传染病总论

核酶抗病毒和抗肿瘤作用的研究进展(综述)——陈泳宏等(江苏南京军医学院组织学与胚胎学教研室210099)；《南京军医学院学报》，2003，25(4)：265-267[核酶是一类具有酶活性的tLNA分子，可序列特异性定点地切割靶RNA，从而在分子水平实现对失控基因或有害基因表达的有效阻断。文章就近几年来核酶在抗病毒、抗肿瘤治疗中的应用进行简要介绍。     

核酶在肺癌基因治疗中的应用

核酶是一类具有酶活性的RNA分子 ,可序列特异性地切割靶mRNA ,从而有效抑制目的基因表达 ,且可重复使用 ,催化效率高 ,在抑制肺癌的发生、转移和多药耐药等方面具有广阔的应用前景     

特异性脱氧核酶对丙型肝炎病毒的体外消化作用

目的研究特异性脱氧核酶对丙型肝炎病毒（HCV）的体外消化作用。方法设计3个分别作用于HCV RNA 5＇非编码区（5＇ NCR）上157、168、173位点的脱氧核酶（DRz），分别命名为DRz1，DRz2,DRz3，均以5＇GGCTAGCTACAACGA-3’为脱氧核酶的催化活性中心，用内切酶XbaⅠ将含有HCV病毒序列的质粒pCMV/T7 NCRC,△Luc消化成线性，以此为模板体外转录出用α-^32PIUTP进行标记的靶HCV RNA。在37℃,PH7.5，Mg^2 10mmol/L等条件下，将HCV RNA（10nmol/L）与3个脱氧核酶（1μmol/L）分别混合进行切割反应，并进一步比较不同Mg^2浓度下DRz3的切割反应效率，反应产物在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并行放射自显影，应用凝胶成像分析仪评价脱氧核酶的切割效率。结果在设定反应条件下，3个脱氧核酶对HCV病毒均有切割活性，随着Mg^2浓度的增加，DRz3的切割活性增强，结论特异性脱氧核酶可有效切割HCV RNA 5＇NCR的RNA，且切割效率与Mg^2浓度呈正相关。     

锤头状核酶的结构及其对病毒基因表达的抑制

RNA催化的切割反应自 1981年 〔1〕起陆续有人报告。后来将此类具有催化能力的核糖核酸称为核酶 (ribozyme) ,并先后发现了第一型内含子 ,第二型内含子 ,RNase P,发卡式核酶 (HP) ,锤头状核酶 (HH) ,D型肝炎核酶 (斧头状核酶 )等种类。　　锤头状核酶的结构模型是 1987年 Symons等 〔2〕在研究、比较了多种植物病原体 RNA自催化切割反应活性区域的核苷酸序列后提出的。Haseloff等 〔3〕在此基础上合成了能有效切割氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)转录本的锤头状核酶 ,实现了核酶的人工合成。这为将核酶技术用于抑制和阻断有害基因的表达打…     

HBV特异性核酶与HDV重组体的体外转录及切割活性研究

目的利用基因重组技术,用核酶基因置换HDV部分基因,分别用HBV特异性核酶(rRZ)和核酶-HDV重组体(rHDVRZA、rHDVRZB和rHDVRZC)研究体外转录与剪切HBV的活性。方法 将含有83lbp的HBV C基因片段的质粒pTA-HBV用BamHI消化成线性后,体外转录获取5’端32P标记靶HBV C RNA。将获得的3个核酶-HBV重组体rHDVRZA、rHDVRZB和rHDVRZC克隆于pGEM-T载体T7启动子下游进行非标记的大量转录。分别将rRZ、rHDVRZA、rHDVRZB和rHDVRZC与卫32P-HBV C RNA按一定比例和条件保温切割。结果 体外实验证明rRZ、rHDVRZA、rHDVRZB和rHDVRZC在37℃具有酶切活性。提示所设计的核酶-HDV重组体rHDVRZA和rHDVRZB中核酶结构正确。结论在HDV基因组不同位置插入核酶,能够维持酶正确结构的核酶-HDV具有体外特异性切割HBV的活性。     

丁型肝炎病毒核酶结构改建及其对丙型肝炎病毒RNA的剪切活性

目的 观察经过结构改建的丁型肝炎病毒核酶（HDV核酶）对丙型肝炎病毒（HCV）基因组RNA是否存在剪切作用。方法 对HDV基因组核酶的茎IV区和底物结合区进行改建,获得3种针对HCV RNA的HDV核梅RzCI、RzC2和RzC3。体外转录制备含HCV RNA 5′－非编码区（5′-noncoding region,5′-NCR)及部分C区的底物RNA（HCV RNA5′-NCR-C）,进行5′端放射性标记。在一定的pH、温度、Mg^2 浓度和有或无去离子甲酰胺存在等条件下,将核酶和底物按摩尔比100：1混合,反应2h后聚丙烯酰胺凝电泳,放射自显影,推算剪切百分率。结果 RzCI和RzCI2可剪切HCV RNA5′-NCR-C,在适宜浓度的去离子甲酰胺存在时剪切效率较高,RzC3对底物几乎无剪切活性。结果 设计得当的HDV基因组核酶可以剪切异源性RNA分子HCV RNA。     

