SLPI基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒。将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体pcDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达。结果核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白。结论成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒。     

Construction and identification of eukaryotic expression plasmids containing SLPI gene

目的 构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒.方法 以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒.将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体peDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达.结果 核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白.结论 成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒.     

抑制性消减杂交技术筛选干扰素α转染HepG2细胞中上调的表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选干扰素α(IFN-α) 真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达上调的基因。方法:首先构建IFN-α真核表达载体pcDNA3．1(-) -IFN-α,并转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增鉴定,进行测序及同源性分析。结果:构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α真核表达质粒,并成功构建了该质粒转染HepG2细胞后差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到200个白色克隆,随机挑取70个进行菌落PCR分析,结果显示均含有插入片段,将含有200-1000 bp插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知基因序列和1个染色体序列。结论:应用SSH技术成功构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞中差异上调表达基因的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据。     

大鼠脑源性神经营养因子基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的表达序列,构建大鼠BDNF基因真核表达载体.方法 以RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增BDNF cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-BN,以限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为783bp特异片段,重组质粒酶切后产生783bp和5.2 kb的片段,DNA测序证实783bp片段的碱基序列与大鼠BDNF基因序列完全一致.结论 成功克隆大鼠BDNF基因表达序列并构建了BDNF基因真核表达栽体pcDNA3-BN.     

人nanog-delta48基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:构建pcDNA5/FRT-nanog-delta48真核表达载体,检测其在肝癌SMMC-7721细胞中的表达。方法:通过RT-PCR的方法克隆nanog基因的选择性剪接变异体nanog-delta48全长编码序列,连接入pMD18-T载体,经鉴定正确后亚克隆入pcDNA5/FRT,构建pcDNA5/FRT-nanog-delta48真核表达载体,测序无误后经脂质体介导转染到SMMC-7721细胞中,通过RT-PCR初步鉴定其在SMMC-7721细胞中的表达,并通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染前后的细胞增殖活力。结果:成功克隆nanog-delta48基因全长编码区,测序证明pcDNA5/FRT-nanog-delta48重组真核表达载体构建成功,使其在SMMC-7721细胞中过表达,MTT检测nanog-delta48转染入SMMC-7721细胞后,增殖能力增强。结论:剪接变异体nanog-delta48基因可能具有与nanog基因类似的活性。     

Osx cDNA反义表达载体的构建

目的：构建反义Osterix(Osx)cDNA表达载体。方法：快速提取人全血基因组DNA。以DNA为模板，经过两步PCR扩增获得Osx编码序列，与pGEM-T Easy连接获得重组克隆载体。将Osx编码序列反向克隆人真核表达载体pcDNA3，进行序列测定。结果：经序列分析证实，Osx扩增序列完全正确，且反向插入到pcDNA3载体。结论：成功构建了Osx反义表达载体，为研究Osx对成骨细胞分化的影响奠定了基础。     

真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ的构建和鉴定

目的构建恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基macacam ulattac horionicg onadotrophin β subunit,rmCGβ）基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,并了解该质粒能否在真核细胞中表达。方法通过PCR扩增rmCGβ的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcDNA3．1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16／pcDNA3．1（＋）-rmCGβ细胞株中rmCGβ全段基因cDNA。结果经4轮PCR,成功扩增出rmCGβ的cDNA全长基因,酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,通过RT-PCR方法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达。建立了稳定的细胞株B16／pcDNA3．1（＋）-rmCGβ。结论成功克隆和构建了rmCGβ的真核表达质粒载体pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,为进一步研究rmCGβ的新功能和免疫治疗奠定了基础。     

