稳定转染EZH2 shRNA后的A2780/DDP细胞,EZH2的mRNA及蛋白水平的表达量分别下降(83.66±5.65)%和(77.57±3.90)%(P<0.001),其对DDP的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)值下降(61.33±11.40)%,差异有统计学意义(P<0.05). 结论:EZH2基因在A2780/DDP细胞中的表达明显升高,沉默EZH2基因能有效逆转A2780/DDP细胞对DDP的耐药性.     

Silencing of Twist Expression by RNA Interference Suppresses Epithelial-mesenchymal Transition,Invasion, and Metastasis of Ovarian Cancer

Purpose: This study aimed to explore the role of the Twist gene in the epithelial-mesenchymal transition ofovarian cancer. Methods: An RNA interference plasmid expressing a small interfering RNA (siRNA)-targetingTwist (Twist siRNA vector) was designed, constructed, and transfected into the human ovarian cancer cell lineA2780. Transfection efficiency was assessed under a fluorescence microscope. Changes in the expression of TwistmRNA in A2780 after transfection with the pGenesil Twist shRNA plasmid were analyzed through RT-PCR.MTT assays and adhesion experiments were applied to determine changes in proliferation and adhesion abilityof A2870 after transfection with the Twist shRNA plasmid. Changes in the expression of the E-cadherin andN-cadherin proteins in A2780 after transfection with the Twist shRNA plasmid were analyzed using Westernblotting. Result: The restructuring plasmid pGenesil-Twist shRNA was constructed successfully. After 48 h ofculture, 80% of the cells expressed high-intensity GFP fluorescence and stability. The expression of Twist decreasedsignificantly after the transfection of the Twist shRNA plasmid (P<0.05). Proliferation of the transfected TwistshRNA cells showed no difference with that of the A2780-nontransfection or A2780-si-control groups (P>0.05) butthe adhesion ability of A2780 decreased dramatically (P<0.05). Expression of the E-cadherin protein increased,whereas that of the N-cadherin protein decreased compared with that in the A2780-nontransfection or A2780-si-control groups (P<0.05). Conclusion: Twist is essential for epithelial-mesenchymal transition, invasion, andmetastasis of ovarian cancer.     

CD147 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的针对CD147基因的不同部位,构建不同CD147 shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制CD147的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆.方法用DNA重组技术将针对人CD147基因的不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGE-1中,构建CD147 shRNA表达质粒载体pGE-1 CD147shRNA1、2、3.用阳离子脂质体介导转染人卵巢癌高转移细胞系HO-8910pm,经G418筛选后获得克隆进行鉴定.结果3个CD147 shRNA表达载体pGE-1CD147shRNA1、2、3经PCR、限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确.半定量RT-PCR、Western blotting均证实:转染细胞8910 pm/pGE-1 CD147shRNA,与亲本细胞相比,CD147的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降.结论成功构建了CD147 shRNA表达载体pGE-1 CD147shRNA,并筛选出特异而高效地阻断CD147表达的克隆.此实验结果为进一步研究CD147蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础,并对shRNA设计靶序列的选择有一定指导意义.     

构建COX2基因慢病毒载体对肺腺癌A549细胞增殖与凋亡的影响#br#

目的 构建环氧化酶2（COX2）基因慢病毒表达载体并观察其对非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响。方法 针对COX2基因的不同片段设计3对shRNA的寡核苷酸片段并克隆至慢病毒载体GV248中,构建并筛选最佳抑制效率的靶向COX2基因的慢病毒载体COX2 shRNA。选取对数生长期A549细胞进行慢病毒转染,其中靶向COX2基因的shRNA载体转染A549细胞为shRNA组,以空载体质粒转染作为阴性对照组（NC）及不转染质粒的A549细胞为空白对照组（CON）,采用实时荧光定量PCR和Western blotting测定COX2基因和蛋白的表达。分别采用MTT法和流式细胞仪检测干扰COX2表达对A549细胞增殖、凋亡能力的影响。结果 成功构建靶向COX2基因的慢病毒载体;稳定转染A549细胞后,COX2基因表达下降,其中以COX2 shRNA1干扰效率最为显著;shRNA组中shRNA1转染的A549细胞COX2 mRNA水平为0.17±0.06,低于NC组的081±011和CON组的109±0.07,差异有统计学意义（P＜0.05）。shRNA组细胞增殖活性低于NC组和CON组,shRNA组转染5 d的吸光值为0.976±0.016,低于NC组的1.557±0.015和CON组的1880±0034,差异有统计学意义（P＜0.05）。shRNA组细胞凋亡率为（6.28±0.31）％,高于NC组的（3.08±0.05）％和CON组的（3.01±0.31）％,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 成功构建靶向COX2基因的慢病毒表达载体,干扰COX2表达可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖并促进细胞凋亡。     

Midkine shRNA对胃癌SGC7901细胞增殖与凋亡的影响

目的:研究shRNA 干扰midkine对胃肿瘤细胞SGC7901生物学特性的影响.方法:构建midkine基因的特异性小RNA干扰质粒,采用脂质体2000转染SGC7901细胞,检测细胞的增殖和克隆形成能力以及细胞凋亡情况.结果:与对照组相比,转染重质粒后1-5天, SGC7901细胞增殖明显受到抑制(P＜0.01),细胞形成克隆数明显降低(P＜0.01),并且有明显的亚二倍体峰出现(P＜0.05).结论:针对midkine基因的特异性小RNA干扰质粒在体外能有效抑制人胃癌细胞SGC7901 midkine表达,细胞增殖及克隆形成能力减弱,细胞凋亡增加,为midkine 基因靶向治疗提供一定的实验依据.     