核酶抗肝炎病毒研究现状

核酶（ribozyme，nz）是具有酶促活性的RNA分子，它所催化的反应主要见于核酸代谢，某些核酶还具有转肽酶和氨基酸酯酶活性。至今已研究了核酶抗HAV、HBV、HCV、HDV的作用，并发现HDVRNA自身具有核酶活性。目前设计的核酶多为锤头状结构；少部分是采用发夹状核酶（hairpinriboz     

抗血小板衍生生长因子受体β亚单位核酶的体外制备与活性鉴定

目的 研究针对血小板衍生生长因子（PDGF）受体β亚单位基因的核酶的制备与体外切割活性鉴定。方法 将大鼠PDGF受体β亚单位基因的PCR片段克隆于T载体T7启动子下游,^32P标记的体外转录物作为靶RNA;设计并合成针对大鼠PDGF受体β亚单位胞外区的核酶,将核酶基因克隆于自我切割核酶载体P1．5的5′－cis核酶和3′-cis核酶之间,并进行^32P标记的转录。核酶与靶RNA按一定比例和条件进行切割反应电泳,放射自显影。结果 核酶制备正确,在最适条件下具有切割活性。其Km=13.20nM,Kcat=0.28min^-1。最高切割效率达78．3％。结论 体外制备的核酶具有良好的特异催化切割活性。     

HDV核酶对人肝癌细胞端粒酶组分阻断作用的研究

目的:观察HDV核酶对人肝癌细胞端粒酶RNA组分的阻断作用。材料与方法:人工设计和合成了HDV核酶的序列,构建体外转录载体PGEM.RZ。提取人肝癌7402细胞端粒酶cDNA序列并构建体外转录质粒PGEM hTR。将上述质粒转录,测定了不同条件下HDV核酶对端粒酶的切割效力及其动力常数Kcat,Km及Kcat/Km的值。结果:核酶对底物的最大剪切效率为70.4％。在同一种离子存在的条件下,Km随温度而升高,Kcat则始终在0.71～1.3/min之间波动。结论:HDV核酶(g.RZ57)对人肝癌细胞端粒酶 RNA组分具有体外切割效力,其可以用来切割端粒酶等异源性RNA分子,可作为潜在的肿瘤治疗抑制剂。     

丁型肝炎病毒核酶在细胞内抑制丙型肝炎病毒RNA活性的研究

目的 探讨丁型肝炎病毒(HDV)核酶在细胞内抑制丙型肝炎病毒(HCV)RNA的可能性。方法 针对HCV-5′NCR-C RNA的不同靶位构建了pC1-RzC1(107～113nt)、pC1-RzC2(268～274nt)、pC1-RzC3(345～351nt)3个HDV核酶重组真核表达载体,采用脂质体介导将它们转染至HCV阳性胎肝细胞中,通过荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞和培养上清液中的HCV RNA,初步探讨HDV核酶对HCV RNA的抑制活性。结果 (1)重组表达载体通过PCR、酶切和碱基序列测定证实了3组HDV核酶定向插入到真核表达载体。(2)免疫组织化学观察到HCV阳性胎肝细胞中HCV NS3、NS5抗原及逆转录-PCR法检测胎肝细胞及上清液中的HCV RNA正、负链,同时利用Light Cycler荧光PCR定量检测HCV RNA的含量,证明HCV感染胎肝细胞成功。(3)HCV阳性胎肝细胞中HDV核酶对全长HCV RNA的抑制活性,当剂量为0.5μmol/L时,pC1-RzC1、pC1-RzC2、pC1-RzC3抑制活性分别为53.2%、50.5%、10.6%(t=5.25,P<0.01)。pC1-RzC1连续1周作用于HCV阳性的胎肝细胞,结果显示第2～7天的抑制活性分别是60.7%、64.2%、68.4%、71.9%、78.8%、83.1%(t=15.34,P<0.01)。结论 pC1-RzC1、pC1-RzC2在HCV阳性胎肝细胞中对HCV RNA的抑制活性明显高于pC1-RzC3。     