1b型HCV-NS3真核表达载体的构建及对HepG2细胞凋亡的影响

目的构建1b型HCV-NS3基因真核表达载体,转染HepG2细胞并做表达谱基因芯片,筛选其影响肝癌细胞凋亡的差异表达基因,为进一步研究HCVNS3致病的分子生物学机制准备了条件。方法采集1b型HCV感染患者血清,提取HCV RNA,PCR获得HCV-NS3编码片段,经T-A克隆,构建pcDNA3.1-myc-His(-)-NS3,用pcDNA3.1(-)及上述重组载体的转染级质粒瞬时转染HepG2细胞,用蛋白免疫印迹检测,同时提取细胞总RNA,进行人类全基因组表达谱测定。结果从1b型HCV感染患者血清RNA中扩增出的1893bp片段大小正确,双酶切凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pcDNA3.1-myc-His(-)-NS3内,经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列,转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹证实;芯片结果显示凋亡相关基因2个上调,3个下调。结论成功地构建了1b型HCV NS3基因的真核表达载体pcDNA3.1-myc-His(-)-NS3;HCV-NS3可能是通过对FAIM2、FADD、TNFRSF4、FASLG和TNF基因的调控影响细胞凋亡。     

绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的人脂联素（Adiponectin）真核表达质粒。方法：用本实验室已构建好的人脂联素克隆载体pMD18—T／Adiponeetin为模板，结合已设计好的特异性引物。采用PCR方法克隆出Adiponectin目的片段，将该目的片段再连至真核表达载体pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO上，转化入TOP10感受态细胞中，通过筛选得到融合有绿色荧光蛋白的重组质粒pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO—Adiponectin。结果：PCR获得长度为736bp的目的片段，经pcDNA3．1／CT—GFP-TOPO真核表达载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入的目的片段与genebank检索的人脂联素cDNA序列（Accession NM-004797）100％配。结论：绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体构建成功。     

NTE酯酶活力域真核表达载体的构建及其表达

目的构建人神经病变靶标酯酶（NTE）酯酶活力域（NESP）真核表达载体，并在细胞中表达。方法利用含有特定酶切位点的引物，通过PCR扩增出其酯酶活力域，经T载体克隆测序正确后，双酶切回收cDNA片段定向插入到pcDNA3．1（＋）中，通过酶切鉴定其真核表达载体的构建。然后将其转染到真核细胞中，通过NTE活力测定，检测其表达效果。结果经PCR获得了NTE的1．6kb酯酶活力域的cDNA片段，T载体克隆后测序证实完全正确，然后克隆到真核表达载体中获得了NTE酯酶活力域真核表达载体pcDNA—NEST。瞬时转染到COS7和SH-SY5Y细胞中，NTE的活力与对照细胞相比显著提高。结论成功构建了NEST真核表达载体，并在哺乳动物细胞中表达。     

Bispecific radioligands targeting prostate‐specific membrane antigen and gastrin‐releasing peptide receptors on the surface of prostate cancer cells

Metastases of prostate cancer usually show highly heterogeneous or partly lost prostate‐specific membrane antigen (PSMA) expression. In order to image and treat both PSMA positive and negative tissues, the extension of PSMA tracer specificity to other receptors, also highly expressed on the surface of prostate cancer cells, has been suggested. Prostate cancer cells usually express both PSMA and gastrin‐releasing peptide (GRP) receptors; thus, bispecific heterodimeric molecules, addressing both targets at the same time, may significantly improve prostate cancer imaging and therapy. This article summarizes preclinical data regarding low‐molecular weight molecules targeting PSMA and GRP receptors.     

小鼠p27~(kip1)真核表达载体的构建及其对单个核细胞周期的影响

目的构建小鼠p27kip1真核表达载体,探讨其对单个核细胞生长情况和细胞周期的影响,为进一步研究p27kip1在疾病防治中的作用奠定基础。方法将小鼠p27kip1基因克隆至pcDNA3.0真核表达载体上,并经脂质体介导转染至小鼠单个核细胞中,应用MTT法和流式细胞仪分析转染细胞生长情况和细胞周期。结果经酶切分析和测序鉴定,成功构建了小鼠pcDNA3.0/p27kip1重组质粒;经pcDNA3.0/p27kip1转染的单个核细胞中p27蛋白表达增多,其生长增殖不仅受到明显抑制,而且处于G1/G0期的细胞明显增加,处于S期的细胞明显减少。结论构建的pcDNA3.0/p27kip1真核表达载体能够在单个核细胞中表达,且高表达的pcD-NA3.0/p27kip1可以通过抑制细胞周期的方式抑制单个核细胞的生长。     