The relationship between the down-regulation of DNA-PKcs or Ku70 and the chemosensitization in human cervical carcinoma cell line HeLa

The aim of this study was to clarify the function of non-homologous end-joining (NHEJ) in tumorigenesis and chemoresistance, and to explore the potential of DNA-PK as a target of reversal of chemoresistance and enhancing the sensitivity of cells to chemotherapeutic agents. Plasmid vectors pSIREN-Ku70shRNA and pSIREN-DNA-PKcssh-RNA, which coded small interfering RNA of Ku70 and DNA-PKcs, were constructed and transfected into human cervical cancer cell line HeLa. The relationship between the down-regulation of Ku70 or DNA-PKcs and tumor cell proliferation and the sensitivity of cells to chemotherapeutic agents were analyzed. Down-regulation of Ku70 and DNA-PKcs expression inhibited cell proliferation, and increased cell apoptosis in DDP-treated HeLa cells. DNA-PK might play an important role in drug resistance, and inhibition of the DNA-PK expression suppressed the growth of tumor cells and enhanced the sensitivity of cells to chemotherapeutic agents.     

Midkine shRNA对胃癌SGC7901细胞增殖与凋亡的影响

目的：研究shRNA干扰midkine对胃肿瘤细胞SGC7901生物学特性的影响。方法：构建midkine基因的特异性小RNA干扰质粒,采用脂质体2000转染SGC7901细胞,检测细胞的增殖和克隆形成能力以及细胞凋亡情况。结果：与对照组相比,转染重质粒后1—5天,SGC7901细胞增殖明显受到抑制（P〈0．01）,细胞形成克隆数明显降低（P〈0．01）,并且有明显的亚二倍体峰出现（P〈0．05）。结论：针对midkine基因的特异性小RNA干扰质粒在体外能有效抑制人胃癌细胞SGC7901 midkine表达,细胞增殖及克隆形成能力减弱,细胞凋亡增加,为midkine基因靶向治疗提供一定的实验依据。     

短发卡状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

目的：构建AKT2基因特异性短发卡状RNA（shRNA）真核表达载体，观察RNA干扰（RNAi）技术，对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞中AKT2蛋白激酶表达的抑制作用，并探讨其促进细胞凋亡的机制。方法：运用基因工程技术，设计合成针对AKT2mRNA的特异性shRNA，构建真核表达载体pAKT2-shRNA。将pAKT2-shRNA经脂质体（Lipofectamine^TM 2000）包裹转染人卵巢癌A2780和SKOV3细胞，荧光显微镜观察细胞内DsRed红色荧光蛋白的表达，计算转染效率，半定量RT—PCR（Semi-quantitative RT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）检测AKT2的表达及干扰效率，流式细胞学检测法（FACS）检测细胞凋亡率，比较抑制AKT2基因前后卵巢癌细胞抵抗凋亡能力。结果：成功构建了PAKT2-ShRNA载体。A2780和SKOV3细胞转染pAKT2-shRNA后，荧光显微镜下观察转染效率约40％；Semi-quantitative RT-PCR和Western blot检测结果示，转染后AKT2 mRNA和蛋白表达均显著降低。FACS检测结果显示，转染pAKT2-shRNA后，紫杉醇25nmol／L处理细胞12h，与空白对照组和阴性对照组相比，细胞凋亡率显著增加，P〈0．05。结论：构建的pAKT2-shRNA真核表达载体能有效抑制AKT2基因表达；运用RNAi技术，降低卵巢癌细胞中AKT2基因表达水平，能增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡。     

靶向EGFR基因的shRNA抑制胰腺癌PANC-1细胞增殖的研究

目的探讨EGFR基因对胰腺癌PANC-1细胞的增殖抑制作用。方法构建针对EGFR序列特异性shRNA的表达载体,用脂质体转染胰腺癌PANC-1细胞。采用RT-PCR、Western blot检测EGFR mRNA和蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;克隆形成实验检测细胞增殖。结果靶向EGFR的序列特异性shRNA明显抑制EGFR mRNA和蛋白的表达,EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为72.1％和67.6％;G1期细胞增多、S期细胞减少(P<0.05);细胞凋亡增加(P<0.05);克隆形成减少(P<0.05)。结论靶向EGFR的序列特异性shRNA能明显抑制胰腺癌细胞增殖、促进凋亡。