肝内胆管癌hTR反义RNA及锤头状核酶基因真核表达载体的构建

用反转录PCR法 ,调取肝内胆管癌细胞内的端粒酶RNA(hTR)基因 ,并针对其序列设计反义RNA封闭基因及锤头状核酶切割基因序列 ,将其构建入真核表达载体pTriEx 4内。根据hTRcDNA序列设计引物 ,经RT PCR法从体外培养的肝内胆管癌细胞内调取hTR模板区基因 ,根据其测序结果 ,合成反义RNA基因及核酶基因 ,与经相应酶切的真核表达载体连接 ,酶切鉴定重组体的正确性。经RT PCR从细胞内调出 68bp序列 ,与hTRcDNA比较 ,与模板区域碱基序列一致 ,反义RNA与核酶基因重组子经酶切鉴定序列正确。肝内胆管癌细胞内端粒酶的活性明显增高 ,RT PCR法可调出其hTR基因有效片段 ;成功构建了针对hTR模板区的反义RNA基因和核酶基因的真核表达载体     

丙型肝炎病毒特异性锤头样核酶体外转录及切割活性的初步研究

目的　研究针对丙型肝炎病毒 (HCV)特异性锤头样核酶 (Rz)的体外转录及切割活性。方法　设计 3种锤头样核酶 :Rz1、Rz2 分别作用于HCVRNA 5′ 非编码区 (5′ NCR)上核酸序列 136～16 0、313～ 337,Rz3 作用于核心 (C)区上核酸序列 373～ 388。为区别于反义核酸的封闭作用 ,设计在Rz3 的催化环上存在点变异 (G取代A)的变异核酶Rzm用作对照。体外转录出靶HCVRNA和核酶RNA ,在一定条件下 ,将3 2 P标记的靶HCVRNA与核酶RNA按不同浓度比例进行切割反应 ,电泳后放射自显影 ,通过同位素扫描成像分析仪分析来评价核酶切割效率。结果　除Rzm外 ,在生理温度下 ,3种核酶均有活性 ,并随核酶浓度增加而提高 ;核酶切割靶位点距HCV起始密码子近切割效率高。结论　设计并观察到体外具有HCV特异性切割活性的锤头样核酶 ,为进行核酶的细胞内应用研究奠定基础     

LNAzyme设计及其体外特异性抑制丙型肝炎病毒C基因的表达

目的:探讨针对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)C基因的锁核酸核酶对病毒RNA复制与表达的特异性抑制作用.方法:设计合成能切割HCV C基因位点的DNAzyme、硫代DNAzyme和LNAzyme.实验设对照组和实验组.对照组包括空白对照组、脂质体对照组和脂质体-无关LNAzyme对照组.实验组包括脂质体-DNAzyme、脂质体-硫代DNAzyme组和脂质体-LNAzyme组.以阳离子脂质体介导转染hepG2.9706细胞.采用荧光定量PCR和化学发光技术分别监测24、48、96 h细胞培养上清液中HCV RNA含量及荧光素酶基因表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法监测细胞代谢.结果:加入药物后,脱氧核酶、硫代脱氧核酶及锁核酸核酶组对HCV RNA复制和荧光素酶基因表达的抑制作用均较对照组强(P<0.01),其中,锁核酸核酶的抑制作用均较脱氧核酶及硫代脱氧核酶明显(P<0.05),平均抑制率分别达47.55%和52.44%,且随用药时间延长,抑制率呈增高趋势,96 h后,HCV RNA复制和荧光蛋白表达的下降率均较用药前明显(P<0.01),其中,锁核酸核酶的抑制作用均较脱氧核酶及硫代脱氧核酶明显(P<0.05),平均下降率分别达79.40%和80.05%.而LNAzyme对细胞活性基本无影响.结论:LNAzyme能特异性抑制HCV C基因的复制与表达,且优于硫代修饰的DNAzyme.     

HDV核酶对人肝癌细胞端粒酶组分阻断作用的研究

目的：观察HDV核酶对人肝癌细胞端粒酶RNA组分的阻断作用。材料与方法：人工设计和合成了HDV核酶的序列，构建体外转录载体PGEM．RZ。提取人肝癌7402细胞端粒酶cDNA序列并构建体外转录质粒PGEM hTR.将上述质粒转录，测定了不同条件下HDV核酶对端粒酶的切割效力及其动和常数Kcat,Km及Kcat/Km的值。结果：核酶对该物的最大剪切效率为70．4％。在同一种离子存在的条件下，Km随温度而升高，Kcat则始终在0．71－1．3/min之间波动。结论：HDV核酶（g.RZ57)对人肝癌细胞端粒酶RNA组分具有体外切割效力，其可以用来切割端粒酶等异源性RNA分子，可作为潜在的肿瘤治疗抑制剂。     

核酶作为基因治疗的应用与前景

生物体内除了蛋白酶外，还有一种具有催化功能的核糖核酸分子——核酶。核酶的发现最早可起源于对四膜虫及一些植物病毒、类病毒等的观察。它们的核酸分子都具有自我剪接的功能。这些自我剪接反应都是可逆的，具有酶催化反应的性质。以后根据对这些天然核酶结构的研究，人工合成的核酶可以序列特异性地切割靶RNA，抑制基因表达，特别是抑制某些有害基因的表达。     