人乳腺癌转移抑制基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建乳腺癌转移抑制基因（BRMS1）的真核表达载体pcDNA3．1（-）B／myc-BRMSI,为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础。方法常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,Trizd法提取细胞株总RNA;设计一对特异性引物,经过逆转录反应获得BIIMS1 cDNA的CDS序列,连接到质粒pcDNA3．1／mye—His（-）B上,构建BRMS1的真核表达载体peDNA3．1（-）B／myc．BRMS1,行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293,行Westernblot验证其是否表达。结果重组质粒pcDNA3．1（-）B／myc-BRMS1经双酶切及基因测序分析,验证了克隆的人BRMS1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS1基因的cDNA序列吻合,重组体peDNA3．1（-）B／myc—BRMS1中插入的目的基因BRMS1是正向、单倍插入。结论成功构建了BRMS1真核表达载体pcDNA3．1（-）B／myc—BRMS1,为深入研究BRMS1基因功能和BRMS1基因治疗奠定了物质基础。     

人乳腺癌转移抑制基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建乳腺癌转移抑制基因(BRMS 1)的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础.方法 常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,Trizol法提取细胞株总RNA;设计一对特异性引物,经过逆转录反应获得BRMS1 cDNA的CDS序列,连接到质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B上,构建BRMS 1的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293,行Western blot验证其是否表达.结果 重组质粒pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1经双酶切及基因测序分析,验证了克隆的人BRMS 1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS 1基因的cDNA序列吻合,重组体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1中插入的目的 基因BRMS 1是正向、单倍插入.结论 成功构建了BRMS 1真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1,为深入研究BRMS 1基因功能和BRMS 1基因治疗奠定了物质基础.     

稳定高效表达人血栓调节蛋白的CHO细胞株的建立

目的:构建稳定高效表达人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的CHO细胞株,以便于大量生产纯化hTM蛋白。方法:利用脂质体li-pofectamine 2000将包含hTM基因全长序列的重组表达质粒pThr402转染CHO细胞。转染后用G418的选择性培养液筛选、挑取抗性克隆。采用流式细胞术和Western blotting检测hTM在CHO细胞膜表面的表达情况,筛选建立稳定高效表达hTM的CHO细胞株并对其稳定性进行观察。结果:重组表达质粒pThr402转染CHO细胞后,流式细胞术证实hTM稳定高效表达于随机挑选的5个抗性克隆细胞株的细胞膜表面,但表达量有差异。Western blotting分析检测显示hTM表达量较高的CHO-TM1、CHO-TM4与CHO-TM5细胞株的细胞裂解液出现了与预期值相符的约105000的特异性条带。CHO-TM5已经经过冻存复苏前后各20次传代,且无论有无G418选择压力存在,hTM表达水平无明显差异。结论:成功构建了稳定高效表达hTM的CHO细胞株,可望获得大量蛋白,为进一步研究hTM的生物学功能以及制备和筛选抗hTM的单抗开辟新的途径。     

The utility of radiolabeled PSMA ligands for tumor imaging

Prostate-specific membrane antigen (PSMA) is a glycosylated type-II transmembrane protein expressed in prostatic tissue and significantly overexpressed in several prostate cancer cells. Despite its name, PSMA has also been reported to be overexpressed in endothelial cells of benign and malignant non-prostate disease. So its clinical use was extended to detection, staging, and therapy of various tumor types. Recently small molecules targeting PSMA have been developed as imaging probes for diagnosis of several malignancies. Preliminary studies are emerging improved diagnostic sensitivity and specificity of PSMA imaging, leading to a change in patient management. In this review, we evaluated the first preclinical and clinical studies on PSMA ligands resulting future perspectives radiolabeled PSMA in staging and molecular characterization, based on histopathologic examinations of PSMA expression.     

人IL-24基因在CHO细胞中的表达及其抗肿瘤效应

目的构建人IL-24基因真核表达载体,在CHO细胞中进行稳定表达,并检测重组表达蛋白rhIL-24的抗肿瘤活性。方法将测序验证的人IL-24基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3,构建重组真核表达载体pcDNA3-hIL-24,转染CHO细胞进行稳定表达,经RT-PCR鉴定后用MTT法、Ho-echst染色和流式细胞术检测CHO细胞表达的rhIL-24诱导A549人肺腺癌细胞凋亡的抗肿瘤效应,用ELISA检测其刺激免疫细胞分泌IL-6和IFN-γ的功能。结果经双酶切和PCR鉴定,重组真核表达载体构建正确,人IL-24在CHO细胞中获得稳定表达,且所表达的人IL-24具有较强的诱导A549人肺腺癌细胞凋亡及上调免疫细胞表达IL-6和IFN-γ的免疫刺激活性。结论人IL-24基因的稳定表达和抗肿瘤效应的实验研究,为进一步研究人IL-24抗肿瘤的分子机制及潜在的应用奠定了基础。     

刀额新对虾精氨酸激酶基因的克隆与真核表达

目的克隆刀额新对虾精氨酸激酶的基因并进行真核表达。方法提取刀额新对虾总RNA,经逆转录获得精氨酸激酶的cDNA,插入质粒pPIC9K构建重组真核表达质粒,转化毕赤酵母进行诱导表达,用SDS-PAGE和斑点免疫分析鉴定重组表达产物。结果逆转录获得的精氨酸激酶cDNA全长1071bp,DNA序列分析结果与GenBank收录的序列(EU497674)比较,同源性为99.5%;重组表达质粒转化酵母的表达产物经SDS-PAGE分析,其相对分子质量约40kD;表达产物与虾过敏者血清呈较强反应性。结论克隆得到刀额新对虾的精氨酸激酶基因并获得其重组真核表达产物,为进一步研制虾类食物过敏症的相关检测试剂提供了试验依据。     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6的构建和鉴定

目的构建含人/鼠嵌合粘附分子CD44拼接变异体6(chimeric human and mouse CD44 splice variant 6,h/mCD44v6)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,并进行表达。方法通过PCR扩增h/mCD44v6的全基因cDNA,将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcD-NA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcD-NA3.1(+)-h/mCD44v6,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16/pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6细胞株中h/mCD44v6全段基因cDNA。结果经4轮PCR,成功扩增出h/mCD44v6的cD-NA全长基因,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,通过RT-PCR方法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达;建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6。结论成功克隆和构建了h/mCD44v6的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,为进一步研究h/mCD44v6的新功能和免疫治疗奠定了基础。     

pcDNA3.1/hTSHR_(1043～1354 bp)重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp及在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达hTSHR膜外区氨基酸314～418蛋白分子。方法提取人正常甲状腺组织总RNA,反转录后进行聚合酶链反应(PCR),将纯化的扩增产物hTSHR1043～1354bp与表达载体pcDNA3.1连接后转化TOP10E.coli感受态菌。经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定插入序列和方向正确的重组质粒转染CHO细胞,并用Westernblot方法鉴定表达的蛋白。结果PCR扩增得到hTSHR膜外区C端312bp的基因片段hTSHR1043～1354bp。该片段与表达载体pcDNA3.1的连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR1043～1354bp片段插入序列和方向正确。重组质粒转染的CHO细胞裂解液经Westernblot可以检测出15900的蛋白条带,与预期的蛋白相对分子质量相符。结论成功构建了重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp,其转染CHO细胞后表达159000的目的蛋白(hTSHR氨基酸314～418蛋白片段)。