特异性α-胎甲蛋白RNA替代法可定向阻断肝癌细胞

尽管HCC是世界上常见的恶性肿瘤之一，现仍期待着发现更特异性和可控制的治疗方法。在本项研究中，作者描述了一种新的HCC疗法，该疗法基于分子间拼接核酶介导的HCC相关特异性RNA的替代。作者开发了一种可靶定和替代人类α-胎甲蛋白RNA（在HCC中高度表达）的特异性核酶，     

内皮素-1 10-23脱氧核酶对离体灌流大鼠心脏急性缺血性心律失常的影响

目的 :应用内皮素 （endothelin ,ET） 110 2 3脱氧核酶抑制内源性ET 1表达 ,探讨内源性ET 1在急性缺血性心律失常发生中的作用。方法 :设计并合成ET 110 2 3脱氧核酶 ,作体外切割筛选 ;SD大鼠静脉注射ET 110 2 3脱氧核酶 ,观察心肌对 5’标记荧光素FAM的ET 110 2 3脱氧核酶的摄取和对其后离体灌流大鼠心脏左冠状动脉前降支结扎致急性缺血性心律失常的影响。结果 :设计合成的ET 110 2 3脱氧核酶在体外高效切割ET 1RNA底物 ;荧光标记ET 110 2 3脱氧核酶静脉注射 4h后 ,大鼠心肌组织内荧光广泛分布 ;静脉注射ET 110 2 3脱氧核酶4h后 ,左冠状动脉前降支结扎引起的急性缺血性心律失常显著减轻 ,并呈剂量依赖性 ,而对照序列无此效应。结论 :本实验设计的ET 110 2 3脱氧核酶能有效切割ET 1RNA ,减轻急性缺血性心律失常的发生 ,证明内源性ET 1在急性缺血性心律失常的发生中起重要作用。     

U1小核核糖核酸嵌合体核酶细胞内抑制丙型肝炎病毒表达的研究

目的观察以U1小核核糖核酸为靶向基因构建的嵌合体核酶在细胞内抑制丙型肝炎病毒（HCV）表达的作用。方法通过聚合酶链反应及克隆连接反应，将针对HCV核心区的特异性核酶序列代替了U1小核RNA的部分区域，构建出嵌合体核酶的真核表达载体；将其与带有荧光素酶报告基因的靶基因共转染Huh7细胞系，通过Western blot及发光检测仪来判定抑制效率并与相同序列核酶的效率进行比较。结果U1-嵌合体核酶构建成功；共转染结果显示核酶及嵌合体核酶对HCV表达均有抑制作用，但以嵌合体核酶的效率为高。结论以U1小核核糖核酸作为核酶载体可以增加核酶在细胞内的切割活性。     

丁型肝炎病毒核酶对丙型肝炎病毒 RNA的抑制活性

核酶 (ｒｉｂｏｚｙｍｅ)是一类具有催化活性的ＲＮＡ分子 ,可通过碱基配对特异地与相应的ＲＮＡ底物结合 ,并在特定的位点切割底物ＲＮＡ分子[1] 。是基因功能阻断剂 ,被称为“分子剪刀”。美国科学家Ｃｅｃｈ和Ａｌｔｍａｎ分别于 1982年先后发现这种只有催化活性但不含蛋白质的核糖体ＲＮＡ前体和ＲＮａｓｅ的成分[2 ] ,后统一命名为“核酶”。核酶作为基因治疗新药具有如下优点 :1.一个核酶分子可切割多个病毒核酸分子 ;2 .其作用是切断 ,不是单纯抑制 ,停药后复发的可能性小 ;3 .与底物通过碱基配对结合 ,因而有较好的特异性 ;4.针对多…     

核酶在2.2.15细胞内抗乙肝病毒作用

目的:研究针对乙型肝炎病毒前基因组RNA双靶位自剪切核酶在细胞内对HBV复制和表达的抑制作用,进一步探讨如何提高核酶在细胞内的催化效率。方法:人工合成核酶基因片段,利用分子克隆技术,定向克隆到pGEM3ZF(-)质粒的EcoR I、HindⅢ位点中,构建出核酶的自剪切转录载体,再切下核酶基因片段,克隆到pBBS212质粒上构建核酶的真核表达载体。通过脂质体介导的基因转染方法将其导入2.2.15细胞中,观察核酶在细胞内对HBsAg、HBeAg表达的抑制作用。结果:核酶对HBsAg、HBeAg表达的抑制率分别达55％、28％。结论:研究结果表明该双靶位核酶可以在2.2.15细胞内对HBV的复制和表达有明显的抑制作用。